Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Боковой Хронический Черепно Окно Подготовка Включает В Vivo Наблюдение После Дистальный средней мозговой артерии у мышей Occlusion

11.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54701

⸱

29 декабря 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery and Center for Stroke-research Berlin (CSB), Charité-Universitätsmedizin, 2Department of Physics, University of California San Diego

В этой статье

Краткое содержание

Хирургическая окклюзия дистальной ветви средней мозговой артерии (МСАО), часто используется модель в экспериментальных исследованиях инсульта. Эта рукопись описывает основную технику постоянного MCAO, в сочетании с введением боковой черепной окно, которое дает возможность для продольной прижизненной микроскопии у мышей.

Аннотация

Очаговая мозговая ишемия (то есть, ишемический инсульт) , может привести к значительному травмы головного мозга, что приводит к серьезной потере функции нейронов и , следовательно , к хосту двигательных и когнитивных нарушений. Его высокая распространенность представляет серьезную опасность для здоровья, поскольку инсульт является одной из основных причин длительной нетрудоспособности и смерти во всем мире 1. Восстановление функции нейронов, в большинстве случаев, лишь частично. До сих пор, варианты лечения весьма ограничены, в частности , из - за узкого временного окна для тромболизиса 2,3. Определение методов для ускорения восстановления после инсульта остается главным медицинской целью; Тем не менее, это было затруднено из-за недостаточного механистической проникновением в процесс восстановления. Экспериментальные исследователи инсульта часто используют грызуна модели фокальной ишемии головного мозга. Помимо острой фазы, исследования инсульта все больше ориентируется на подострой и хронической фазы при ишемии головного мозга. Большинство исследователей инсульта применяют постоянный или транокклюзия масштабного коэффициента ЗВК у мышей или крыс. У пациентов, окклюзий MCA являются одними из наиболее частых причин ишемического инсульта 4. Кроме проксимального окклюзии MCA с использованием модели нити, хирургическая окклюзия дистальной MCA, вероятно, наиболее часто используемая модель в исследовании экспериментальной инсульта 5. Окклюзия дистальной (к ветвлением lenticulo-стриарных артерий) MCA ветви, как правило, запасные части стриатуме и в первую очередь влияет на неокортекс. Судно прикуса может быть постоянным или временным. Высокая воспроизводимость объема поражения и очень низким уровнем смертности по отношению к долгосрочному результату являются основными преимуществами этой модели. Здесь мы покажем, как выполнить хронический черепных окно (CW) подготовка латерального сагиттальной пазухи, а потом, как хирургическим путем вызвать дистальную инсульта под окном, используя краниотомии подход. Этот подход может быть применен для последовательной визуализации острых и хронических изменений, возникающих после ишемии черезэпи-освещения, конфокальной лазерной сканирующей и двухфотонную прижизненной микроскопии.

Введение

Инсульт является одной из основных причин длительной инвалидности и смерти во всем мире1, занимая второе место после ишемической болезни сердца. Кроме того, инсульт является основной причиной долгосрочной инвалидности, что подчеркивает его огромноесоциально-экономическое воздействие 6-8. Помимо лечения острых состояний, изучение новых подходов и механизмов для ускорения и улучшения восстановления после инсульта остается главной медицинской целью7.

За последние несколько десятилетий данные экспериментальных исследований инсульта внесли существенный вклад в понимание сложных патофизиологических каскадов, вызванных ишемией9,10. Эксайтотоксичность, апоптоз, периинфарктная деполяризация и воспаление были определены как наиболее значимые медиаторы гибели клеток после фокальной церебральной ишемии. Кроме того, с использованием животных моделей ишемии головного мозга были разработаны и проверены важные концепции, диагностические методы и терапевтические подходы (например, «полутень» и тромболизис)11.

Наличие экспериментальных моделей инсульта в сочетании с неинвазивными методами визуализации (например, магнитно-резонансной томографией (МРТ), компьютерной томографией или лазерным спекл-контрастным анализом) позволяет исследователю исследовать сверхострые и хронические патофизиологические изменения, вызванные ишемическим инсультом, в продольномнаправлении12. Наряду с изучением пространственно-временного профиля развивающегося поражения, можно исследовать изменения, напоминающие нейрональную пластичность, и коррелировать с функциональными исходами и гистологическими данными. В течение последних нескольких лет были достигнуты дальнейшие методологические достижения с использованием комбинации моделей ишемии головного мозга и микроскопии in vivo через краниальные окна13. Эти новые методы позволяют исследователям анализировать нервно-сосудистую единицу на клеточном и молекулярном уровне с большой аналитической силой в острой, подострой и хронической фазах после фокальной церебральной ишемии14. Кроме того, микроскопическая визуализация микроциркуляторной динамики in vivo выявила новые аспекты функции микроциркуляторного русла головного мозга и ангиоархитектуры, имеющие значительную патофизиологическую значимость15-17.

