Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Развитие стволовых клеток, полученных из антиген-специфических регуляторных Т-клеток против аутоиммунитета

8.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54720

⸱

8 ноября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, The Pennsylvania State University College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем здесь метод разработки функциональных антиген-специфичных регуляторных Т-клеток (Tregs) из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) для иммунотерапии аутоиммунного артрита на мышиной модели.

Аннотация

Аутоиммунные заболевания возникают из-за потери иммунологической аутотолерантности. Регуляторные Т-клетки (Tregs) являются важными медиаторами иммунологической аутотолерантности. Tregs составляют около 5 - 10% от зрелого субпопуляции CD4 + Т - клеток у мышей и людей, с примерно 1 - 2% от тех Tregs , циркулирующих в периферической крови. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) можно дифференцировать в функциональную Tregs, которые имеют потенциал для использования в клеточной терапии аутоиммунных заболеваний. Здесь мы представляем метод для разработки антигена (Ag) Tregs из - специфических ИПСК (т.е. IPSC-Tregs). Метод основан на включении фактор транскрипции FoxP3 и антиген-специфические Т-клеточного рецептора (TCR) в ИПСК, а затем дифференцированием по OP9 стромальных клеток, экспрессирующих Notch лигандов дельта-подобный (DL), 1 и DL4. После дифференцировки в пробирке, в IPSC-Tregs экспрессировать CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3 и АГ-специфических TCR и способны реагировать на стимуляцию Ag.Этот метод был успешно применен к клеточной терапии аутоиммунного артрита в мышиной модели. Приемные передачи этих Ag-специфической иПСК-Tregs в Ag-индуцированного артрита (AIA) водоносного мышей обладает способностью снижать воспаление суставов и отек и предотвратить потерю костной массы.

Введение

Аутоиммунный артрит — это системное заболевание, характеризующееся гиперплазией синовиальной ткани и прогрессирующим разрушением суставного хряща, костей и связок1. Дефектное образование или функция Tregs при аутоиммунном артрите способствует хроническому воспалению и повреждению тканей, поскольку Tregs играют решающую роль в предотвращении развития аутореактивных иммунных клеток.

Манипуляция Tregs является идеальной стратегией для разработки методов лечения для подавления воспаления Ag-зависимым образом. Для иммунотерапии, основанной на Treg, специфичность переносимых Tregs важна для лечения текущего аутоиммунитета2. Чтобы проявить подавляющую активность, Tregs должны мигрировать и удерживаться в пораженной области, что может быть обусловлено специфичностью TCR для Ag в этом месте3. Несмотря на то, что поликлональные Tregs могут содержать небольшую популяцию, содержащую эту Ag-специфичность из их TCR, количество этих Ag-специфичных Tregs обычно невелико. Следовательно, клеточная терапия с использованием поликлональных Tregs против аутоиммунных заболеваний требует адоптивного переноса большого количества Tregs4,5. Поскольку плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) обладают способностью развиваться в любой тип клеток, Ag-специфичные ПСК-Треги могут оказаться хорошими кандидатами для иммунотерапии на основе Treg. Предыдущие исследования показали успешное развитие Т-клеток, полученных из ПСХ, в том числе Tregs6-8.

Здесь мы описываем протокол для разработки Ag-специфичных iPSC-Tregs. Далее мы опишем клеточную терапию аутоиммунного артрита на мышиной модели с использованием таких Tregs. Этот метод основан на генетической модификации мышиных ИПСК с Ag-специфичными TCR и транскрипционным фактором FoxP3. Затем сконструированные иПСК дифференцируются в Ag-специфичные Tregs на стромальных клетках OP9, экспрессирующих молекулы лигандов Notch DL1, DL4 и MHC-II (I-Ab) в присутствии цитокинов mFlt3L и mIL-7. Эти Ag-специфичные iPSC-Tregs могут продуцировать супрессивные цитокины, такие как TGF-β и IL-10, при стимуляции Ag, а адоптивный перенос таких Tregs обладает способностью подавлять развитие AIA в мышиной модели. Описанный протокол может быть использован для разработки Ag-специфичных Tregs, полученных из стволовых клеток, для потенциальных терапевтических вмешательств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных одобрены Университета штата Пенсильвания колледжа медицины животных комитета Care (IACUC протокол № 45470) и проводятся в соответствии с руководящими принципами ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных.

