Методическая статья

Визуализация Charcoal Agar резазурин Пробирной для полуколичественного, средне-пропускной Перечень микобактерий

DOI:

10.3791/54690

⸱

14 декабря 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Microbiology & Immunology, Weill Cornell Medical College, 2Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Угольc harcoal agar resazurin assay (CARA) - это полуколичественный метод со средней пропускной способностью для оценки активности тестируемых агентов против микобактерий, которые реплицируются, не реплицируются или и то, и другое. CARA позволяет быстро оценить активность, зависящую от времени и концентрации, и определяет параметры, которые необходимо исследовать с помощью анализов колониеобразующих единиц (КОЕ).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует острая необходимость, чтобы обнаружить и прогрессировать антибактериальные, которые сокращают продолжительность туберкулеза (ТБ) лечения. Микобактерии туберкулеза, этиологическим агентом туберкулеза, является резистентной к быстрому и прочному химиотерапии в связи с наличием микобактерий , проявляющих фенотипической устойчивости к лекарственным средствам. С harcoal гар R esazurin в ssay (CARA) был разработан в качестве инструмента для характеристики активных молекул , обнаруженных высокопроизводительного скрининга кампании против репликации и не тиражирование микобактерии. Включение активированного угля в бактериологической агаровой среде помогает смягчить воздействие соединения, переносимых и устраняет необходимость предварительно разбавить клеток перед пятнистость на CARA микропланшетов. После инкубационного периода 7-10 дней при температуре 37 ° С, снижение резазурин по микобактерий микроколониями растущих на поверхности CARA стрипы позволяет полуколичественного Ассssment бактериальных чисел через флуориметрии. КАРА обнаруживает примерно 2-3 log 10 разницы в бактериальных чисел а и предсказывает минимальную бактерицидную концентрацию , ведущую к ≥99% бактериального убийства (MBC ≥99). КАРА помогает определить, активен ли на бацилл, которые копируют, не-тиражирование, или как молекула. Пилотные эксперименты с использованием Cara облегчить идентификацию которых концентрация тестируемого агента и времени соединения экспозиции требуют дальнейшей оценки колониеобразующих единиц (КОЕ) анализов. Кроме того, КАРА может предсказать, если тиражирование активные вещества обладают бактерицидным или бактериостатическим.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микобактерии туберкулеза, этиологическим агентом туберкулеза, может выжить в хозяине в латентном состоянии , что не поддается ликвидации антибиотиков. Фенотипическая (Негенетические) сопротивление микобактерий туберкулеза во время инфекции , как полагают, объясняется, в частности, для населения , не являющихся тиражирование бацилл 1,2. Класс persisters I отображающие фенотипическую устойчивость к лекарству возникают с помощью редких стохастических механизмов среди крупных популяций наркотиков чувствительных клеток 3,4. persisters класса II оказываются не-тиражирование факторами иммунитета хозяина, в том числе внешних напряжений в микросреды, возникающих во время инфекции. Недавно мы разработали модель ин витро класса II , не тиражирование настойчивости , чтобы имитировать условия , с которыми сталкивается микобактерий туберкулеза в активированных макрофагах и гранулемы. Мульти-стресс модель класса II включает в себя условия настойчивостью, что медленный рост, такие как источник углерода жирных кислот, и полностью галрост т, такие как мягкая кислотность (рН 5,0), гипоксию (1% O 2) и оксида азота и других химически активных промежуточных продуктов азота 5-9. Крупномасштабное скрининг с использованием этого мульти-стресс модель не-репликации, а также другие модели , не Дублирование класса II, дала разнообразные молекулы, деятельность которых направлена против не-тиражирование состояния 5-7,9-18. Те же не-тиражирование экраны также выявили категорию молекул , которые обладают активностью против обоих тиражирование и не тиражирование бацилл, называемые "двойные" 7,10,12,19,20 активные вещества.

Антибактериальная открытия препарата в фазе хит-к-свинца влечет за собой обширную характеристику молекул - кандидатов на выбор потенциальных клиентов для расширения хит, предварительной фармакологической характеризации, идентификации мишени и предварительных исследований эффективности в естественных условиях. В качестве первого шага, Противомикробные препараты классифицируются по их бактериостатическим или бактерицидным механизмом действия и, если бактерицидным, шhether бактериальная убийство требует больших затрат времени и / или зависит от концентрации. Блок колониеобразующих (КОЕ) анализ является классическим, золотой стандартный метод для решения этих вопросов. В анализе КОЕ, бактерии подвергаются воздействию тестируемого агента, после чего аликвоты, серийно разведенной, и аликвоты разбавлений распространяются на твердой среде бактериологическим и инкубировали, чтобы обеспечить рост выживших клеток. Наконец, бактериальные колонии перечислены. Анализ КОЕ требует большого количества титрационных микропланшетов для разбавления клеток и агар-содержащего чашках пластины для перечисления выживших колоний. Анализ КОЕ для медленно растущей микобактерий препятствует их медленное время генерации (18-24 ч), что требует около 3 недель колонии появиться на планшетах. Кроме того, инкубатор пространство часто ограничено в специализированных биологической безопасности на уровне 3-объектов.