В этом протоколе мы представляем, как выполнить хроническую подготовку CW латерально к сагиттальному синусу и как хирургически вызвать дистальный инсульт под окном. Эта мышиная модель может быть применена для последовательной визуализации острых, подострых и хронических изменений после фокальной ишемии головного мозга с помощью эпиосвещения, конфокального лазерного сканирования и двухфотонной прижизненной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Эксперименты по предметам животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Landesamt FUER Gesundheit унд Soziales, Берлин, Германия (G0298 / 13) и ARRIVE критериев, в зависимости от обстоятельств. Для этого исследования, от 10 до 12-недельных самцов мышей C57BL / 6J были использованы.

1. Боковой Хронический Черепно Окно Подготовка

  1. Выполнение анестезии с подкожной инъекцией кетамина (90 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг). Тест для адекватного седации с болью раздражитель.
  2. Стерилизовать хирургических инструментов и операционного поля с 70% -ным этанолом.
  3. Удалите волосы головы от шеи до глаз, используя грызуна бритву.
  4. Зафиксируйте голову в стереотаксической раме.
  5. Используйте декспантенол глазную мазь на оба глаза, чтобы избежать обезвоживания.
  6. Очистите хирургическую область, чтобы удалить все волосы и стерилизовать его с 3-мя слоями 74,1% этанола и 10% 2-пропранолол.
  7. Выполнение средней линиинадрез от шеи до глаз скальпелем.
  8. Span лоскут кожи с 4 места для палаток швами.
  9. Удалите надкостницы тщательно на левом полушарии, очищая его с скальпелем до точки, где начинается височной мышцы.
    Примечание: Этот препарат также служит для создания хорошей адгезии к площади зубной клей, который фиксирует крышку стекла.
  10. Выполните лобно-теменной трепанацию черепа с диаметром 4 мм, за счет уменьшения толщины черепа на краю костного лоскута с использованием microdrill. Применение солевого раствора в процессе бурения, чтобы избежать травм тепла.
  11. Приподнимите костный лоскут с канюлей и удалить его с помощью microforceps.
  12. тщательно и интенсивно Промывать с физиологическим раствором.
  13. Смешайте зубной клей , пока он не имеет надлежащей последовательности и не является жидкостью (то есть, клей не должен производить темы больше). Поместите его на кости вокруг краниотомии.
  14. Поместите крышку стекла диаметром 6 мм на подготовленном клеем и закрепите его с помощью йе остальная часть зубной клей. Убедитесь, что она водонепроницаема. Подождите, пока клей не сушат и трудно проверив ее при помощи щипцов.
    Примечание: дополнительное орошение ускоряет процесс отверждения.
  15. Снять швы и места для палаток закрыть рану швами кожи.
  16. Подтяните кожу фланг мыши. Вставьте иглу подкожно и осторожно заменить 0,5 мл стерильного физиологического раствора подкожно для баланса жидкости.
  17. После операции, держать животных в клетке восстановления нагревают в течение 90 мин. Подождите, пока животные не полностью пробуждены, прежде чем покинуть их без присмотра. Подождите, пока животные не будут полностью восстановлены перед их возвращением в клетку с другими животными.
  18. Повторите подкожную подстановку объем физиологического раствора после того, как приблизительно 12 ч, как описано в пункте 1.16.
  19. Всегда применять обезболивание через желудочный зонд или непосредственно в полости рта после операции (например, парацетамол (10 мг / мл) или другие нестероидные противовоспалительные препараты).
  20. Проверить состояние животных каждый день после операции, и всегда обеспечивают пюре животную пищу на полу в чашку Петри, чтобы сделать пищу простым и избежать критической потери веса после операции.
    Примечание: Прижизненные микроскопия может быть выполнена в первый день после черепной подготовки окна.
  21. Применение изофлуран анестезии и зафиксировать животное в держателе головки. Откройте шовный материал кожи и очистить окно с ватными палочками и стерильным физиологическим раствором. Через 24 часа черепной окно должно быть заполнено спинномозговой жидкостью к тому времени точки, что позволяет визуализацию. Выполните визуализацию с использованием существующих протоколов микроскопии 18.

2. Дистальный MCAO

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура MCAO должна проводиться около 5 дней, после получения CW. Это сводит к минимуму помехи от иммунной реакции, вызванной препаратом CW с иммунной реакции, вызванной инсультом.