1. стволовой клетки культуры

  1. Инкубировать 10 см чашку с 10 мл 0,1% желатина в течение не менее 30 мин при 37 ° С (инкубатор) для того, чтобы покрыть пластины.
  2. Удалить желатин из чашки и пластины 3 х 10 6 облучают SNL76 / 7 клеток и инкубируют в течение одного дня при температуре 37 ° С (инкубатор) с использованием 10% DMEM среды (10% FBS и 1% пенициллина стрептомицин).
  3. Извлеките носитель из пластины и культуры оттаивают ИПСК над / 7 слой фидера клеток SNL76 с использованием IPSC СМИ (DMEM среде, содержащей 15% фетальной телячьей сыворотки, 0,1 ммоль / л несущественные аминокислоты, 1 ммоль / л L-глутамина, и 0,1 ммоль / л β-меркаптоэтанол) 9. Элементная литий мышь ИПС-MEF-Нг-20D-17пе, который индуцируется из эмбриональных фибробластов мыши по ретро вирусной трансфекции Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус, был получен от доктора Яманака (Институт пограничных медицинских наук, Университета Киото, Киото, Япония).
  4. Изменение носителя на 3-й день со свежей средой и наблюдать IPSC колонии под микроскопом.
    Примечание: Эти колонии маленькие, блестящие кластеры или круглые клетки с четкой демаркации показывает экспрессию GFP под флуоресцентным микроскопом.

2. Экстракорпоральное Дифференциация Ag-специфических IPSC-Tregs

  1. Генерирование конструкции , которые будут использоваться в ретровирусной трансдукции сублимитами клонировании генов ОТ-II TCR и FoxP3 в плазмиду MIDR 10 , связанного с саморасщепляющиеся пептидной 2А , чтобы сделать MIDR-TCRα-2A-TCR & beta ; -2A-FoxP3 конструкцию.
  2. Выполнение ретровирусной трансдукции 9 из ИПСК с использованием Plat E клеток в качестве упаковочной клеточной линии.
  3. В день 0 клетки семян OP9-DL1-DL4-IA B Aта минимальная плотность 10 4 клеток / см 2 с помощью OP-9 средств массовой информации (α-MEM носитель , содержащий 20% FCS и 2,2 г / л бикарбоната натрия. Пластина 1 × 10 6 клеток на 10 см чашку.
  4. На 3 -й день, когда клетки OP9-DL1-DL4-IA б становятся 80-90% сплошности, удалите носитель и семян 0,5 - 1 х 10 5 ИПСК над OP9-DL1-DL4 - IA В - клеток в ОП-9 средах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это устанавливает совместное культивирование ИПСК на клетках OP9-DL1-DL4-IA б и считается день 0 дифференциации 9.
  5. На 5-й день, удалить носитель из 10 см чашку путем аспирации, промыть клетки с 10 мл 1x PBS и аспирация PBS. Добавляют 4 мл 0,25% трипсина и инкубировать при 37 ° С в течение 10 мин. Добавить еще 8 мл иПСК сред к клеткам, повторно приостанавливать их, и центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    1. Аспирата супернатант и повторно приостанавливать клеток в 10 мл иПСК сред. Выдержите эти ресуспендировали клетки на свежий 10 см чашкуи вернуться в инкубаторе в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите б фидерные клетки OP9-DL1-DL4-IA и держать дифференцирующие ИПСК плавающие в средствах массовой информации. Поддерживайте клетки OP9-DL1-DL4-IA б непрерывно достичь 80 - 90% слитности для дальнейшего сотрудничества культуры.
    2. Через 30 мин собирают плавающих клеток, фильтровать их через клеточный фильтр 70 мкм, и подсчет клеток с помощью гемоцитометра.
  6. Семя 5 х 10 5 ИПСК к новому 80 - 90% сплошности клеток OP9-DL1-DL4-IA б в OP9 средах. Дополнение СМИ с mFlt-3L при конечной концентрации 5 нг / мл.
  7. На 8-й день, собирают частично дифференцированные ИПСК путем промывания планшета со средствами массовой информации от самой чашки с помощью 10 мл пипетки. Используйте еще 5 мл ОП-9 средств массовой информации в блюдо, чтобы аккуратно смыть полу-прилипшие клетки путем тщательного, силового пипеткой так, чтобы не нарушать OP9 монослой на дне тарелки. Повторите мыть с 10 мл PBS, чтобы собрать все полуприцеп объявлениерентны дифференциации клеток.
    1. Объединить оба мойками, центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, вновь приостановить в 10 мл OP9 сред, содержащих mFlt-3L (5 нг / мл) и Mil-7 (1 нг / мл), и фильтруют через 70 мкм клеточный фильтр.
  8. Передача клеток в культуральную пластину 6-луночный , содержащей 80 - 90% сплошности OP9-DL1-DL4-IA В - клеток, что и на шаге 1.1. Передача клетки собирают из одного 10 см чашку в одну лунку 6-луночного планшета.
  9. На 10-й день, смена половины сред от клеток к свежей OP9 среде с mFlt-3L (5 нг / мл) и Mil-7 (1 нг / мл). Повторите этот шаг каждые два дня.
  10. Каждые 4-6 дней, в зависимости от роста, повторно семена дифференцирующие иПСК на чашки со свежим слоем клеток OP9-DL1-DL4-IA B, как описано в пункте 1.1.