Хотя громоздким, КОЕ анализы являются золотым стандартом, чтобы охарактеризовать влияние, не реплицируются и двойного активных молекул на mycobacterНМА. Номера реплицирующиеся анализы подвержены высоким ложноположительных как многие связаны с репликацией анализов для оценки клеточного 6-8 жизнеспособности. Например, соединение , которое обладает сильной активностью против репликации микобактерии (а "тиражирование активный") может не убить в течение не-тиражирование анализе, тем не менее все еще может убить в силу переносимых из не-тиражирование фазы из анализ на этапе восстановления анализа, который проводится в условиях, которые поддерживают репликацию ( "тиражирование условия"). Соединение переносятся еще более усложняет анализ дуальной активных молекул, что делает его трудно отличить, была ли активность репликации, не-тиражирование или спаренными.

Для решения проблем , описанных выше, мы разработали гр harcoal в Гар г esazurin на ssay (CARA) для быстрого, полуколичественного перечисление видов микобактерий , таких как М. tuberculОсис, М. Бови BCG и М. smegmatis 7 (1 и 2). В буферных растворах в пробирке, активированный уголь быстро изолирует большинство стандартных препаратов , используемых для лечения туберкулеза 7. Активированный уголь в CARA микропланшетов связывает соединения , которые могут переносятся из анализа микропланшет, и эта особенность CARA исключает требование серийно разбавить содержание анализа задолго до перечислению 7,21,22. Количество микобактерий микроколониями на агаризованной поверхности CARA микропланшетов оценивается путем добавления резазурин, синий краситель, чья восстановленную форму, резоруфином, является розовой молекулой, измеряют флуоресценцию с помощью спектрофотометрии 23. КАРА микропланшеты инкубируют в течение 1-2 дней для M. smegmatis и 7-10 дней для медленно растущих микобактерий , таких как микобактерии туберкулеза и M. Bovis БЦЖ. КАРА имеет узкий динамический диапазон ~ 2-3 log 10 сиситемахключение контакта в КОЕ. При использовании вместо анализа КОЕ, один КАРА микропланшет заменяет примерно пять 96-луночных планшетов, используемых для серийных разведений и чашках с агаром 120 три- стилей, используемых для покрытия. Интерпретация данных CARA помогает направлять последующие исследования, определяя, какие Инкубационный раз и концентрации соединений для тестирования в более трудоемкие анализы КОЕ на основе.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление CARA микропаншет

  1. Автоклавы 900 мл Миддлебрук 7H11 агар, содержащий 0,2% глицерина и 0,4% активированного угля в 2-литровую колбу Эрленмейера, или в качестве альтернативы, 450 мл в стеклянном стакане объемом 1 л. Включите большой автоклавируемы мешалку в колбе или стакане. Закройте отверстие колбы или стакан с алюминиевой фольгой и прикрепить к стеклу с автоклавной лентой.
  2. Прохладный на ощупь (примерно 55-65 ° С) на магнитной мешалке, установленной на низкой скорости, чтобы сохранить уголь в виде суспензии.
  3. Выполнить все последующие шаги асептически в капюшоне биологической безопасности, который имеет магнитную мешалка.
  4. Удалите фольгу. Добавить 100 мл OADC добавки (OADC добавка, при использовании на 10%, урожайность конечные концентрации носителей 0,2% декстрозы, 0,5% альбумина, 0,085% NaCl, 0,0005% олеиновой кислоты и 0,4 мг / мл каталазы) в колбу, 2 л Эрленмейера или 50 мл OADC в химический стакан емкостью 1 л, и продолжают перемешивание.
  5. При использовании коническую колбу, заливают примерно 25-40 мл 7H11-OADC-древесный уголь в стерильный резервуар реагента. При использовании химического стакана, то нет необходимости использовать резервуар с реагентом.
  6. Наполните 96-луночный микропланшет с 200 мкл / лунку 7H11-OADC-уголь, полученный из резервуара реагента или мензурки. Работают быстро, чтобы избежать агара затвердевание и введение пузырьков. Избегайте разбрызгивания твердой среды вне лунок, так что может быть источником грибковой контаминации. Используя многоканальную пипетку, использовать один набор из 12 советов фильтра для передачи 7H11-OADC-древесный уголь до 8 строк (АГ) в 96-луночного планшета.
    Примечание: среда застывает быстро. Для того, чтобы избежать засорения пипеток, часто менять их.
  7. В качестве альтернативы, влить Cara микропланшетов с использованием P1000 электронной многоканальной пипетки с наконечниками фильтров для оказания помощи в подготовке многочисленных пластин.
    Примечание: Из-за низкого объема стрипы, агар в CARA микроплит затвердевает в течение нескольких минут заливки.
  8. Место стеки CARA микроплит в герметично закрытых пластиковых баГ.С., чтобы избежать высыхания.
  9. Магазин КАРА микропланшетов при 4 ° С.

