Методическая статья

Инструменты для изучения роли архитектурного белка HMGB1 в обработке Helix искажающие, Сайт-специфическая ДНК Interstrand сшивок

DOI:

10.3791/54678

⸱

10 ноября 2016 г.

 , 
1Division of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, The University of Texas at Austin

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целевое повреждение ДНК может быть достигнуто путем связывания повреждающего ДНК агента с триплексобразующим олигонуклеотидом (TFO). Используя модифицированные TFO, ассоциацию белков, специфичных для повреждения ДНК, и модификацию топологии ДНК можно изучать в клетках человека с помощью модифицированных анализов иммунопреципитации хроматина и описанных здесь анализов суперспирали ДНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Группа коробки Высокая мобильность 1 (HMGB1) белок представляет собой негистоновых архитектурный белок, который участвует в регуляции многих важных функций в геноме, такие как транскрипции, репликации ДНК и репарации ДНК. HMGB1 связывается с структурно искаженный ДНК с более высоким сродством, чем к каноническому B-ДНК. Например, мы обнаружили, что HMGB1 связывается с ДНК interstrand сшивок (МКСТ), которые ковалентно связывают две нити ДНК, вызывают искажение спирали, и если оставить неотремонтированный может привести к гибели клеток. Из-за их цитотоксическое, несколько ICL индуцирующие агенты в настоящее время используются в качестве химиотерапевтических агентов в клинике. В то время как ICL-агенты , формирующие показывают предпочтения для определенных последовательностей оснований (например, 5'-TA-3 'является предпочтительным местом для сшивания псорален), они в значительной степени вызывают повреждение ДНК в неизбирательным образом. Тем не менее, путем ковалентного связывания ИКЛ-индуцирующего агента к триплекс-образующих олигонуклеотидов (ФБПС), который связывается с ДНК в последовательности конкретныхСпособ, целевое повреждение ДНК может быть достигнута. Здесь мы используем TFO ковалентно конъюгированный с 'концом к 4'-гидроксиметил-4,5' в 5, 8-trimethylpsoralen (ГМТ) псорален, чтобы создать сайт-специфическую ICL на мутацию репортерной плазмидой, чтобы использовать в качестве инструмента изучить архитектурные изменения, обработки и ремонта сложных повреждений ДНК с помощью HMGB1 в клетках человека. Описаны экспериментальные методы для подготовки ФБПС-направленных ICLS на репортер плазмид, и допросить ассоциацию HMGB1 с ФБПС направленными ICL, в сотовой связи с использованием хроматин иммунопреципитации. Кроме того, мы опишем суперспирализацию анализы ДНК, чтобы оценить конкретную архитектурную модификацию поврежденной ДНК путем измерения количества оборотов сверхвитков введенных на псоралена-сшитый плазмиды HMGB1. Эти методы могут быть использованы для изучения роли других белков, участвующих в обработке и ремонту ТФО-направленных ICL, или других повреждений целевой ДНК в любой клеточной линии, представляющей интерес.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Триплекс-образующих олигонуклеотидов (TFOs) связывают дуплекса ДНК в моде последовательности конкретных посредством связывания Хугстена-водорода с образованием тройной спиральные структуры 1-5. Триплекс технология была использована , чтобы допросить ряд биомолекулярных механизмов, таких как транскрипции, репарации повреждений ДНК и генного таргетинга (обзор в ссылках 6-8). TFOs широко используются для индукции сайт-специфического повреждения репортерных плазмид 9,10. Наша лаборатория и другие ранее использовали ФБПС, AG30, привязанный к псоралена молекулы индуцировать сайт-специфических ДНК interstrand сшивок (МКСТ) в гене supF на плазмиды pSupFG1 5,10-12. ICLS весьма цитотоксическое , как эти поражения ковалентного две нити ДНК, и , если оставить неотремонтированный, может блокировать транскрипцию генов и препятствовать механизм репликации ДНК 13,14. Из-за их цитотоксическое, ICL-индуцирующие агенты были использованы в качестве химиотерапевтических препаратов при лечениирака и других заболеваний 15. Тем не менее, обработка и ремонт ICL, в клетках человека не очень хорошо понял. Таким образом, более глубокое понимание механизмов, участвующих в обработке ICL, в клетках человека может помочь улучшить эффективность ICL на основе химиотерапевтических препаратов. ФБПС-индуцированные ICLS и их промежуточные ремонт имеют потенциал, чтобы вызвать значительные структурные искажения в спирали ДНК. Такие искажения являются вероятные цели для архитектурных белков, которые связываются с искаженной ДНК с более высоким сродством , чем к канонической В-форме дуплексной ДНК 16-20. Здесь мы изучали ассоциацию весьма обильной архитектурного белка, HMGB1 с ICL, в клетках человека с помощью иммунопреципитации хроматина (CHIP) анализов на псорален-сшитый плазмид и определили роль HMGB1 в модуляции топологии псоралена-сшитой ДНК плазмиды в человека раковых клеток лизатов.