3. Оценка In Vitro Treg дифференцировке и созревании

  1. Морфологические изменения дифференцирующих ИПСК.
    1. Monitor совместное культивирование ИПСК с клетками OP9-DL1-DL4-IA б каждый день путем наблюдения живых клеток под обычным микроскопом светлопольному (20Х). К 5-й день, наблюдать колонии с мезодермы, как характеристики, такие как уплощенных клеток. На 8-й день, наблюдать небольшие, круглые скопления клеток, которые представляют дифференцирующие клетки.
    2. Используйте метод трипанового синего для подсчета клеток, чтобы определить количество и процент живых клеток. Рассчитать жизнеспособность клеток, как количество жизнеспособных клеток, деленное на общее число ячеек в пределах четырех сеток на гемоцитометра. Если клетки принимают трипановым синим, считают их мертвым или нежизнеспособным. Регистрируют количество живых клеток, полученных из культуры.
  2. Проточная цитометрия анализ дифференциации ИПСК.
    1. В дни, 5, 7, 11, 15, 19, 21, и 28 сокультивирования, удалить клетки с 0,25% трипсина, как на стадии 25.
    2. До поверхности окрашивания с различными флуорохромом конъюгированные антитела, incubatе 1 х 10 6 клеток с 100 мкл Fc блокатора 2.4G2 разведенного в PBS (конечная концентрация 10 мкг / мл) при 4 ° С в течение 20 мин , чтобы предотвратить связывание антитела с Fc - рецептором на поверхности клетки.
    3. В дни , 5, 7, 11, 15, 19, 21, и 28, используют 1 × 10 6 клеток для проточной цитометрии с различными флуорохромом-конъюгированные антитела , чтобы обнаружить маркеры клеточной поверхности, включая CD3, TCR & beta ; , CD4, CD8, CD25, и CTLA4.
    4. После Fc блока, промыть клетки с 10 мл PBS и пятна с различными флуорохромом конъюгированные антитела в течение 20 мин при температуре 4 ° С, а затем выполнить анализ проточной цитометрии с 15-цвет проточном цитометре. Используйте 0,200 мкг антитела на 10 6 клеток разведенных в 100 мкл PBS.
    5. На 28 -й день, анализируют клетки с помощью проточной цитометрии 11 и ворот на CD4 CD8 - клеток + + с использованием CD4 и CD8 Флуорохром-конъюгированные окрашивание; анализировать для выражения TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4 И FoxP3 (Рисунок 1). Для FoxP3 окрашивания, фиксации клеток и permealize их , а затем выполняют с использованием меченых антител 11.
  3. В пробирке антигена стимуляции ИПСК.
    1. На 28-й день совместного культивирования, урожай Ipsc-Tregs из культур путем сбора плавающих клеток. Trypsinize остальные клетки с 0,25% трипсина (как на шаге 2.5) и повторно приостанавливать клеток в 8 мл иПСК сред. Центрифуга в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре, аспирация СМИ, и снова повторно приостанавливать клеток в 10 мл среды.
      1. Инкубируйте ресуспендировали клетки в новую 10 см чашку при 37 ° С в течение 30 мин и собирают плавающих клеток. Вымойте клетки с холодным PBS.
    2. Выдержите 3 х 10 6 спленоцитов от селезенке мышей C57BL / 6 RAG1 - / - мышей с 5 мкМ овальбумина пептида в 200 мкл среды (OVA 323-339) при температуре 4 ° С в течение 30 мин в 96 - луночный планшет 11.
