Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высоким содержанием жира Кормление Paradigm для личинок данио рерио: Кормление, Живая съемка и Количественная приема пищи

10.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54735

⸱

27 октября 2016 г.

 , 
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science, 2Department of Biology, Johns Hopkins University

В этой статье

Краткое содержание

Рыбки данио-рерио становятся ценной моделью обработки липидов в пище и метаболических заболеваний. Описаны протоколы кормления личинок, богатых липидами, визуализация в реальном времени пищевых флуоресцентных аналогов липидов и количественная оценка потребления пищи. Эти методы могут быть применены к различным методам скрининга, визуализации и исследования, основанного на гипотезах.

Аннотация

Данио-рерио становятся моделью пищевой переработки липидов и метаболических заболеваний. В этом протоколе описывается, как кормить личинок данио-рерио богатой липидами пищей, которая состоит из эмульсии липосом куриного яичного желтка, созданной путем ультразвукового обработки яичного желтка в эмбриональной среде. Приведены подробные инструкции по скринингу личинок на предмет потребления яичного желтка, чтобы личинки, которые не питаются, не искажали результаты экспериментов. Липосомы куриного яичного желтка могут быть наполнены флуоресцентными аналогами липидов, включая жирные кислоты и холестерин, что позволяет как системно, так и субклеточно визуализировать процесс обработки липидов с пищей. Описано несколько методов посадки личинок, которые способствуют краткосрочной и долгосрочной визуализации в реальном времени как с прямыми, так и с перевернутыми объективами при большом и малом увеличении. Кроме того, представлен анализ для количественной оценки потребления пищи личинками путем экстракции липидов личинок, получающих флуоресцентные аналоги липидов, обнаружения липидов на тонкослойной хроматографической пластине и количественного определения флуоресценции. Наконец, обсуждаются критические аспекты процедур, важные элементы контроля, варианты модификации протоколов для решения конкретных экспериментальных вопросов и потенциальные ограничения. Эти методы могут быть применены не только к целенаправленным, основанным на гипотезах исследованиям, но и к различным скринингам и методам визуализации в реальном времени для изучения метаболизма липидов в рационе и контроля потребления пищи.

Введение

Механизмы, с помощью которых кишка регламентирует диетическую обработку липидов, печень контролирует сложный синтез липидов и липопротеинов обмен веществ, и как эти органы работают с центральной нервной системой, чтобы контролировать потребление пищи не полностью поняты. Это биомедицинской интерес для выяснения этого биологии в свете нынешних эпидемий ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний, диабета и неалкогольного жировой болезни печени. Исследования в культуре клеток и мыши обеспечили большую часть нашего понимания механистических отношений между диетическими липидов и болезни, и данио (Danio rerio) появляются в качестве идеальной модели , чтобы дополнить эту работу.

Рерио имеют аналогичные органы желудочно - кишечного тракта (ЖКТ), липидный обмен и липопротеинов транспорт до высших позвоночных 1,2, быстро развиваются, и генетически послушный. Оптическая прозрачность личиночной данио облегчает в естественных условиях исследования, A particulaг преимуществом для изучения системы GI как его внеклеточной среде (то есть, желчи, микрофлора, эндокринные сигнализации) практически невозможно смоделировать ех естественных условиях. В соответствии, орган исследований объединения генетического удобство манипулирования и факторов, способствующих выполнению живых изображений данио личинок с разнообразие диетических манипуляций ( с высоким содержанием жиров 3,4, -холестерина 5 и -carbohydrate диет 6,7), а также модели сердечно - сосудистых заболеваний 8, диабет 9,10, стеатоз печени 11-13, 14-16 и ожирение, появляются, чтобы обеспечить множество метаболических идей.