HMGB1 является весьма обильны и повсеместно экспрессируется без еготон архитектурный белок , который связывается с поврежденной ДНК и альтернативно структурированных субстратов ДНК с более высоким сродством , чем каноническая В-формы ДНК 17-20. HMGB1 участвует в нескольких процессах ДНК метаболизма, таких как транскрипции, репликации ДНК и репарации ДНК 16,21-23. Ранее мы показали , что HMGB1 связывается с ТФО направленными ICL , в пробирке с высоким сродством 20. Кроме того, мы показали , что отсутствие HMGB1 увеличил мутагенный обработку ФБПС-направленных ICL , и определил HMGB1 как ремонт нуклеотид иссечения (РЭК) кофактора 23,24. В последнее время , мы обнаружили , что HMGB1 связан с ТФО направленными ICL , в клетках человека и его набор таких поражений зависит от белка Нирова РФА 16. Отрицательный сверхспирализация ДНК было показано , способствовать эффективному удалению повреждений ДНК с помощью НЭК 25, и мы обнаружили , что HMGB1 вызывает отрицательную суперспирализацию преимущественно на ФБПС-направленных ICL-содержащих пласередине подложки (относительно неповрежденных плазмид субстратов) 16, обеспечивая лучшее понимание потенциальной роли (ами) HMGB1 как NER кофактора. Обработка ICL, до конца не изучен в клетках человека; Таким образом, методы и анализы, разработанные на основе молекулярных инструментов, описанных здесь, может привести к идентификации дополнительных белков, участвующих в ICL ремонта, которые в свою очередь могут служить фармакологические мишени, которые могут быть использованы для повышения эффективности химиотерапии рака.

Здесь, эффективный подход к оценке эффективности ТФО-направленного формирования ICL в плазмидной ДНК с помощью денатурирующего электрофореза в агарозном геле обсуждалось. Кроме того, с помощью плазмид, содержащих ТФО направленный ICLS, методы для определения ассоциации HMGB1 с ICL-поврежденных плазмид в клеточном контексте с использованием модифицированных анализов щепу были описаны. Кроме того, легкий способ для изучения топологических изменений, вносимых гое архитектурный белок HMGB1, в частности, на ICL поврежденных плазмидных субстратов в лизатах клеток человека были определены путем выполнения суперспирализацию анализов с помощью двумерного электрофореза в агарозном геле. Методики, описанные могут быть использованы для дальнейшего понимания участия репарации ДНК и архитектурных белков в обработке целевых повреждений ДНК на плазмид в клетках человека.

Опишем подробные протоколы для формирования ТФО сайт-специфические псорален ICL, на плазмидной ДНК, и последующей плазмиды жечных и суперспирализацию анализы для идентификации белков, которые ассоциированы с повреждениями, а также белки, которые изменяют топологию ДНК, соответственно. Эти анализы могут быть модифицированы, чтобы выполнить с другими ДНК-повреждающих агентов, TFOs, плазмидной субстратов и млекопитающих клеточных линий, представляющих интерес. На самом деле, мы показали , что существует по крайней мере один потенциальный уникальный и высокое сродство ТФО-связывающий сайт в пределах каждого аннотированного гена в геноме человека 26. Каккогда - либо, для ясности, мы описали эти методы для использования конкретного псорален-конъюгированного TFO (pAG30) на определенной мутации репортер плазмиды (pSupFG1) в клетках U2OS человека , как мы использовали в Мукерджи & Vasquez, 2016 г. 16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение ФБПС-направленных ICL, на плазмидной подложках