    3. Смешайте Tregs с OVA 323-339 -pulsed спленоцитов в соотношении 1: 4 (используйте 0,75 × 10 6 Tregs). Инкубируют при 37 ° С в СО 2 инкубаторе в течение 40 ч. В течение последних 4 ч, добавляют 4 мкл разбавленного брефелдин А в культуре (фактическая концентрация 1,000x, разведенного в культуральной среде 1x).
    4. Урожай клетки с 0,25% трипсина (как на шаге 2.5), промывают 10% NaN 3 и 0,5 М раствора ЭДТА (FACS - буфер), блок 100 мкл разведенных (конечной концентрации 10 мкг / мл) , Fc - блокатора 2.4G2 и красителем для поверхностных маркеров, CD4, CD8, TCRVα2 и TCRVβ5, как на этапах 3.2.3-3.2.4.
    5. Закрепить клетки с 4% раствором параформальдегида в PBS и проницаемыми 100 мкл 1х пермеабилизации буфера после окрашивания поверхности клетки. Внимание! Параформальдегид аллергенным, канцерогенным и токсичным.
    6. Пятно клетки с флуорохромом-конъюгированные TGF-бета и IL-10 в течение 20 мин в темноте. Используйте 0,200 мкг антитела / 10 6 клеток dilutе изд в 100 мкл PBS. Обнаружить внутриклеточный производство TGF-бета и IL-10 с 15-цвет проточном цитометре (рисунок 2).
    7. Промыть клетки три раза холодным FACS буфером до анализа методом проточной цитометрии 11.
  4. В естественных условиях сохранения Ag-специфической иПСК-Tregs.
    1. Через 8 дней совместного культивирования клеток на OP9-DL1-DL4-IA б, передавать Ipsc полученный предварительно Tregs (Thy1.2) , как на шаге 3.3.1 в Твоими 1.1 конгенных мышей (4-6 недель) через инъекции вены хвоста без анестезии. Перед проведением инъекции в хвостовую вену, расширяются хвостовую вену с использованием инфракрасной лампой в течение 5 мин. После того, как в хвостовую вену дилатации, поместите курсор в фиксатор и адаптивно передачи 3 × 10 6 клеток ресуспендировали в 200 мкл PBS путем инъекции через хвостовую вену.
    2. Через шесть недель после переноса Treg, эвтаназии мышей СО 2 удушья с последующим смещением шейных позвонков. Убедитесь в том, что милисе не дышит. Открыть в брюшную полость, разрезав внешнюю оболочку брюшины с помощью ножниц и щипцов и осторожно потянув ее назад, чтобы обнажить внутреннюю кожу накладки в брюшную полость. Изолировать селезенки и периферических лимфатических узлов закачанного Thy 1.1 конгенных мышей.
    3. Собирают клетки из селезенки и лимфатических узлов с использованием механического нарушения для получения суспензии отдельных клеток. Инкубируйте клетки с 5 мл ACK буфера для лизиса в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы лизировать красные кровяные клетки. Сбор и мыть оставшиеся спленоцитов или лимфоциты с 10 мл холодного буфера FACS.
    4. После мытья, лечения клеток с блокаторами 2.4G2 Fc при 4 ° С в течение 20 минут, как в шаге 3.2.2 и пятна с 100 мкл разбавленных флуорохромом-конъюгированные анти-Thy 1.2 антител.
    5. Промыть клетки с 10 мл буфера FACS и перейти к анализа проточной цитометрии 11.