Важным аспектом перехода личиночной данио в метаболические исследования является оптимизация методик, разработанных в других модельных животных к данио и разработке новых анализов, которые используют уникальные сильные стороны данио. Этот протокол представляет методы разработаны и оптимизированы, чтобы накормить личиночной данио липиd-богатая пища, визуализировать диетическую обработку липидов от всего тела к внутриклеточной резолюции, и измерить потребление пищи. Куриный яичный желток был выбран, чтобы составить с высоким содержанием липидов пищи, как она содержит большое количество жиров и холестерина (липидов составляют ~ 58% из куриного желтка, из которых ~ 5% холестерина, 60% являются триглицеридами, а 35% являются фосфолипиды ). Куриный яичный желток содержит больше жира , чем обычные коммерческие данио микропеллет продуктов питания (~ 15% липидов) и тем преимуществом , что она представляет собой стандартизированный корм с известными процентным содержанием определенных видов жирных кислот, так как данио диеты и кормления полки не были стандартизированы в лабораториях 17. Кроме того, флуоресцентные аналоги липида , представленные в яичном желтке визуализации транспорта и накопления пищевых липидов 18, изображение клеточных компонентов , включая липидные капли, действуя как в качестве жизненно важных красителей 3 и через ковалентного включения в сложные липиды, исследовать метаболизм через тонкослойной хроматографии (ТСХ) 19 И высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (ФСП неопубликованные данные), а также обеспечить количественный анализ для общего потребления пищи 20.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эти протоколы были одобрены Институт Карнеги институциональной уходу и использованию животных комитета (Протокол №. 139).

1. Подготовка животных

  1. Поддерживать взрослые особи и личинки при 28 ° С на 14 ч: 10 ч света: темный цикл. Поток взрослых два раза в день с оболочкой свободной артемии (декапсулируются, не-штриховкой, начиная с 14 DPF) и коммерческих микрогранул.
  2. Эти протоколы оптимизированы для использования 6-7 личинок DPF, собранных естественном нересте фона АВ. Протоколы могут быть модифицированы для личинок других возрастов и профессий. Не обеспечивают экзогенных пищу до 6 DPF.
  3. Обезболить личинок с Tricaine в зародыше средах (EM) (4,2 мл 4 мг / мл Tricaine на 100 мл ЭМ) при комнатной температуре (RT).

2. Получение богатых липидами яичный желток поток

  1. Подготовить и хранить куриные желтки. Отделить желток и белый 12 куриных яиц. Бассейн желтки, аликвоту 1 мл в 1,5трубки мл, и хранят при -80 ° С до 1 года (12 желтков составит 80 ~ аликвот). Бассейн белых, хранить и использовать в качестве липидного бедных, богатых белком корма.
  2. Готовят флуоресцентный аналоговый (ы) липида быть добавлены к сырью яичного желтка, при желании.
    1. Приостановка купленную, порошкообразный флуоресцентный аналог липида в 100% этаноле или 100% хлороформа при 0,1 мкг / мкл (см следующую записку растворителей), обсуждая, аликвоты в непрозрачные стеклянные трубки, печать с парафином, и хранить в соответствии с инструкциями изготовителя. Из-за быстрого испарения органических растворителей, не используют объемы аликвотных меньше, чем ~ 400 мкл в течение длительного хранения.
      Примечание: Если аналоговый липидный суспендируют в этаноле, большие объемы аналога липида будут использоваться , поскольку она сохнет быстрее под N 2 , чем хлороформ. Если аналоговый липидный взвешивают в этаноле он не должен быть высушен и ресуспендировали перед его добавлением в корм липосом на этапе 2.2.4, но общая концентрация этанола не должно превышать 0.1% в корм липосом, чтобы избежать потенциально вмешивающихся физиологические эффекты этанола.
    2. Для получения аналогов флюоресцентных жирных кислот: Приготовьте общий объем 20 мл 5% -ного яичного желтка эмульсии в ЭМ. Из того, что готовят 5 мл аликвоты с конечной концентрации 6,4 мкМ 4,4-дифтор-4-Bora-3а, 4а-диаза-s-индацен (BODIPY C 16) для живой конфокальной микроскопии и приема пищи анализов или 1 мкг / мл BODIPY C 12 для работы с изображениями стереомикроскопа. Перенести желаемое количество флуоресцентного аналога липида в 1,5 мл пластиковую пробирку. Сушат липидов в потоке N 2, следя за тем, чтобы не дуть липида из трубки.
    3. Немедленно, ресуспендируют в 5 мкл 100% этанола с помощью пипетки поток вниз по стенкам пробирки, добавляют 95 мкл EM, и хорошо перемешать.
      Примечание: Смесь должна появиться однородная; если цветные липидный остается по бокам трубки или жидкость появляется массивно, липид не полностью солюбилизировать и требует большего количества этанола. Защитить трубку сюдам свет и хранить на льду.
    4. Для флуоресцентного аналога холестерина: подготовить конечной концентрации 2,4 мкг холестерина / мл в 5 мл 0,5-5% эмульсии яичного желтка для исследования живых изображений. Перенести желаемое количество холестерина в пластиковую пробирку на 1,5 мл. Сушат липидов в потоке N 2, следя за тем, чтобы не дуть липида из трубки.
    5. Сразу же, ресуспендируют в 15 мкл RT 100% этанола с помощью пипетки поток по стенкам трубы и смешивают с 85 мкл RT 1% не содержащего жирных кислот бычьего сывороточного альбумина в очищенной H 2 O. Защитите трубу от света и хранить на льду.
  3. Приготовьте желток липосомная поток.
    1. Добавьте талой аликвоты яичным желтком до ЕМ в 50 мл коническую трубку. Vortex разбавленный смесь яичного желтка в течение 1-2 мин; смесь должна, как представляется, гомогенной эмульсии.
    2. Вылейте смесь через сито с мелкими отверстиями для удаления белковых конгломератов и собрать в новом, свежем 50 мл коническую трубку.
    3. Pulse Соникат.е смесь яйца с одной четверти дюйма коническим микроострия (5 раз (5 х 1 сек на 1 сек выкл) приостановка 5-10 сек между каждым набором; интенсивность выхода: 6 Вт) при комнатной температуре, чтобы создать липосом. Параметры питания ультразвуковом зависят инструмент и, следовательно, требуют оптимизации для каждого инструмента и микроострия.
      Примечание: Постоянно качаться липосомная смесь при комнатной температуре, чтобы поддерживать гомогенность до использования.
  4. Добавьте флуоресцентный аналог липида к желтка липосом яиц, если это необходимо. Сразу же после обработки ультразвуком, пипеткой заготовленные липиды в липосому смеси и вихря на высокой скорости в течение 30 секунд, чтобы включить в липосомы. Защитите смесь от света, обернув трубку в фольгу и продолжают встряхивании при комнатной температуре.