  1. Выдержите эквимолярные количества плазмиды pSupFG1 10,11 ДНК (плазмидной ДНК 5 мкг является хорошей отправной точкой) с псоралена-конъюгированного ФБПС AG30 в 8 мкл триплекс буфера для связывания [50% глицерина, 10 мМ Трис (рН 7,6), 10 мМ MgCl 2] и дН 2 O до конечного объема 40 мкл в янтарной трубки. Тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируйте реакции при бане 37 ° C воды в течение 12 ч.
  2. Подогреть UVA лампу, чтобы обеспечить полную мощность. Поместите реакцию триплекс на парафиновой пленки, и поместите парафиновой пленки на льду под UVA (365 нм) лампы. Поместите майларовую фильтр между лампой и реакции.
  3. UVA облучить для суммарной дозы 1,8 Дж / см 2. Хранить образцы при температуре 4 ° С для последующего использования.
    Внимание: Носить соответствующую защитную одежду и защитные очки с УФ облучения.
  4. Линеаризацию 200 нг полученного выше плазмиды с повторнымстрикция фермент Eco R1 в 20 мкл общего объема с помощью производителя поставляется 10х буфера. Тепло денатурации фермента в течение 20 мин при 65 ° С. Спин образцов в течение 10 мин при 10000 х г и хранят при температуре 4 ° С.
  5. Подготовка 50x щелочного буфера [1,5 М NaOH, 50 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)]. Добавить 0,5 мг агарозы 50 мл дН 2 O. Отварить, чтобы растворить агарозы и поместить его в водяной бане 50 ° C.
  6. После того, как температура растворенного агарозу вплоть до 50 ° С, добавляют 1 мл 50x щелочного буфера, перемешать, а затем налить гель в лоток гель. Дайте время гель для отверждения при комнатной температуре перед использованием.
  7. Добавляют 4 мкл 0,5 М ЭДТА до 20 мкл линеаризованной ДНК образца и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.
  8. Добавить 6х щелочной гель загрузочного буфера (300 мМ NaOH, 6 мМ ЭДТА, 18% (вес / объем) с высокой молекулярной массой полисахарид, 0,06% Бромкрезоловый Зеленый в дН 2 O) к образцам и к лестнице ДНК в 1 кб.
    Примечание: Важно использовать 6х щелочной буфер гель загрузки, пожалуйста, обсуждение см.
  9. Образцы нагрузки на гель в холодной комнате и работать на ночь в 1x щелочной буфер (12-16 ч) при 3,2 вольт на сантиметр. После того, как образцы были введены в гель, поместить стеклянную пластину на верхней части геля, чтобы предотвратить его плавающим.
  10. Нейтрализовать образцы путем замачивания гель в буфере нейтрализации [1 М Трис-Cl (рН 7,6), 1,5 М NaCl, 3 М ацетата натрия (рН 5,2)] в течение 45 мин при комнатной температуре.
  11. Пятно гель для ДНК с 4 мкл 1% бромистым этидием (EtBr) в 50 мл воды в течение 1 ч при комнатной температуре. Destain с водой в течение 15 мин. Визуализируйте ДНК с использованием системы визуализации.
    Внимание: EtBr является мощным мутагенным и может всасываться через кожу. Избегайте прямого контакта с EtBr.

2. Трансфекция и Иммунопреципитаци ФБПС-направленных ICL-содержащих плазмид в клетках человека