4. В Vivo Созревание и подавление аутоиммунного артрита

  1. Генерирование конструкции, как в шаге 2.1.
  2. Выполните ретровирусов трансдукции 9 , как в шаге 2.2.
  3. В естественных условиях и дифференцировки индукции артрита у мышей.
    1. Дифференцирование ОТ-II TCR / FOXP3-трансдуцированных ИПСК (ОТ-II-FOXP3 / ИПСК), FOXP3-трансдуцированных иПСК, и DsRed трансдуцированных иПСК на б стромальных клеток OP9-DL1-DL4-IA в присутствии цитокинов mFlt-3L и Mil-7 в течение 8 дней, как описано в пунктах 2.1 - 2.6.
    2. Trypisinize все три вида клеток от 10 см пластины и повторно приостанавливать клетки от каждого 10 см пластины в 10 мл свежей среды. Добавьте клетки в свежую 10 см Столешница и вернуться в инкубаторе в течение 30 мин. Через 30 мин собирают плавающие клетки.
    3. Проходят клетки через клеточный фильтр 70 мкм для удаления клеточных кластеров и подсчета использованием гемоцитометра. Отрегулировать клеток до концентрации 1,5 х 10 7 клеток / мл в холодном PBS и фильтруют снова , если это необходимо. Держите клетки на льду до передачи приемному клеток в мышей.
    4. Вводят 200 мкл клеточной суспензии (3 × 10 6 клеток) на три различные группы 4 - 6-недельных самок / 6 мышей C57BL через хвостовую вену , как это описано в пункте 3.4.1
    5. На 10-й день после переноса клеток, вводят мышам 100 мкг с помощью программы MBSA, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда у основания хвоста с помощью шприца на 1 мл.
    6. На 17-й день, обезболить мышей с использованием изофлуран испарителя (в соответствии с директивами IACUC). Использование 4 - 5% изофлуран для индукции и 1 - 2% на техническое обслуживание. Индуцируют артрит путем инъекции внутрисуставной 20 мкг с помощью программы MBSA в 10 мкл PBS в левом коленном суставе и 20 мкг с помощью программы MBSA и 100 мкг OVA всего в 10 мкл PBS в правом коленном суставе. Пищевая и gelpack могут быть размещены на напластования полу после того, как артрит разработал. Мыши будут умерщвлены: Body Состояние Оценка (BCS) в 2/5 или умирающей, тяжелой кахексии и / или постоянные лежачее (период 24-ч), и тяжесть оценка 4. В счет4, эритема и сильный отек охватывает лодыжки, стопы и цифры, или ankyloses конечности.
  4. Определение характеристик OT-II TCR / FOXP3-трансдуцированных ИПСК.
    1. С помощью флуоресцентного микроскопа (20х) для визуализации нефиксированных живых DsRed + GFP + клеток.
    2. Изучение интеграции и экспрессии генов с помощью как Вестерн - блоттинга и проточной цитометрии 11.
  5. Развитие Трег и созревание.
    1. Через 2 недели, 4 и 6 после клеточного переноса, эвтаназии мышей. Для эвтаназии, в каждой клетке использовать 1 - 2 л СО 2 в первой стадии. После того , как животное потеряло сознание, увеличивают скорость потока СО 2 до 4 - 5 л / мин. Эвтаназии мышей CO 2 ингаляции. Изолировать селезенку и слейте лимфатические узлы, разрезав внешнюю оболочку брюшины с помощью ножниц и щипцов и осторожно потянув ее назад, чтобы обнажить внутреннюю кожу накладки в брюшную полость.