3. Кормление Paradigm

  1. Подготовка Личинки для кормления.
    1. До начала подачи, личинки экрана для очевидных морфологических дефектов, которые могут препятствовать кормление. Личинки Передача до 60 мм х 15 мм чашки Петри или 6- или 12-луночного опалубTES, уменьшить ЕМ к минимуму, и заменить 5 мл приготовленного раствора липосом.
    2. При необходимости передавать ненакормленный личинок управления до 5 мл ЕМ и / или 5 мл 5% яичного белка в ЕМ и лечения параллельно.
  2. Осторожно покачайте личинки в качестве инкубированных коромысла (29-31 ° C при 30 оборотах в минуту) в течение всего корма, чтобы стимулировать потребление пищи, продолжая защищать от света, если флуоресцентные аналоги липида присутствуют. Если личинки необходимости подвергаться воздействию света, минимизировать экспозицию с тонированного стекла инкубатор крышкой.
  3. В конце периода кормления, полоскать свободно плавание личинок в ЕМ 3 раза.
    Примечание: Личинки могут начать потреблять липосом в любой момент во время подачи. Если это важно, что личинки начинается подача в то же время, экран для приема пищи (см 3.4) после 1 часа кормления и возвращают только личинки, которые приступили к подаче яичного желтка эмульсии для завершения подачи.
  4. Экран личинок на данный момент для приема пищи, как небольшое число не может еат (обычно ~ 0-5%). Проверьте кишечник личинок , которые были наркозом или слегка охлажденным на металлическом блоке на льду , чтобы определить , есть ли они кормили: личинки , которые потребляли липосом будут иметь затемненную кишечник (рисунок 1).
  5. Изображение или процесс личинок для приема пищи сразу. С другой стороны, место личинок в свежем ЕМ и инкубировать при 28 ° С, чтобы обеспечить обработку обмена веществ происходить.