2. Настройка Репликация и Non-тиражирование MIC 90 Assays

  1. Инокулируйте микобактерии, М. Bovis БЦЖ или M. smegmatis при OD 580 0,01-0,1 и расширение до середины логарифмического (OD 580 ~ 0,5) в Миддлбрука 7H9-ADN (Миддлебрук 7H9 , содержащий 0,2% глицерина, 0,2% раствор декстрозы , 0,5% альбумина и 0,085% NaCl), или 7H9-OADC (Миддлебрук 7H9, содержащей 0,2% глицерина и 10% OADC добавки).
  2. Растут микобактерии туберкулеза и М. Bovis БЦЖ в ~ 20 мл стоячих культур в клеточной культуре колб и М. smegmatis при встряхивании в полипропиленовых округлым дном (4 мл культуры) или 50 мл коническую центрифужные пробирки (10-20 мл культуры). Выдержите патогенные микобактерии при температуре 37 ° С с 20% O 2 и 5% CO 2, и М. smegmatis при 37 ° С с 20% O 2.
  3. Настройка минимальной подавляющейконцентрация (МИК 90) -стиль эксперимент под тиражирование и не-тиражирование условий (рисунок 2).
    Примечание: агенты Тест обычно анализируют в дубликатах или quadruplicates, чтобы разрешить тестирование 4 или 2 соединения, соответственно, за 96-луночного микропланшета. Например, в 96-луночный планшет, один тестовый агент может быть проанализирован в строках AD, а другой в строках EH. ДМСО (транспортное средство) находится в колонках 1, 2 и 12, и серии разведений тест агент проходит из колонки 3 (низкой концентрации) в колонке 11 (самая высокая концентрация). MIC 90 -Style анализы обычно используют 2-кратный серийные разведения. Есть множество не-тиражирование модели для микобактерий 14-16,18,24,25 и в иллюстративных целях, мы используем мульти-стресс модель не-репликации 6,8,9.
    1. Для анализа реплицирующейся, распределяют по 200 мкл клеток в 7H9-ADN при OD 580 0,01 во все лунки ясно дном, для культуры ткани , обработанной 96-луночного планшета.
    2. Для не-тиражирование анализа, мыть клетки дважды в фосфатном буфере (PBS) , содержащего 0,02% тилоксапол и ресуспендирования клеток в не-тиражирование среде (0,05% KH 2 PO 4, 0,05% MgSO 4, 0,005% цитрат железа аммония , 0,0001% ZnCl 2, 0,1% NH 4 Cl, 0,5% БСА, 0,085% NaCl, 0,02% тилоксапол, 0,05% бутирата, рН доводили до 5,0 с помощью 2 N NaOH).
      1. Развести клетки к OD 580 0,1 в не тиражирование среде и добавляют NaNO 2 из свежеприготовленного 1 М маточного до конечной концентрации 0,5 мМ.
      2. Распределить 200 мкл клеток при OD 580 0,1 во все лунки ясно дном, для культуры ткани , обработанной 96-луночного планшета.
        Примечание: Подготовка разведений соединения в 100-кратном маточных растворов в ДМСО. Таким образом, типичный МИК пластина тестирования влияния молекулы при конечной концентрации 0.4-100 мкг / мл требует исходных растворов 0.04-10 мг / мл в ДМСО.
    3. Добавьте 2 мкл диlutions тестируемого агента 1 в строки AE и 2 мкл разведений тестируемого агента 2 в строки EH. Тщательно перемешать.
    4. Добавить 2 мкл управления транспортным средством (обычно ДМСО) в контрольных лунках, столбцы 1, 2, 12 (строки АГ). Тщательно перемешать.
    5. Для каждого эксперимента, включают в себя, по меньшей мере, один положительный контроль, такие как рифампицин от 0,004 до 1 мкг / мл (тиражирование анализ) и / или 0,08 до 20 мкг / мл (не-тиражирование анализ).
      Примечание: Использование 6-бром-1Н-индазол-3-амина 9 в количестве от 0,1 до 25 мкг / мл , рекомендуется в качестве контрольного соединения , которое имеет селективные, NaNO 2 зависящему активности в модели нескольких напряжений не-репликации.
    6. Для репликации анализов, инкубировать микропланшеты при температуре 37 ° C при 20% O 2 и 5% CO 2 в течение 7 дней (микобактерии туберкулеза и M. Bovis БЦЖ) или 1-48 ч (М. smegmatis). Для модели мульти-стресс не-репликации, инкубировать микропланшеты в течение 7 дней при температуре 37 ° С на 1% O 2 и 5% CO 2 ( M. туберкулез и M. Bovis БЦЖ).