    2. Соберите одноклеточной суспензии пром селезенки и лимфатических узлов по механическому разрушению с использованием сетчатого фильтра клеток и 1 мл шприц в 1% IPSC СМИ. Центрифуга коническую пробирку, содержащую питательные среды в 400 г в течение 5 мин. Повторное приостановить осадок клеток в 5 мл буфера для лизиса ACK лизировать эритроциты. Повторно центрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Повторное приостановить осадок клеток и мыть оставшиеся спленоцитов или лимфоциты с холодным буфером FACS. Выполните шаги 3.4.4 - 3.4.5 и перейти к анализу потока цитометрии.
  6. Внутриклеточное окрашивание.
    1. На 50 день после заражения, изолировать селезенку и слейте лимфатические узлы мышей (как на этапе 4.5.1) после того, как euthanization СО 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков.
    2. Собирают одноклеточной суспензии клеток из селезенки и лимфатических узлов путем механической поломки с использованием сетчатого фильтра клеток и 1 мл шприца. Выдержите спленоцитов при комнатной температуре в течение 5 мин с 5 мл буфера для лизиса ACK лизировать эритроциты. Сбор и мыть оставшиеся Splenocytes или лимфоциты с холодным буфером FACS. Выполните шаги 3.2.3 - 3.2.4, но пятно с поверхностными маркерами CD4, CD8, CD25 и TCRVβ5.
    3. Продолжайте фиксировать клетки для внутриклеточного окрашивания , как описано в 3.3.5 - 3.3.7 и анализа внутриклеточной продукции цитокинов (TGF-бета и IL-10) из IPSC-производного Tregs и ворота на живом CD4 + CD25 + клеток.
  7. Проникновение Ag-специфических Tregs в коленях и подавление артрита.
    1. Следующие шаги (4.3 - 4.3.6) в дни 7 - 14 после индукции артрита, усыпить мышей СО 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков ( в соответствии с директивами IACUC). Удалить волосы с колен с электрической машинки для стрижки и акцизный колени с помощью хирургической процедуры.
    2. Снимите кожу с ног, сделав надрез в задней ноги с тупым концом ножниц и разрезают кожу через бедро и вплоть до лодыжки. Аккуратно отделите кожу над голени и стопы, чтобы обнажить мышцы. Удалитьмышцы от ноги осторожно, не повреждая коленного сустава.
      1. Обрежьте заднюю ногу чуть выше таза / тазобедренного сустава и вырезать большую берцовую кость с помощью острых ножниц рассекает.
    3. Закрепить колени в 4% формалине в течение 48 часов. Декальцинировать колени, используя 2,5 М муравьиной кислоты; полоскание трижды в ксилоле в течение 3 мин, полоскать дважды в 100% -ном этаноле, дважды полоскание в 95% -ном этаноле, дважды полоскание в деионизированной воде в течение 2 мин, а накипь в 1 мМ ЭДТА. Treat при температуре к югу кипения (90 ° С) в течение 20 мин.