4. Монтаж Личинка живых изображений

  1. Подготовить монтируемого Media.
    1. Для 3% метилцеллюлозы: добавляют 0,75 г метилцеллюлозы в 25 мл вблизи кипения Е.М., вихря, скалы при комнатной температуре 2-3 дня до полного растворения, и хранят при температуре 4 ° С в течение многих лет при -20 ° C. Повторные циклов замораживания и оттаивания при температуре 4 ° C будет удалить пузырьки воздуха. Хранить 3% метилцеллюлозы на льду во время монтажа личинки.
    2. Для 1,2% низкой горы агарозы: добавить 0,3 г легкоплавкой агарозы до 25 мл ЭМ и растворяют путем доведения до кипения, Алиготе в 2 мл тмассовые рассылки, и выдерживают при 26-28 ° С на тепловом блоке. Неиспользованные аликвоты можно хранить при комнатной температуре или при -20 ° С и снова варят в момент использования. Убедитесь, что агарозы достаточно прохладно, чтобы обращаться, прежде чем подвергать личинок или они могут быть чрезмерно нагреваться.
  2. Для низкого увеличения, средней пропускной способности живого изображения, поместите предметное стекло на ткани на металлическом блоке на льду и ждать слайд, чтобы остыть. Применяют щедрое количество 3% метилцеллюлозы (который поддерживали при 4 ° С на льду) на слайде, передать личинку на 3% метилцеллюлозы, используя лески покер (0,41 мм рыболовное диаметр линии приклеены к конец капиллярной трубки стеклянной) создают для слива и поклялся избыток EM (так что метилцеллюлозы не будет размыта) и положение личинок по желанию.
  3. Для кратковременного (<20 мин), с высоким увеличением живой визуализации с вертикально цели масла всплытии, смонтировать личинок с покровным пристройке к методу.
    1. Используйте клей на основе цианакрилатный (суперклей), чтобыприсоединять аа 22 х 30 мм покровным к одному концу предметного стекла. Используйте кочергу, чтобы положить тонкую линию 3% метилцеллюлозы на слайде, примыкающей к покровным и переносят личинки на слайд с широким отверстием Пастера пипеткой. Удалите излишки EM, поэтому он не будет разбавлять метилцеллюлозы.
    2. Использование покер, аккуратно поместите личинки в метилцеллюлозы на их сторонах (левая сторона до изображения больше, печени, правой стороной вверх к изображению желчного пузыря) с их головами рядом с покровным.
    3. Пятно суперклей в углах второго покровного и аккуратно поместите один край покровного стекла на смонтированном покровное, а другой на слайде, преодоление личинок. Будьте осторожны, чтобы не применять избыточное давление во время этого шага или с целью в то время как изображения, так что личинки остаются неповрежденную.
  4. Для долгосрочной перспективе, с высоким увеличением изображения с вертикальным иммерсионного объектива, крепление личинок в агарозы. Добавьте личинку в небольшую аликвоту 1,2% агарозном низкой расплава выполняться передачаЛичинка в небольшом объеме агарозы в чашке Петри.
    1. Быстро поместите личинки кочергой перед агарозном затвердевает. Дайте агарозы высохнуть в течение 2-3 мин и покрыть агарозы полностью свежим ЭМ, чтобы предотвратить его от высыхания.
  5. Для долгосрочной перспективе, с высоким увеличением изображения с перевернутого объектива, крепление личинок на стеклянным дном блюдо в агарозы.
    1. Охлаждают металлический блок на льду. Поместите блюдо на металлический блок, разделенных тканью, чтобы предотвратить чрезмерное охлаждение и замораживание личиночной. Передача личинку на блюдо и удалить EM путем затекания с тканью.
    2. Поместите каплю 28 ° C легкоплавкой агарозы (1,2%) на верхней части личинки и сразу же расположить кочергой (слева вниз, чтобы лучшим образом печени, с правой стороны вниз к изображению желчного пузыря). Удалить блюдо из холодного блока, дайте высохнуть в течение 2-3 мин, и добавить достаточный объем свежего ЕМ, чтобы покрыть агарозы (~ 2-5 мл).