3. Посев CARA микропаншет

  1. В моменты времени , в котором КАРА будет использоваться в качестве считыванием, тщательно ресуспендируют хорошо содержимое MIC 90 -style планшет для анализа с использованием p200 многоканальную пипетку установлена на уровне 50-75 мкл. Пипеток вверх и вниз, по крайней мере, в 5-10 раз и нежно вихревой содержимое хорошо в круговом движении, используя наконечники пипеток.
  2. Передача 10 мкл содержимого для анализа также к CARA микропланшет. Убедитесь в том, что порядок содержания хорошо на планшете для анализа соответствует порядку содержания лунку CARA микропланшет. Избегайте разбрызгивания во время переездов и убедитесь, что 10 мкл разысканы в середине КАРА стрипы. Подтвердите 10 мкл впитывается в CARA микропланшет.
    Примечание: Там нет необходимых разведений до кровянистые выделения клеток на CARA микропланшетов.
  3. Bind стеки CARA микропаншет с пластинчатой ​​лентой изатем поместить в закрывающийся пластиковый пакет. Выдержите Cara микропланшеты при температуре 37 ° С с 20% O 2 (M. smegmatis) или 1% O 2 и 5% CO 2 (M. туберкулезом и M. Bovis БЦЖ).
  4. Для М. туберкулеза и М. Bovis БЦЖ, тиражирование анализы: инкубировать в течение 7 дней; для микобактерий туберкулеза и M. Bovis БЦЖ не-тиражирование анализов, инкубировать в течение 10 дней; для M. smegmatis, тиражирование анализы, инкубировать в течение 1-2 дней; для M. smegmatis, не Дублирование анализы, инкубировать 2-3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Времена оценки и могут быть изменены соответствующим образом для различных тиражирования, не-тиражирование и стрессовых условиях.

4. Развитие CARA микропаншет

  1. Развитие Cara микропаншет когда фильм бактериального роста или больших, макроскопических колоний, видны и на отрицательной (транспортное средство) контрольных скважин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После длительной инкубации, Cara стрипы частокажутся сухими, и мы рекомендуем предварительно смачивание хорошо содержимое стерильной PBS. Это служит для предотвращения древесного угля поглощать резазурин, что может привести к низкой флуоресценции или хорошо к скважине вариации.
  2. Использование одного набора 12 Р200, наконечниками с помощью многоканальной пипетки, обойтись 40 мкл стерильной PBS вдоль стороны лунки и позволить PBS, чтобы распределить по всей верхней части агар / бактериальными микроколониями.
  3. Подготовка КАРА проявляющий реагент путем смешивания 5 мг резазурин (0,01% конечная) и 50 мл 5% Tween80 в PBS. Vortex и стерильный фильтр.
    Примечание: альтернативный КАРА проявляющий реагент может быть получен путем смешивания коммерчески подготовленные ресазурина жидкого раствора в соотношении 1: 1 (об / об) с 10% Tween80 в PBS.
  4. Добавляют 50 мкл свежеприготовленного проявляющий реагент CARA в каждую лунку CARA микропланшет с помощью пипетки 12-канальный. Рок пластины взад и вперед несколько раз, чтобы помочь распределить реагент через агар и бактериального мата в каждую лунку.
  5. Место пластин яна закрывающегося пластикового пакета и инкубировать при температуре 37 ° С в течение не менее 30 мин для M. smegmatis и 45-60 мин для микобактерий туберкулеза или M. Bovis БЦЖ.
    Примечание: Если устройство управления транспортным скважины не порозоветь в течение первого часа, пластины могут быть повторно инкапсулированный и инкубировали в течение более длительных периодов времени.
  6. Перед чтением флуоресценцию, поместите Cara микропланшетов в капюшоне биологической безопасности в течение 15 мин при комнатной температуре с крышками удалены. При использовании BSL3 спектрофотометры вне шкафа биологической безопасности, придерживаться наклейку оптического качества ПЦР над тарелкой и уплотнение плотно нажав аккуратно на поверхности наклейки с мягким бумажным полотенцем.
  7. Определение флуоресценции с помощью верхней читать с возбуждением при 530 нм и излучение на длине волны 590 нм. Не надо на пустой тарелке.