    4. Охлаждают неподвижную ткань в течение 30 мин. Промойте его с 1x PBS в течение 4 мин и вставить ее в парафин. Обезвоживает ткани с помощью ряда этанола ванн для вытеснения воды, а затем пропитать воском. Затем встраивать инфильтрации тканей в восковых блоков. Выполнение вертикальной и горизонтальной секционирования для окрашивания. Приготовьте 4 мкм секций с выдвижным микротома.
    5. Выполните иммунофлуоресцентного окрашивания на участках после стандартных процедур deparaffiнизация и регидратации с использованием ксилола и этанола 12.
    6. Блок эндогенной пероксидазной активностью, погрузив стекло в достаточном количестве 3% раствора перекиси водорода в течение 3 мин после извлечения Ag. Блок-горок для неспецифического связывания в 3% БСА в PBS при комнатной температуре в увлажненной камере в течение 60 мин.
    7. Пятно секции с 200 мкл флюорохром-конъюгированные TCRVβ5 антитела, разведенного 1: 100 в блокирующем растворе. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре в 75 - увлажненной камере 100%, и промыть 5 раз в 1x PBS в течение 5 мин.
    8. Контрастное слайды для ядерного окрашивания с antifade реагентом, содержащим DAPI. Добавить приблизительно 300 мкл разведенного раствора для окрашивания DAPI (300 нМ в 1x PBS) с покровным, убедившись, что весь покровное покрыта. Храните слайды в темноте при 4 ° С до проведения анализа под флуоресцентным микроскопом (рисунок 3).
  8. Анализ подавления артрита
    1. Измерьте отек обоих колен мышей до индукции артрита с помощью коммутируемого штангенциркулем, чтобы установить базовый уровень.
    2. Выполните шаги (4.3 - 4.3.6) для индукции артрита и передачи Treg. Измерить колени мыши с набором калибра передачи штангенциркуль пост-Treg.
    3. Вычислить процентное увеличение диаметра колена: процентное увеличение = (диаметр колена на 1-й день - диаметр колена на 0-й день) / диаметр колена на 0-й день.
  9. Измерение деструкции суставов и инфильтрация воспалительных клеток в коленях гистологически (рис 4).
    1. На 7-й день после индукции артрита, усыпить мышей, как описано выше, и акцизным колени с помощью хирургической процедуры. См шаг 4.7.1 - 4.7.2.
    2. Закрепить колени в 4% формалине, накипь в ЭДТА, и встраивать в парафин. См шаг 4.7.3
    3. Удалить оба колена, фиксируют в 10% формалине и отвердевают в Formical-4. Встраивание ткани в парафин разделе на 4 мкм, и пятно с hematoxylв и эозином (H & E) или окрашивания Safranin O (как на шаге 4.7.7) и наблюдать под микроскопом.
    4. Используйте H & E окрашивание для оценки эрозии кости с полуколичественного балльной системе (0: нет эрозий; 4: расширенные эрозий и разрушение костной ткани). С помощью окрашивания Safranin O, чтобы оценить потерю протеогликанов и оценка с полуколичественного балльной системе (0: без потери протеогликанов; 3: полная потеря окрашивания для протеогликанов).
      1. Используйте полуколичественного систему подсчета очков, чтобы выиграть воспалительная инфильтрация клеток на H & E окрашенных слайдах (0: нет инфильтрацию, 4: изобиловали инфильтрацию). Оценка баллов, исследуя оба колена слепым методом.