5. Потребление продуктов питанияанализ

  1. В конце корма липосом яичного желтка , содержащего 6,4 мкМ BODIPY C 16, бассейн как минимум 10 промытого личинок в пластиковом 1,5 или 2 мл трубки, удалите EM, и оснастки заморозить. Образцы могут храниться при температуре -80 ° С в защищенном от света месте в течение нескольких месяцев.
    Примечание: Если это возможно, собрать несколько повторов. Важно, чтобы собрать ненакормленный личинок на этой стадии нормализации для фона липидного флуоресценции (в идеале личинок из той же муфты используются).
  2. Выполните модифицированный Блай-Дайера экстракции липидов 3,21.
    1. Добавьте 100 мкл буфера дл гомогенизации (20 мМ Трис-Cl, 1 мМ ЭДТА) к образцу на льду ( в альтернативном варианте очищенный H 2 O может быть использован). Перемешать на льду с микроострия ультразвуковом (5 сек всего: 1 сек на 1 сек в выключенном состоянии). Убедитесь, что личинки полностью гомогенизируют; если нет, то повторить. Перенесите в 13 мл одноразового использования стеклянной культуральную пробирку (могут быть использованы и другие стеклянные трубки).
      Примечание: Хлороформ является опасным; выполнить все последующие липидный ехшаги тяги при комнатной температуре в химическом капюшоном.
    2. На каждые 100 мкл буфера дл гомогенизации, используемых, добавляют 375 мкл 1: 2 (хлороформ: метанол). Vortex 30-60 сек, инкубировать 10 мин, добавляют 125 мкл хлороформа в 100 мкл буфера для гомогенизации используется, и вихрь 30 сек.
    3. Добавить 125 мкл 200 мМ Трис рН 7,5 на 100 мкл буфера для гомогенизации, используемой вихревой 30 сек, и центрифуге (2000 х г, 5 мин, RT, защищенном от света месте ). Осторожно удалите образцы из центрифуги. Они будут разделены на две фазы: верхнюю фазу представляет собой водный раствор, интерфейса личиночной мусора, и нижнюю органическую фазу (содержит липиды).
    4. С чистой стеклянной пипеткой собирают на дно, органическую фазу и перенести его в чистую стеклянную трубку 13 мл.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы избежать водной фазы и личиночной мусора на границе раздела; если происходит загрязнение, повторите шаг центрифугирования и вспомню. Отбросить верхнюю водную фазу; это может быть полезно, чтобы удалить и выбросить этотфаза перед сбором органической фазы. Образец можно хранить при температуре -80 ° С в течение до 1 месяца.
    5. Органическую фазу сушат в вакууме (0,12 атм), защищая от света. Не продолжайте сушить образцы после того, как жидкость испарится, как это приведет к снижению растворимости в липидах. Ресуспендируют липиды в соотношении 2: 1 (хлороформ: метанол) и хранить его на льду. Оптимальный объем хлороформа: метанола раствор, зависит от способа обнаружения, используемого; начать с низким и продолжают разбавить по мере необходимости. Общее правило заключается в использовании 10 мкл 10 складочном личинок.
  3. Пятно целые тома образца в равномерно расположенных интервалах на каналированной пластину ТСХ и сканировать пластину с лазерным сканером , которые обычно используются для визуализации биомолекул (например, флуоресцентный планшет - ридер). Для получения флуоресцентных аналогов липидов, включенных в перечень материалов, которые имеют максимумы возбуждения от 500-650 нм и испускания максимумов от 510-665 нм, используют лазер 488 нм и с коллекцией излучения на длине волны 520 нм,
    1. Количественная общей флуоресценции каждого пятна с программным обеспечением обработки изображений.
      Примечание: Правильно для естественного происхождения фона липидный флуоресценции путем вычитания флуоресценции парных, личиночной образцов голодных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