5. Анализ данных

  1. Участок концентрации ингибитора на оси Х на логарифмической шкалы 10 и флуоресценции по оси ординат в линейном масштабе. Используйте разбросУчасток с использованием кривой подходят такие, как "бревном ингибитора в сравнении отклика переменной наклона (4-х параметров)". точек данных участка, как среднее значение ± стандартная ошибка.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ожидаемые результаты Cara описаны на рисунке 2 и приведены в таблице 1. Для репликации клеток, то выполняется КАРА параллельно со стандартными МИК 90 анализов, и для не-тиражирование анализах КАРА выполняется параллельно с адаптированной MIC 90 анализа , который соединен с нарост фазой. Концентрация тестируемого агента , что приводит к выходу из строя чара-флуоресценции подняться выше фоновых уровней является КАРА-MBC ≥99 (рис 3а). "≥99" нижний индекс указывает на то, что КАРА-MBC обеспечивает расчетную концентрацию тестируемого агента , что приводит к ≥2 log 10 бактериального Kill (≥99%) убийств.

Жидкий бульон MIC 90 анализа не в состоянии различать бактерицидной и бактериостатической активности и это различие должно быть решена с помощью анализа КОЕ. ОтКонвенция, порог , который отличает бактерицидным от бактериостатической активности для медленно растущих микобактерий составляет примерно 2-3 log 10 убийств в течение 7 дней 7,26. Так как динамический диапазон CARA также 2-3 log 10 убийств, то КАРА может дать оценку бактерицидной или бактериостатической активности. КАРА легко идентифицирует некоторые реплицирующиеся активные вещества как бактериостатическое из - за отказа этих соединений для уменьшения CARA флуоресценции до фоновых уровней (рисунок 2). Тем не менее, некоторые соединения с бактериостатической активностью против тиражирования микобактерии имеют сильный эффект после антибиотик, а это означает , что они по- прежнему тормозят возобновление роста бактерий во время фазы восстановления даже при отсутствии соединения перенесенных. Этот эффект может быть трудно признать в анализе CARA. Соединения подозреваются оказывают эффект после антибиотик, если они показывают "статическое окно", определяется как> 4-кратный сдвиг вправо betweeп кривые MIC и Cara (рис 3b). Статическое окно указывает на то, что молекула активного против тиражирования микобактерии может быть бактериостатическим вместо бактерицидным. В некоторых случаях, статические окна являются очевидными только после проверки расширенного Y-оси для CARA флуоресценции (фиг.3С и 3D).

Cara и MIC 90 данных обычно наносятся вместе (рисунок 4). Типичные данные для replicating- и не-тиражирование-активных молекул испытанных MIC 90 и CARA показаны на рисунке 4. Есть 4 основных классов активности для молекул: 1) тиражирование бактерицидным (продемонстрированные с изониазидом, рис 4а); 2) тиражирование бактериостатическое (продемонстрировано с линезолида, рис 4б); 3) не-тиражирование бактерицидным (продемонстрировано с оксифенбутазон, рис 4в); и, 4) Replicating-активные (бактериостатическое или бактерицидное) и не тиражирование бактерицидное (продемонстрирована PA-824, рис 4г). Важно отметить, что цифры 4а и 4б показывают , что в то время как изониазид и линезолид , по всей видимости , обладают активностью против не-тиражирование бактерий с помощью анализа MIC 90, то КАРА предполагает , что они являются неактивными при несв тиражирование условиях испытания. Чтобы проверить полезность CARA в прогнозировании затрат времени и зависимое от концентрации повреждений , наносимых молекулы, тиражирование M. smegmatis подвергалось возрастающих концентраций рифампицина (фиг.5а - d), и в разное время между 1-24 ч, аликвот наносили на CARA пластин. Эти данные свидетельствуют о том, что рифампицин оказали влияние еще 1 ч (рис 5а), отображается возрастающую бактерицидную активность от 3 до 24 ч (рис 5б-г), и убил ≥2-3 log 10 на ~ 10 мкг / мл на 24 ч (рис 5г). Аналогичный эксперимент тестирования quadruplicates элемента управления транспортного средства и 9 концентрации лекарственного средства, а также в 4 временных точках, будут непомерно стандартным КОЕ на основе анализа.