"SRC =" / файлы / ftp_upload / 54701 / 54701fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Обзор дистального МСАО. A. Это хороший обзор о судах до оп. B. Сосуды после первого биполярного контакта. С. Сосуды после второго биполярного контакта. D. Обзор о судах, которые полностью закрыты в настоящее время. E. Окончательный обзор с меньшим увеличением. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Анестезировать мышей с использованием маски анестезии и соответствующего обезболивающий режима в консультации с ветеринарным персоналом (например, индукция с 1,5 - 2% изофлуран и технического обслуживания с 1,0 - 1,5% изофлуран в 2/3 N 2 O и 1/3 O 2 через испарителем).
  2. Бритье и удалить волосы и дезинфицировать кожу и окружающие мех с соответствующим агентом (например, 70% этиловый спирт), и высушить его после этого.
  3. Поддерживать температуру тела мышей при 36,5 ° C ± 0,5 ° C во время операции. Обратной связи контролируется грелку, нагревают в соответствии с ректальной температуры мыши, настоятельно рекомендуется.
  4. Место животное в боковом положении. Закрепите нос в маске анестезии и регулировать изофлуран концентрации до 1,0 - 1,5%.
  5. Применяют влажную мазь (декспантенол) для обоих глаз.
  6. Используйте разрез кожи, сделанный для подготовки CW.
  7. Аккуратно отделить кожу и определить височной мышцы под ним.
  8. Отрегулируйте энергию высокочастотного генератора (5 - 7 Вт) и использовать биполярный режим.
  9. С помощью электрокоагуляции щипцами и осторожно удалите височную мышцу от черепа, создавая мышечный лоскут, не полностью удаления мышц.
  10. Определить MCA ниже прозрачного черепа в ростральной части височной области, спинные к ретро-Орбитал пазухи. Если раздвоение MCA не могут быть идентифицированы, пытаются идентифицировать судно наиболее ростральной.
  11. Тонкий череп выше ветви MCA с microdrill при непрерывном оросительной во избежание повреждения тепла.
  12. Поднимите кость с канюлей и удалить его с microforceps.
  13. Уменьшение энергии высокочастотного генератора до 3 - 5 Вт
  14. Подойдите к артерии сверху и нежно прикоснуться к ней с биполярных щипцов с обеих сторон без подъема судна.
  15. Коагулируйте артерию проксимально и дистально к развилке сосуда.
  16. Подождите 30 секунд, а затем нажмите артерию осторожно, чтобы гарантировать, что поток крови постоянно прерывается. Повторите электрокоагуляцию, если наблюдается реканализации.
  17. Закрепить височной мышцы с 1 или 2 стежков при вставке мышцы, чтобы покрыть дефект кости, если это возможно.
  18. Шовный рану и поместить животное в коробку восстановления с подогревом. В целом, восстановление животных быстро после летучего ANESThesia.
  19. Для замещения объема, наносят 0,5 мл стерильного физиологического раствора, подкожно, как описано в пункте 1.16.
  20. После операции, позволяет животным оставаться в клетке восстановления нагревают в течение 90 мин. Подождите, пока животные не сознают, прежде чем покинуть их без присмотра. Только вернуть их в клетку с другими животными, когда они полностью выздоровели.
  21. Повторите замену громкости, как описано в пункте 1.16, после 12 ч.
  22. Применяют послеоперационное обезболивание через питьевую воду (например, парацетамол (10 мг / мл) или другие нестероидные противовоспалительные препараты).
  23. Проверьте состояние здоровья животных каждый день после операции. Обеспечить растертый животной пищи в чашку Петри на полу, чтобы упростить питание и свести к минимуму потери веса в послеоперационном периоде.

3. Лечение Sham

  1. Выполните все процедуры идентично шаги 1 и 2, описанных выше, в том числе CW препарат, за исключением того, не слипаются обнаженную средней мозговой арTery.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сроки и репрезентативные результаты показаны на рисунках 2 и 3. Черепных препарат окно, с небольшим черепной окна сбоку от верхнего сагиттального синуса приводит к очень низкой смертности и заболеваемости скорости , когда выполняется опытным хирургом (рис 2 B, C, D). Все 10 животных выжили, и все хронические ХО может быть использован для получения изображения высокого качества, даже через 28 дней после операции. Там не было никаких пробл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Инсульт является одной из основных причин длительной нетрудоспособности и смерти во всем мире 1. Помимо острого лечения, исследования новых подходов и механизмов для ускорения и повышения восстановления после инсульта остается главным медицинская цель 7. Экспериментальные исследователи инсульта часто используют грызуна модели фокальной ишемии головного мозга. На самом деле, модели , индуцирующие переходные или постоянные MCAO имитируют один из наиболее распространенных видов очаговой ишемии головно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