При подаче на качалке при 29-31 ° С, большинство здоровых личинок (≥95%) будет есть в течение 1 часа. При потребляя яичный желток эмульсии, личиночной кишечника темнеет. Очень темные кишок можно наблюдать на 2 ч (рисунок 1). Если личинки ненакормленный или не кормить, кишечник остается ясным. Личинки кормили яичный белок обнаруживают растянутый просвет кишечника, который не темнеет в цвете.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методы, описанные здесь, позволяют исследователям для лечения личиночной данио с богатой липидами корма, визуализировать диетическое обработку липидов в живых личинок, и количественно личиночной потребление пищи. Для того, чтобы обеспечить успех, особое внимание следует уделить несколько важных шагов. Коммерческие куриные яйца различаются; чтобы свести к минимуму потенциальную изменчивость мы выполняем все анализы на органические яйца из клетки свободных кур, которые не были обогащенные для омега-3 жирных кислот. Более ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Мэн-Чи Шен за изображения, Дженнифер Андерсон за полезные комментарии к рукописи, а также членов лаборатории Фарбера за их вклад в разработку этих методов. Это исследование было профинансировано премией NIDDK-NIH RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (Консорциум функциональной геномики рыбок данио: руководитель Стивен Эккер и Co-PI S.A.F.) и F32DK096786 (J.P.O.). Ответственность за этот контент лежит исключительно на авторах, и он не обязательно отражает официальную точку зрения NIH. Дополнительную поддержку оказал Благотворительный фонд Г. Гарольда и Лейлы Й. Мазерс лаборатории S.A.F и Научному фонду Карнеги.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Трикаин (этил3-аминобензоат метансульфатная соль)Sigma-AldrichA5040-25GАнестезия для личинок рыбок данио-рерио
Куриные яйцаН/ДН/ДОрганические, не содержащие в клетках яйца, не обогащенные омеге-3 жирными кислотами
Ультразвуковой процессор 3000 ультразвуковой аппаратMisonix, Inc.S-3000Для изготовления липосом яичного желтка акустическая
оболочка SonaboxMisonix, Inc.432BДля изготовления липосом яичного желтка
1/8" конический микронаконечникMisonix, Inc.419Для изготовления липосом яичного желтка
Янтарные флаконы (4 мл, стекло)National Scientific13-425Липидное хранилище; включает флаконы, крышки с открытым верхом и септы
крышки Incu-Shaker Mini Benchmark1222U12Инкубационный шейкер для кормов
BODIPY FL C16 Thermo Fisher ScientificD3821Флуоресцентный аналог липидов; (4,4-дифтор-5,7-диметил-4-бора-3а,4а-диаза-с-индацен-3-гексадекановая кислота)
БОДИПЫ ФЛ C12 Thermo Fisher ScientificD3822Аналог флуоресцентных липидов; (4,4-дифтор-5,7-диметил-4-бора-3а,4а-диаза-с-индацен-3-додекановая кислота)
BODIPY FL C5 Thermo Fisher ScientificD3834Аналог флуоресцентных липидов; (4,4-дифтор-5,7-диметил-4-бора-3а,4а-диаза-с-индацен-3-пентановая кислота)
BODIPY FL C5Thermo Fisher ScientificD2183Аналог флуоресцентных липидов; (4,4-дифтор-5,7-диметил-4-бора-3а,4а-диаза-с-индацен-3-пропионовая кислота)
TopFluor холестерин Avanti Polar Lipids Inc.810255Флуоресцентный аналог липидов; 23-(дипиррометеборона дифторид)-24-норхолестер
Безжирный жир БСАSigma-AldrichA0281-1GДля растворения холестерина TopFluor
МетилцеллюлозаSigma-AldrichM0387Монтажный материал для визуализации живых личинок; 75 x 25 x 1 мм
Низкоплавкий агарозныйматериал Thermo Fisher ScientificBP165-25Монтажный материал для живой личинки отображение; 22 x 30
предметных стекол для микроскопа VWR VWR 16004-422Монтажные личинки для визуализации в реальном времени
Coverslips Покровное стекло12-544AМонтажные личинки для визуализации в реальном времени
СуперклейLoctiteLOC01-30379Личинки для установки в реальном времени
FluoroDish (тарелка со стеклянным дном)World Precision Instruments, Inc. FD35-100Монтажные личинки для визуализации в реальном времени; тарелка 35 мм, стекло 23 мм, толщина стекла 0,17 мм;  
Конфокальный микроскопLeica МикросистемыSP-2, SP-5Микроскоп для большого увеличения в реальном времени
СтереоскопNikonSM21500Микроскоп для малого увеличения в реальном времени
Стеклянные культуральные пробирки Kimble73500-13100Экстракция липидов; (13 x 100 мм; 13 мл)
Савант SpeedVac Plus ThermoQuestSC210AЛипидная экстракция
Канальные пластины TLCWhatman ScientificWC4855-821Анализ потребления пищи; Силикагель LK5D 150 А, 20 х 20 см, толщина 250 мкм; Сняты с производства
Канальные пластины TLCAnaltech, Inc.66911Анализ потребления пищи; Прямая замена пластин Whatman Scientific TLC
Typhoon 9410 Variable Mode ImagerGE Healthcare9410Считыватель флуоресцентных пластин для анализа потребления пищи
Программное обеспечениеImageQuant GE Healthcare29000605Анализ анализа потребления пищи
5 3/4' Боросиликатные одноразовые пастерные пипетки широкого прохода     Kimble63A53WTПереносные личинки

Ссылки

  1. Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).
  2. Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
  3. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).
  4. Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).
  5. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
  6. Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).
  7. Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8 (12), 81485(2013).
  8. Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).
  9. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  10. Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
  11. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  12. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
  13. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136 (5), 865-875 (2009).
  14. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21(2010).
  15. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), 36474(2012).
  16. Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).
  17. Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).
  18. Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).
  19. Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).
  20. Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).
  21. Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
  22. Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).
  23. Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).
  24. Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7 (12), 52549(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Липидный обменфлуоресцентные аналоги липидовлипосомы из яичного желткатонкослойная хроматографияколичественное определение флуоресценциипереработка пищевых липидов
Высоким содержанием жира Кормление Paradigm для личинок данио рерио: Кормление, Живая съемка и Количественная приема пищи
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.