Таким образом, КАРА играет определенную роль в открытии препарата в качестве средней пропускной способности, быстрый механизм для идентификации профиль активности в молекуле. предсказания Cara следует тщательно оценить с помощью стандартного КОЕ анализа. Добавление 0,4% активированного угля в чашках Петри для анализа КОЕ может помочь улучшить корреляцию с данными CARA, и может привести к более точных подсчетов КОЕ, величина коррекции , как правило, пропорциональна потенции жилого 21,22.

figure-results-1
Рисунок 1: КАРА является прогностическим инструментом обнаружения наркотиков. Эта диаграмма обобщает полезность CARA в виде непромежуточная стадия между скрининга лекарственных средств (скрининг одной точки, вишня сбора и анализов доза-реакция) и хит-на-свинца анализов затратных по времени (КОЕ анализов и идентификации мишени). [Адаптировано с разрешения Gold и др., Противомикробные агенты и Химиотерапия, 2015 7] Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Схема анализа бульона MIC 90 и CARA с ожидаемыми результатами. Оба MIC 90 и Cara результаты представлены на 8 возможных мероприятий. Цветовое кодирование для MIC 90 стрипы белый (отсутствие роста) и коричневый (рост), так и для CARA микропланшетов не является черным (без флуоресценции) и розовый (резоруфином флуоресценция). Данные носят гипотетический характер. [Адаптировано с разрешения Gold и др., Противомикробные агенты и Химиотерапия, 2015 7] Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Специализированные Cara термины и определения. Минимальная бактерицидная концентрация молекулы , что приводит к фоновых уровней CARA флуоресценции является КАРА-MBC ≥99 (а). При реплицирующимися услови х ≥4-кратный сдвиг чара-MBC ≥99 справа от МИК 90 часто указывает бактериостатической активностью и называется "статическое окно" (б). Для молекул с мощным эффектом после антибактериальной, статические окна может быть трудно наблюдать (с) и требуютрасширение Y-оси (КАРА флуоресценции) для визуализации (d). Данные носят гипотетический характер. [Адаптировано с разрешения Gold и др., Противомикробные агенты и Химиотерапия, 2015 7] Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Иллюстративное MIC 90 и КАРА результаты для некоторых соединений. Данные для MIC 90 (красный) и КАРА (голубой) демонстрируются на примере (а) изониазид (INH), (б) линезолида, (с) оксифенбутазон, и (г) PA-824. Дикого типа туберкулез M. H37Rv подвергалось соединений в течение 7 дней в стандартных условиях тиражирование и модели нескольких напряжений не-репликации 7-9. MIC 90 анализы и КАРА были выполнены , как показано на рисунке 2. [Адаптировано с разрешения Gold и др., Противомикробные агенты и Химиотерапия, 2015 7] Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: дозы и времени зависит от активности рифампицина. Непатогенные, быстрорастущие M. smegmatis подвергалось возрастающие концентрации рифампицина при реплицирующимися условиях и аликвоты отбирали для CARA на 1 (а), 3 (б), 6 (с) и 24 (d) ч. [Адаптировано с разрешения Gold и др., Антимикробные агенты и химиотерапией, 2015 7].com / файлы / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Таблица 1: Сводка ожидаемых результатов на рисунке 2. [Адаптировано с разрешения Gold и др., Противомикробные агенты и Химиотерапия, 2015 7] Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

КАРА был первоначально разработан , чтобы облегчить узкое место в прогрессирующей не-тиражирование или спаренными активных молекул 7. КАРА служит промежуточным шагом между подтверждения ответа от концентрации первичных обращений скрининга и КОЕ анализа (рисунок 1). Так как один КАРА пластина может заменить множество микротитрационных планшетов, необходимые для подготовки серийных разведений, и агар-содержащих чашки Петри, используемые для перечисления оставшихся в живых бактерий, то КАРА предоставляет простые средства для быстрой оценки активности молекуле и протестировать несколько переменных одновременно, в том числе концентрации соединения и время воздействия соединения.

В анализе КОЕ, в дополнение к серийных разведений , которые часто дальность до 10 6 -кратно, чашки с агаром , как правило , разжижает молекул дополнительным ~ 800 раз (10 мкл на 8 мл в три-стиле чашку Петри). Наш двухступенчатый, мульти-стресс скрининг тест для соединений , действующих на не-тиражирование М. Tuberculosis имеет коэффициент уровня переносимых в 5 раз, то есть соединение , которое присутствует в не тиражирование стадии анализа присутствует на одну пятую от исходной концентрации в выроста (тиражирования) фазы анализа 6-9. В Cara смягчают последствия унос эффектов улавливание малых молекул с активированным углем. Большинство противотуберкулезных препаратов и клинических кандидатов Bind активированный уголь быстро и полностью, за исключением аминогликозидов стрептомицин 7. Включение активированного угля в чашки с агаром для КОЕ анализов предотвратить бактериальное ингибирование роста или бактериальный убийство, по переносимого TMC207 и ПА-824 7,21,22. Таким образом, в силу включения активированного угля в бактериологическим агаром, то КАРА не зависит от серийных разведений клеток и тестируемого агента.