5. Измерение потери костной ткани в коленках с высокой разрешающей способностью микро-компьютерной томографии (микро-КТ) системы

  1. На 10-й день после индукции артрита, анестезию мышей с 2% изофлуран и подготовить для работы с изображениями.
  2. Положение микрофонае колени обращены вверх в камере.
  3. С помощью системы микро-КТ с высоким разрешением , чтобы приобрести в естественных изображений архитектуры кости вокруг коленей мышей.
  4. Выполните микро-КТ с длиной 2,2 мм, в том числе мыши коленных суставов со следующими параметрами: 10,5 мкм размер воксела при 55 кВ, 145 мкА 200 мсек времени интегрирования, 211 изображений.
  5. Импорт микро-КТ изображений и захвата фронтальной плоскости изображения после дальнейшей обработки изображений (объем рендеринга и преобразования) (рисунок 5).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Как показано здесь, на 28-й день, Ag специфические Tregs существенно выражены CD3 и Ag-специфический TCR, два маркера Т-клеток. Население CD3 + TCRVβ5 + выражается CD4. Большинство клеток CD3 + TCRVβ5 + CD4 + CD25 также выраженными, CD127 и CTLA-4, которые , как правило , выраженные при повышенных уровнях в природных T (nTregs регистры) , и в Т - клетках , экспрессирующих FoxP3 эктопически. Выражение FoxP3 в IPSC-клеток , ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе, важным шагом является дифференциация в пробирке TCR / FOXP3 ген-трансдуцированных ИПСК. В пробирке передача сигналов Notch индуцирует развитие к клеточной линии Т. Чтобы дифференцировать ИПСК в CD4 + FoxP3 + Tregs, мы использовали клетки б OP9-DL1 / DL4 / IA, которые высоко экспресс MHC II (IA б) молекулы. Большинство ИПСК дифференцировке в клетки CD4 +. Тем не менее, после выражения ТКР поверхности, многие дифференцированные пред...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Этот проект был профинансирован, в частности, в рамках грантов от Национального института здоровья (R01AI121180, R21AI109239 и K18CA151798), Американской ассоциации диабета (1-16-IBS-281) и Пенсильвании Департамент здравоохранения (Табак Расчетно фонды) в JS

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
C57BL/6j мышиJackson Laboratory664
B6.129S7 Rag1tm1Mom/JJackson Laboratory2216
Anti-CD3 (2C11) антителоBD Pharmingen553058
Anti-CD28 (37.51) антителоBD Pharmingen553295
Anti-CD4 (GK1.5) антителоBiolegend100417
Anti-CD8 ( 53– 6.7) антителоBiolegend100714
антитело Anti-CD25 (3C7) Biolegend101912
Anti-TCR-β (H57597) антителоBiolegend109220
Anti-IL10Biolegend505010
Anti-TGFβBiolegend141402
DMEMInvitrogenABCD1234
α-MEMInvitrogenA10490-01
FBSHycloneSH3007.01
Brefeldin ASigmaB7651
PolybreneSigma107689
GenejammerIntegrated science204130
ACK Lysis bufferLonza10-548E
mFlt-3Lpeprotech250-31L
mIL-7peprotech217-17
ЖелатинSigmaG9391
ПараформальдегидSigmaP6148-500GВнимание: Аллергенный, канцерогенный, токсичный
буфер для пермеабилизацииBiolegend
mBSASigmaA7906
Ova альбуминAvantor0440-01
CFADifco2017014
Тейлвейнер ТейлвейнерBraintree scientificRTV 150-STD
421002

Ссылки

  1. Firestein, G. S. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 423, 356-361 (2003).
  2. Ferraro, A., et al. Interindividual variation in human T regulatory cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).
  3. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
  4. van Herwijnen, M. J., et al. Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).
  5. Wright, G. P., et al. Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).
  6. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  7. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105, 1431-1439 (2005).
  8. Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells. Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).
  9. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. J Vis Exp. , e3986(2012).
  10. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).
  11. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).
  12. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. , (2007).
  13. Lu, L., et al. Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).
  14. Wu, C., et al. Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells. Immunity. 41, 270-282 (2014).
  15. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).
  16. Ramos, C. A., et al. An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies. Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).
  17. Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development. Arthritis Res Ther. 12, R66(2010).
  18. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).
  19. Kim, Y. C., et al. Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses. Blood. 125, 1107-1115 (2015).
  20. Himburg, H. A., et al. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat Med. 16, 475-482 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

T-регуляторные клеткиполученные из стволовых клетокантигенспецифические T-регуляторные клеткидифференцировка иПКстромальные клетки OP9экспрессия FoxP3трансдукция TCRадоптивный переносаутоиммунный артритвоспаление суставовпотеря костной ткани
Развитие стволовых клеток, полученных из антиген-специфических регуляторных Т-клеток против аутоиммунитета
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.