  1. Пластинчатые 400000 клетки млекопитающих (например, U2OS Osteosarcoma клеток) на 60 мм чашку в Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) без антибиотиков 24 ч до трансфекции. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
  2. Перед трансфекцией теплой ростовой средой и забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) до 37 ° С в водяной бане. Подогреть трансфекцию реагента до комнатной температуры.
  3. Выдержите 30 мкл реагента для трансфекции с 500 мкл 1x среды для выращивания (смесь 1) и 2 мкг ФБПС-направленных ICL-содержащих плазмид в 500 мкл 1х среды для выращивания (смесь 2) в отдельных 14 мл с круглым дном пробирки в течение 10 мин при комнатная температура.
  4. Добавить смесь 1 смешать 2, хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Выдержите в течение 25-30 мин при комнатной температуре.
  5. Вымойте клетки дважды с теплым PBS. Добавьте в смесь для трансфекции по каплям моды распределяя равномерно по всей пластине клеток. Добавьте 1 мл питательной среды к плите и довести до конечного объема 2 мл. Смешайте мыLL. Место культуры пластины в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение 4 ч.
  6. Заменить носитель со средствами массовой информации 3 мл роста, дополненной 10% FBS, и инкубируют еще в течение 16 часов. Не используйте антибиотики.
  7. Treat клеток с 80 мкл 37% -ного формальдегида на свежей пластины до конечной концентрации приблизительно 1%, и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре в отсутствие света.
    Внимание: Формальдегид является токсичным и должны быть обработаны в соответствии с его инструкциями по технике безопасности. Формальдегид воздействие может нанести вред коже, глаз и дыхательных путей.
  8. Угашайте сшивание формальдегида путем добавления 300 мкл охлажденного глицина (поставляется в продаже наборов) на одну пластину и инкубацию в течение 5 мин. Извлеките носитель и дважды промывали охлажденным PBS, а затем собирают клетки путем соскоба в 1 мл охлажденной (4 ° С) PBS, в микроцентрифужных трубки. Хранить образцы на льду во все времена.
  9. Готовят клеточные осадки центрифугированием при 4 ° С в течение 5 мин медленнот 13400 XG с помощью настольным охлаждаемой центрифуге. Пипеткой из супернатант и поместить осадок клеток на льду.
  10. Гомогенно ресуспендируют осадок в 1 мл охлажденной (4 ° С) буфера А (поставляется в продаже наборов) и инкубировать на льду в течение 10 мин. Смешать изредка переворачивая пробирку. Гранул клетки, как и раньше (см шаг 2.9 выше).
  11. Гомогенно ресуспендируют осадок в 1 мл охлажденной (4 ° C) буфера В (поставляется в продаже наборов) и инкубировать на льду в течение 10 мин с периодическим перемешиванием инвертированием. Гранул клетки центрифугированием, как и ранее (см шаг 2.9 выше).
  12. Ресуспендируют клеток снова в 200 мкл охлажденном буфере В. Добавляют 2 мкл микрококковую нуклеазы (MNase) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Смешать реакции иногда слегка ударяя по пробирке. Остановить реакцию MNase, помещая пробирку на льду и добавл 40 мМ ЭДТА. Гранул клетки, как и раньше (см шаг 2.9 выше).
  13. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 1x хроматина immunoprecipitation буфер (ЧИП) буфер (поставляется в коммерчески доступных наборов) с добавлением ингибиторов протеаз.
  14. Поместите ресуспензированной клетки в тонкостенной пробирке. Разрушать ультразвуком образцов, пуская их на водяной бане в течение ультразвуковом 20 сек, а затем 20 сек инкубации на льду. Повторите шаги Озвучивание 9 раз для генерации ~ 800-1200 фрагментов BP.
    1. К 20 мкл образцов, обработанных ультразвуком добавляют 3 мкл 5 М NaCl и 1 мкл РНКазы А. Хорошо перемешать встряхиванием и инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин. Затем добавляют по 2 мкл протеиназы К и инкубировать в течение 2 ч при 65 ° С. Очищают образцов с использованием набора для очистки ПЦР. Выполнить образцы на 1% -ном агарозном геле и визуализировать с EtBr.
      Примечание: Максимальная интенсивность полученной ДНК должна быть на уровне или ниже 1000 б.п..
  15. В трех отдельных трубок, добавить 30 мкл лизата в предварительно охлажденный силиконизированный трубки, а затем добавляют 70 мкл охлажденного буфера 1x фишке с добавленными ингибиторами протеазы. Добавить 1 мкмг анти-иммуноглобулина G (IgG), анти-гистона H3 (в качестве положительного контроля) или анти-HMGB1 антител к соответствующим трубам. Выдержите в течение ночи в холодном помещении с непрерывным вращением.
  16. Ресуспендируют белок G бусин однородно в холодном помещении. Добавьте 4 мкл белка G бусин на пробирку и инкубировать в течение еще 2-4 ч в холодном помещении с вращением.
  17. С помощью магнитной стойки, Шарик бусинки и удалить супернатант. Добавить 200 мкл буфера 1x ChIP смешанный с ингибитором протеаз к осадку и моют в течение 5 мин в холодном помещении с вращением. Повторите мыть два раза.
  18. Выполните одно дополнительное мытье с высоким содержанием соли 1x ChIP буфера (содержащего 70 мМ NaCl).
  19. Ресуспендируют гранул с 160 мкл буфера для элюции (поставляется в коммерчески доступных наборов) и инкубируют при 37 ° С при вращении в течение 30 мин.
  20. Гранул шарики и собирают супернатант в новую пробирку. Добавить 6 мкл 5 М NaCl и 2 мкл протеиназы К и инкубировать в течение ночи при температуре 65° С.
  21. Очищают ДНК с использованием набора для очистки ПЦР - продукта и элюции ДНК с использованием 50 мкл дН 2 O.
  22. Выполните ПЦР с 16 реакций с использованием наборов праймеров для участка (участков) , представляющих интерес, и решить продукты на агарозном геле 1% , окрашенном EtBr.