КАРА может помочь предсказать бактериостатическое или бактерицидное воздействие реплицирующимися активов и бактерицидного воздействия недействующих активов тиражирование. В гбщая, то КАРА используется параллельно со стандартным MIC 90 анализов. Предсказательная сила CARA исходит из сравнения MIC 90 и результатов CARA (рисунок 2 и таблицу 1). При использовании для изучения анти-микобактерий агентов, то КАРА может точно предсказать активность, тиражирование бактерицидное (рис 4а), тиражирование бактериостатическое (рисунок 4б), не-тиражирование бактерицидное (рисунок 4в) или двойной активный (рисунок 4г). КАРА также допускает простую оценки деятельности жилого комплекса через обе дозы и времени. КОЕ анализы в одиночку требуют много усилий и материала для оценки активности соединения в широком диапазоне доз и времени, но задача становится управляемой , когда результаты Cara сузить диапазон условий, в которых соединение является доказуемо активным (Рисунок 5 ).

В то время как КАРА имеет полезность в изучении действиеНТИ-препараты на микобактерии, анализ имеет свои ограничения. КАРА имеет узкий динамический диапазон (2-3 log 10) и может не подходить для условий , в которых один предвосхищает не может быть больше , чем от 2 до 3 log 10 бактериальная убийство. Cara прогнозы требуют дальнейшего изучения с использованием более строгого и точный метод для перечисления числа бактерий, таких как КОЕ анализа. Эффект после антибиотиком некоторых антибактериальных, таких как PAS, может сбить с толку Cara в качестве интеллектуального инструмента различать между соединениями с бактерицидной и бактериостатической активностью в отношении репликации микобактерии 7.

Есть две рекомендации по улучшению качества CARA. Во-первых, нужно залить Cara микропланшетов быстро перед агара затвердевает, сохраняя при этом объемную точность и избежать разбрызгивания за пределы лунках. Независимо от количества пластин, мы рекомендуем сделать 0,5 до 1 л порций среды, чтобы помочь сохранить мedium в жидкой форме для продолжительности времени, необходимого для разлить в чашки. Изменение советы часто при заполнении микропланшетов со средой, используя частично избегает забитые советы. Во-вторых, необходимо свести к минимуму изменчивость следов искусственной флуоресценции между повторами. Микобактериальные микроколонии, в частности для патогенных микобактерий , таких как микобактерии туберкулеза, часто растут хаотично. Например, микроколонии, растущие на поверхности агара могут различаться по размеру, форме, высоте, или может простираться до внутренних стенок лунки микропланшета. Одна из проблем заключается, чтобы охватить все бациллы равномерно проявляющего реагента. Другим препятствием является то, что после того, как длительной инкубации при 37 ° C, твердое вещество бактериологическое среде CARA микропланшетов может стать сухой и склонной к поглощающие проявляющий реагент. Так как активированный уголь может связывать ресазурин и гасят флуоресценцию 7, могут быть вариации хорошо в скважине из - за сухих скважин поглощающие резазурин разработки раствора и активированного Charcoaл тушение флуоресценции ресазурин. Предварительное смачивание поверхности всех КАРА стрипы с PBS непосредственно перед добавлением проявляющий реагент уменьшает обе эти проблемы - проявляющий реагент достигнет все микобактериальные колонии в равной степени, и ресазурина остается безопасно над активированным углем. КАРА может иметь применение в идентификации и характеристике фенотипы мутантов микобактерий, или в средней пропускной способности обнаружения наркотиков анализов для других видов бактерий.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Там нет конфликта интересов по раскрытию информации.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны Кристин Бернс-Хуан на экспертизу рукописи и Дж Дэвид Уоррен (Weill Cornell Medical College) для помощи химии при разработке Cara. Эта работа была поддержана ускорительной программе лекарственным препаратам против туберкулеза Фонда Билла и Мелинды Гейтс, Эбби и Говарда программы P. Milstein в трансляционной медицины, а также исследовательское подразделение NIH ТБ (U19 AI111143). Отдел микробиологии и иммунологии поддерживается Херст Foundation. ССК была поддержана NIH грант K08AI108799.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Миддлбрук 7H9Бектон Дикинсон271310
Мидлбрук 7H11Бектон Дикинсон298810
Миддлбрук OADCБектон Дикинсон212351
BSA, тепловой шокRoche3118958001
активированный угольSigmaC5510
PBS, Ca2+ Dulbecco и Mg2+ freeLife Technologies / Invitrogen14190-144
tween 80SigmaP8074
тилоксаполSigmaT8761
нитрит натрияSigma2252
рифампицинSigmaR3501
6-бром-1H-индазол-3-аминАльфа АэсарH34095
фосфат калия моноосновный   SigmaP0662
сульфат магния, гептагидратSigmaM1880
цитрат железа и аммония SigmaF5879
сульфат цинка, гептагидратSigmaZ0251
хлорид аммония SigmaA9434
масляная кислота, жидкаяSigmaB103500
порошок резазуринаSigmaR7017
натрия хлорид Дж.Т. Бейкер4058-01 
Приготовленный раствор резазурина InvitrogenDAL1100
ПЦР наклейкиDenvilleB1212-5
спектрофотометрMolecular DevicesM5
96-луночный, культура тканей обработана микропланшетамиCorning3595
резервуары для реагентовVWR 89094-678
Пакеты из полиэтилена повторного использованияVWR 395-94602
14 мл Полипропиленовые тубы с круглым дномCorning 
50 мл коническая центрифужная пробиркаCorning352070
75 см<суп>2 Колба для клеточных культурCorning431464U
прозрачная, плоскодонная культура тканей обработана 96-луночным микропланшетомCostar3595
Prism 6 для OS XGraphPadhttp://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
352059