VP является участником программы Charité Clinical Scientist Program, финансируемой Charité - Universitätsmedizin Berlin и Берлинским институтом здоровья. TB является стипендиатом SNSF PostDoc Mobility. Авторы получают грантовую поддержку от EinsteinStiftung/A-2012-153 для PV.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бинокулярный хирургический микроскопZeissStemi 2000 C
Источник света для микроскопаZeissCL 6000 LED
Грелка с ректальным зондомFST21061-10
Стереотаксическая рамкаKopfModel 930
Система анестезии для изофлуранаDraeger
IsofluraneЩипцы Abott
Dumont #5FST11251-10
Щипцы Dumont #7FST11271-30
Биполярные щипцыErbe20195-501
Биполярные щипцы Erbe                                                          20195-022
МикродрельФСТ                                                          18000-17                 
ИглодержательFST12010-14
5-0 шелковый шовный материалFeuerstein, Suprama
7-0 шелковый шовный материалFeuerstein,Suprama
8-0 шелковый шовный материалFeuerstein, Suprama
Ветеринарная восстановительная камераPeco ServicesV1200

Ссылки

  1. Mukherjee, D., Patil, C. G. Epidemiology and the global burden of stroke. World Neurosurg. 76 (6), Suppl 85-90 (2011).
  2. Ebinger, M., Prüss, H., et al. Effect of the use of ambulance-based thrombolysis on time to thrombolysis in acute ischemic stroke: a randomized clinical trial. JAMA. 311 (16), 1622-1631 (2014).
  3. Ebinger, M., Lindenlaub, S., et al. Prehospital thrombolysis: a manual from Berlin. J vis Exp. (81), e50534(2013).
  4. Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne Stroke Registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
  5. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
  6. Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
  7. Meairs, S., Wahlgren, N., et al. Stroke research priorities for the next decade--A representative view of the European scientific community. Cerebrovasc Dis. 22 (2-3), 75-82 (2006).
  8. Rosamond, W., Flegal, K., et al. Heart disease and stroke statistics--2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69-171 (2007).
  9. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  10. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22 (9), 391-397 (1999).
  11. Dirnagl, U., Endres, M. Found in Translation: Preclinical Stroke Research Predicts Human Pathophysiology, Clinical Phenotypes, and Therapeutic Outcomes. Stroke. , (2014).
  12. Prinz, V., Hetzer, A. -M., et al. MRI heralds secondary nigral lesion after brain ischemia in mice: a secondary time window for neuroprotection. J Cereb Blood Flow Metab. , (2015).
  13. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. (61), (2012).
  14. Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  15. Iadecola, C., Dirnagl, U. The microcircualtion--fantastic voyage: introduction. Stroke. 44 (6), Suppl 1 83(2013).
  16. Blinder, P., Tsai, P. S., Kaufhold, J. P., Knutsen, P. M., Suhl, H., Kleinfeld, D. The cortical angiome: an interconnected vascular network with noncolumnar patterns of blood flow. Nat Neurosc. 16 (7), 889-897 (2013).
  17. Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Drew, P. J., Nishimura, N., Schaffer, C. B., Kleinfeld, D. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  18. Cabrales, P., Carvalho, L. J. M. Intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window. J Vis Exp. (45), (2010).
  19. Rosell, A., Agin, V., et al. Distal occlusion of the middle cerebral artery in mice: are we ready to assess long-term functional outcome. Transl Stroke Res. 4 (3), 297-307 (2013).
  20. Dorand, R. D., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3 (2), (2014).
  21. Balkaya, M., et al. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  22. Balkaya, M., Kröber, J., Gertz, K., Peruzzaro, S., Endres, M. Characterization of long-term functional outcome in a murine model of mild brain ischemia. J Neurosci Methods. 213 (2), 179-187 (2013).
  23. Freret, T., Bouet, V., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: Usefulness of adhesive removal test. Beh Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
  24. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. RODENT STROKE MODEL GUIDELINES FOR PRECLINICAL STROKE TRIALS (1ST EDITION). J Exp Stroke Trans Med. 2 (2), 2-27 (2009).
  25. Florian, B., Vintilescu, R., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438 (2), 180-185 (2008).
  26. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
  27. Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke. 35 (7), 1720-1725 (2004).
  28. Shin, H. K., Nishimura, M., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
  29. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
  30. Gertz, K., Priller, J., et al. Physical activity improves long-term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase-dependent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow. Circ Res. 99 (10), 1132-1140 (2006).
  31. Dirnagl, U. Bench to bedside: the quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (12), 1465-1478 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vivointravitally
Боковой Хронический Черепно Окно Подготовка Включает В Vivo Наблюдение После Дистальный средней мозговой артерии у мышей Occlusion
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.