3. суперспирализацию Анализ и 2-мерных Электрофорез в агарозном геле

  1. Готовят синтез ДНК ремонт буфера (45 мМ Hepes-КОН, рН 7,8; 70 мМ KCl, 7,4 мМ MgCl 2, 0,9 мМ ДТТ, 0,4 мМ ЭДТА, 2 мМ АТФ, 20 мкМ дНТФ, 3,4% глицерина и 18 мкг бычьего сывороточного альбумина) , Хранить при температуре -80 ° С. Оттепель на льду и перед использованием добавляют 40 мМ фосфокреатина и 2,5 мкг креатинфосфокиназы.
  2. Подготовка 10x суперспирализацию буфер [500 мМ Трис (рН 8,0), 500 мМ NaCl, 25 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА], и хранят при комнатной температуре.
  3. Линеаризуем 300 нг сверхскрученной pSupFG1 ДНК плазмиды полностью используя 1 мкл коровьей топоизомеразы I (5-15 ед / мкл) с 1xсуперспирализация буфер в 10 мкл реакционной смеси. Выдержите смесь при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
  4. Растаяйте HeLa клеток экстракта 24 на льду. Для того, чтобы полностью релаксированному плазмид, добавьте 25 мкл HeLa клеток экстракта и репарации ДНК буфера синтеза. Хорошо перемешать. Добавление дополнительных 1 мкл коровьей топоизомеразы I к соединению, и инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С.
  5. Прекратить реакции путем добавления додецилсульфата натрия (SDS) (конечная концентрация 1%) и протеиназы К (0,25 мг / мл конечной концентрации). Инкубируют при 65 ° С в течение 2 часов.
  6. Литой гель 1% -ном агарозном с 1x Трис Борат ЭДТА (КЭ) буфера. Добавить краситель загрузки ДНК и загружать реакции непосредственно на гель по меньшей мере, 4 полосы друг от друга. Выполнить гель в течение 8-10 ч при 2 В / см в 1X TBE (размер 1) при комнатной температуре, чтобы решить топоизомерам.
    Примечание: Подготовка исходного раствора 5x КЭ в 1 л дН 2 O добавлением 54 г Трис основания. 27,5 г борной кислоты и 20 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).
  7. Приготовьте 2 л 1xКЭ с 3 мкг / мл хлорохина-фосфата. Замочите геля в 200 мл этого раствора в течение 20 мин. Накройте лоток геля с алюминиевой фольгой.
  8. Для electrophorese геля во втором измерении, поверните геля на 90 ° по часовой стрелке и запустить его в течение 4-6 ч при 2 В / см в хлорохин, содержащей 1x КЭ разрешить положительные и отрицательные супервитки.
  9. Пятно гель с EtBr в течение 1 часа на коромысле. Destain гель с дН 2 O в течение 15 мин , а затем визуализировать тепловое распределение топоизомеров с использованием тепловизора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Формирование ТФО-направленного ICL является критическим для плазмиды на основе анализов, которые используются для опрашивать роли архитектурных белков в обработке ICL в клетках человека. Денатурирующий электрофореза в агарозном геле является поверхностным способом определения эффективности ФБПС-направленного формирования ICL. Плазмиды , несущие ФБПС-направленные ICLS мигрируют с меньшей подвижности через матрицу агарозном геле (рис 1А, дорожка 3) по сравнению с не-сшитых...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективное формирование ТФО-направленных ICL , зависит от двух важных факторов: во- первых, собственно буферные компоненты (например, MgCl 2) и время инкубации TFO с его субстратом ДНК - мишени (зависит от аффинности связывания TFO к цели дуплекс, а используемые концентрации); и во-вторых, правильная доза UVA (365 нм) облучение эффективно формировать псорален сшивок. Оптимальное формирование триплекс может быть достигнуто с помощью ВЭЖХ или гель-очистке TFOs. Примеси загрязняя TFO может привести к н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить членов Васкес лаборатории за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения / Национального института рака [CA097175, CA093279 к КМВ]; и профилактики рака и Научно-исследовательский институт Техаса [RP101501]. Финансирование для открытого доступа бесплатно: Национальные институты здоровья / Национальный институт рака [CA093279 на КМВ].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5'HMT Psoralen-AG30Midland Certified Reagent Co., Мидленд, ТехасИндивидуальный заказВЭЖХ (или гелевый) очищенный