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nathan, C. Fresh approaches to anti-infective therapies. Sci. Transl. Medicine. 4 (140), 140-142 (2012).
  2. Gomez, J. E., McKinney, J. D. M. tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance. Tuberculosis (Edinb). 84, 29-44 (2004).
  3. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  4. Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. Lancet. , 497-500 (1944).
  5. Bryk, R., et al. Selective killing of nonreplicating mycobacteria. Cell Host Microbe. 3, 137-145 (2008).
  6. Gold, B., et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drug sensitizes Mycobacterium tuberculosis to endogenous and exogenous antimicrobials. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16004-16011 (2012).
  7. Gold, B., et al. Rapid, semi-quantitative assay to discriminate among compounds with activity against replicating or non-replicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 6521-6538 (2015).
  8. Gold, B., Warrier, T., Nathan, C. Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology. Parish, T., Roberts, D. 1285, Springer. 293-315 (2015).
  9. Warrier, T., et al. Identification of Novel Anti-mycobacterial Compounds by Screening a Pharmaceutical Small-Molecule Library against Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Infect. Dis. , 580-585 (2015).
  10. Zheng, P., et al. Synthetic Calanolides with Bactericidal Activity Against Replicating and Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Chem. Chem, J. .M. ed. , (2014).
  11. Darby, C. M., et al. Whole cell screen for inhibitors of pH homeostasis in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 8, e68942(2013).
  12. Darby, C. M., Nathan, C. F. Killing of non-replicating Mycobacterium tuberculosis by 8-hydroxyquinoline. J. Antimicrob. Chemother. 65, 1424-1427 (2010).
  13. de Carvalho, L. P., Darby, C. M., Rhee, K., Nathan, C. Nitazoxanide Disrupts Membrane Potential and Intrabacterial pH Homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. ACS Med. Chem. Lett. 2, 849-854 (2011).
  14. Xie, Z., Siddiqi, N., Rubin, E. J. Differential antibiotic susceptibilities of starved Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4778-4780 (2005).
  15. Grant, S. S., et al. Identification of novel inhibitors of nonreplicating Mycobacterium tuberculosis using a carbon starvation model. ACS Chem. Biol. 8, 2224-2234 (2013).
  16. Zhang, M., et al. Streptomycin-starved Mycobacterium tuberculosis 18b, a drug discovery tool for latent tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5782-5789 (2012).
  17. Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem. Biol. 7, 1190-1197 (2012).
  18. Cho, S. H., et al. Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compounds against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 51, 1380-1385 (2007).
  19. Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 92, 453-488 (2012).
  20. Rebollo-Lopez, M. J., et al. Release of 50 new, drug-like compounds and their computational target predictions for open source anti-tubercular drug discovery. PLoS One. 10, e0142293(2015).
  21. Tasneen, R., et al. Contribution of the nitroimidazoles PA-824 and TBA-354 to the activity of novel regimens in murine models of tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 129-135 (2015).
  22. Grosset, J. H., et al. Assessment of clofazimine activity in a second-line regimen for tuberculosis in mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 188, 608-612 (2013).
  23. Shiloh, M. U., Ruan, J., Nathan, C. Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay. Infect. Immun. 65, 3193-3198 (1997).
  24. Wang, F., et al. Identification of a small molecule with activity against drug-resistant and persistent tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2510-E2517 (2013).
  25. Wayne, L. G., Hayes, L. G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence. Infect. Immun. 64, 2062-2069 (1996).
  26. Barry, A. L., et al. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents: approved guideline. 19, National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1999).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

99

Похожие статьи