Здесь мы опишем протокол, направленный на изучение влияния отклоняющегося сплайсинга на лекарственной устойчивости в солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований. Для этой цели, мы проанализировали транскриптомных профили родительских и устойчивых в лабораторных моделях через Секвенирование РНК и создал метод , основанный QRT-PCR для проверки генов - кандидатов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
С помощью РНК-последовательности для обнаружения Novel сращивание Варианты, относящиеся к лекарственной устойчивости
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Устойчивость к лекарственным средствам остается главной проблемой в лечении рака для обоих гематологических злокачественных заболеваний и твердых опухолей. Характеристическая или приобретенное сопротивление может быть вызвано целым рядом механизмов, в том числе повышенной ликвидации наркотиков, снижение поглощения наркотиков, инактивацию наркотиков и изменения лекарственных мишеней. Последние данные показали, что помимо хорошо известной генетической (мутации, амплификации) и эпигенетических (гиперметилированием ДНК, гистонов посттрансляционной модификации) модификаций, механизмы устойчивости к лекарственным средствам также может регулироваться сплайсинга аберраций. Это быстро растущая область исследований, которая заслуживает внимания в будущем, чтобы планировать более эффективные терапевтические подходы. Протокол, описанный в этой статье, направлена на изучение влияния отклоняющегося сплайсинга на лекарственной устойчивости в солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований. Для этой цели, мы проанализировали транскриптомных профили нескольких моделей в пробирке через РНК-сл и установитьМетод, основанный Эду QRT-PCR для проверки генов-кандидатов. В частности, мы оценивали дифференциальный сплайсинг ddx5 и ПКМ транскриптов. Аберрантная сплайсинга обнаружен вычислительный инструмент MATS была подтверждена в лейкозных клетках, показывая, что различные варианты ddx5 сплайс выражены в резистентных клетках родительская против. В этих клетках, мы также наблюдали / соотношение PKM1 выше PKM2, который не был обнаружен в гемцитабин-резистентный аналог Рапс-1 по сравнению с родительскими клетками Рапс-1, что указывает на иной механизм лекарственной устойчивости, вызванной воздействием гемцитабина.
Введение
Несмотря на значительные успехи в лечении рака, резистентности злокачественных клеток к химиотерапии, либо собственной или приобретенной при длительном воздействии наркотиков, является основной причиной неэффективности лечения в широком диапазоне лейкемии и солидных опухолей 1.
Для того , чтобы очертить механизмы , лежащие в основе устойчивости к лекарственным средствам, экстракорпоральное модели клеточной линии разработаны ступенчатого подбора раковых клеток , резистентных к химиотерапевтическим агентам. Эта процедура имитирует режимы, используемые в клинических условиях и, следовательно, позволяет в глубине исследова....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Характеристика профилей резистентности к лекарственным средствам через цитотоксичность
- Лейкозных клеток линии культуры
- Поддерживать родительских Т-клеток ALL клеточной линии КВОР-CEM (CEM-WT), а также его лекарственно устойчивые сублиниях, включая СЕМ / R30dm, CEM-R5 и СЕМ-С3, в 25 см 2 в 10 мл среды RPMI-1640 , содержащей 2,3 мкМ фолиевая кислота с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка и 100 единиц / мл пенициллина G и 100 мкг / мл стрептомицина.
- Культуры клеток в увлажненной атмосфере при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе.
- Разрешить рост клеток в концентрации между 2 - 3 × 1....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Цитотоксичность , описанные в протоколе обеспечивают надежный и надежный метод для оценки устойчивости раковых клеток к химиотерапевтическим агентам в пробирке. С помощью МТТ-анализе, чувствительность к Dex была определена в четырех Т-ОЛЛ клеточных линий, в том числе Декс-чувствительных родительских клеток СЕМ-WT, а также три Декс-резистентных сублиниях: CEM / R30dm, CEM-R5 и СЕМ-С3. Два различных диапазоны концентрации должны были быть использованы из-за большой разницы в чувст.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы опишем новый подход, который сочетает в себе хорошо зарекомендовавшие себя методы скрининга цитотоксичности и мощный NGS на основе транскриптомики анализа для выявления дифференциальных сплайсинга событий по отношению к лекарственной устойчивости. Спектрофотометрические анализы удобные и надежные методы с высокой пропускной способностью для оценки лекарственной чувствительности в моделях рака в пробирке и представляют собой первый выбор для многих лабораторий , выполняющих цитотоксичности скрининги. По.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить признательность профессору Дж.Дж. Макгуайру, проф. Р. Кофлеру и д-ру К. Квинту за предоставление резистентных клеточных линий, использованных в этой работе. Исследование было основано на грантах Фонда Онкологического центра Амстердама (CCA) (JC, EG и RS), фонда KiKa (грант Children Cancer-free for AW), гранта юридической фирмы Питера Г. Ангелоса от Фонда прикладных исследований мезотелиомы (VEG и EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), и Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Сульфогодамин B | Сигма-Олдрич | 230162 | |
| трихлоруксусная кислота | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Манассас, Вирджиния, США | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Манассас, Вирджиния, США | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Базель, Швейцария | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Карлсбад, Калифорния, США 11875093 | ||
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота и теленка | Greiner Bio-One, Фрикенхаузен, Германия | 758093 | |
| пенициллина G стрептомицина сульфата | Gibco, Карлсбад, Калифорния, США 15140122 | ||
| Трис(гидроксиметил)-аминометан | Sigma Aldrich | 252859 | |
| МТТ формазан | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Нидерланды | 96-луночный УФ-Вид спектрофотометр | |
| Greiner CELLSTAR 96-луночные планшеты | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Раствор трипсина/ЭДТА 100 мл | Lonza, Базель, Швейцария | CC-5012 | |
| CELLSTAR Колбы для клеточных культур 25 см2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Германия | 82051-074 | |
| CELLSTAR Колбы для клеточных культур 75 см3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Германия | 82050-856 | |
| Фосфатный буферный раствор (NaCl 0,9%) | B.Braun Melsungen AG, Германия | 362 3140 |
Ссылки
- Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
- McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