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP KitCell signaling Inc.9003Предложенный производителем протокол оптимизирован для хроматина IP, а не для плазмидного IP. Контрольные антитела IgG и H3, а также гранулы протеина G и микрококковая нуклеаза поставляются производителем.
GoTaq GreenPromegaM7122PCR master mix
HMGB1 антителоAbcamAb18256
Волшебный гель и набор для очистки ПЦРPromegaA9281
Хлордифосфатная сольSigmaC6628-50GДля электрофореза в двумерном агарозном геле
EcoRINew England BioLabsR0101S
Реагент для трансфекции GenePORTERGenlantisT201015
Vaccinia Topoisomerase IInvitrogen38042-024
Длинноволновая ультрафиолетовая лампа Blak-RayUpland, CAB 100 APUVA лампа
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100EpigentekEQC-1100Водяная баня соникатор
Майларовый фильтрGE Здравоохранение Медико-биологические науки
AgaroseSigma-AldrichA6111
BIO-RAD ChemidocBIO-RADXRS+ системавизуализации ДНК
ГлицинFisher ScientificBP381-500
37% формальдегидSigma-AldrichF8775-25MLИспользуется для сшивки 
Протеиназа К НоваяАнглия БиолабсP8107S
DMEMThermoFisher11965092Среды для клеточных культур
PBSThermoFisher70013073Клеточная культура
Trypsin-EDTAThermoFisher25200056Клеточная культура
Bromocresol зеленыйSigma-Aldrich114-359ДНК-загрузочный краситель
Силиконизированные пробиркиFisher Scientific 02-681-320Микрофуговая пробирка с низким удержанием
Трис-основаниеFisher ScientificBP152-1
Борная кислотаFisherScientific A74-1
ЭДТАНаучныйBP24731
фотометрInternationalLight TechnologiesILT1400-AUVA для измерения дозы
<сильно>Клеточные линии
Остеосаркома человека U2OSATCCATCC HTB-96Культивируется в соответствии с поставщиком s рекомендация
Аденокарцинома шейки матки человека HeLaATCCATCC-CCL-2Культивируется в соответствии с поставщиком' s рекомендация
Proximal forward primer5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Дистальный прямой праймер5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Дистальный обратный праймер5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc
80112939

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
  2. Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
  3. Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
  4. Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
  5. Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
  6. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
  7. Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
  8. Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
  9. Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
  10. Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
  11. Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
  12. Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
  13. Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
  14. Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
  15. Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
  16. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
  17. Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
  18. Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
  19. Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
  20. Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
  21. Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
  22. Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
  23. Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
  24. Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
  25. Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
  26. Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
  27. Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
  28. Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
  29. Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
  30. Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
  31. Puri, N., et al. Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
  32. Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
  33. Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HMGB1TFOsiRNA

Похожие статьи