Плавучесть на основе метод определения жира в<em&gt; Drosophila</em

Краткое содержание

Здесь мы представляем метод измерения организменном уровни жира в третьей возрастной стадии (L3) личиночной стадии дрозофилы. Этот метод использует сравнительно низкую плотность жировой ткани, чтобы различать личинок с измененными жировых запасов. Плавучести на основе анализа является ценным инструментом для быстрой, воспроизводимой и экономичного скрининга.

Аннотация

Drosophila melanogaster является ключевой экспериментальной системой в изучении регуляции жира. В настоящее время существует множество методов измерения уровня накопленного жира у дрозофил, но большинство из них являются дорогостоящими и/или трудоемкими и имеют явные ограничения. Здесь мы представляем метод быстрого и дешевого определения уровня жира в организме у личинок L3 дрозофилы. Метод основан на различиях в плотности между жиром и мышечными тканями и позволяет быстро обнаруживать фенотипы жира и мышечной ткани. Мы проверили точность этого метода путем сравнения процентного содержания жира в организме, определенного с помощью экстракции нейтральных липидов и газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГКМС). Кроме того, мы описываем подробные протоколы сбора и синхронизации личинок, а также соответствующие экспериментальные рецепты. Представленная ниже методика устраняет основные недостатки наиболее широко используемых методов количественного определения липидов и обеспечивает эффективный способ быстрого и чувствительного скрининга личинок L3 на фенотипы регуляции жира, сохраняя при этом целостность личинок. Этот анализ имеет широкое применение для изучения метаболизма и регуляции жиров с использованием дрозофилы.

Введение

Дрозофилы был использован на протяжении более ста лет в изучении генетики и других основных биологических вопросов. За последние несколько десятилетий, стало ясно , что дрозофила является мощным инструментом в изучении многих заболеваний человека. В 70 - 80% генов , связанных с заболеваниями человека имеют идентифицированного муха ортолог ^{1 - 4,} дрозофила обеспечивает упрощенную еще переводимый систему , в которой для изучения сложных заболеваний. Метаболизм в частности, извлекли выгоду из такого исследования. Мало того, что генетика метаболизма хорошо сохраняющиеся между мух и людей, но соответствующие органы и типы клеток также очень похожи ^2,5. Например, жировое тело мухи магазинах оба триацилглицериды (TAG) и гликоген, функции , аналогичные тем , которые выполняются в печени млекопитающих и белой жировой ткани ^6. Использование дрозофилы в качестве модели для человеческого ожирения значительно улучшилось наше понимание липидаметаболизм и генетика ожирения ^7. Личиночной стадии развития является особенно полезным для изучения сегрегации питательных веществ при хранении или утилизации, как он предназначен для подачи и хранения энергии, которые будут использоваться во время pupariation.

В настоящее время существует множество различных количественных методов определения уровней хранения жира у дрозофилы. Наиболее широко используемый метод в сочетании колориметрический анализ (ССА) ^8,9. ОАС был разработан для определения уровней TAG в сыворотке крови человека и работает на предпосылке, что глицерол, освобожденной от основной цепи триглицеридов претерпит несколько реакций, в конечном счете, в результате чего в окислительно-восстановительной реакции в сочетании генерирующего окрашенного продукта. Абсорбция конкретных длин волн света, затем измеряют для определения первоначального количества глицерина настоящего. Тем не менее, глицерин также может быть освобожден от моно- и диацилглицеридов в дополнение к TAG и, следовательно, не может быть точным показателем сключена жир тела ^9. Кроме того, глаз пигмент измельченных взрослых мух может помешать некоторым значений оптической плотности и усложняют результаты ^9,10. Таким образом, ССА должно сопровождаться и проверены с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), что позволяет для разделения большинства липидных семей , которые могут быть количественно с помощью денситометрии ^10,11. Тем не менее, некоторые липидные классы , как стерины не могут быть проанализированы и должны быть количественно иным способом ^12. Масс - спектрометрия (МС) является точным способом количественной оценки всех классов основных клеточных липидов ^12,13. Тем не менее, процедуры экстракции липидов, необходимые для анализа с помощью МС являются как много времени (больше всего брать почти весь день) и дорогостоящим. Здесь мы представляем альтернативный способ быстро и дешево определять уровни организменном жира у личинок L3 дрозофилы.

Метод, представленный ниже, использует разницу в плотности между жировой ткани и нежирной ткани. млекопитающим Ф.А.т ткань имеет плотность примерно 0,9 г / мл ¹⁴ в то время как в скелетных мышцах как плотность 1,06 г / мл ^15. Эта разница означает, что животные с более высокими запасами жира будет иметь меньшую плотность, чем у животных с более низкими запасами жира, что позволит им лучше плавать в растворе фиксированной плотности. Это свойство позволяет чрезвычайно быстро скрининга большого количества животных, в то же время как недорогой и неинвазивные. Плавучести на основе анализа был использован как для подтверждения фенотипы изменения известных регуляторов жировых уровней, а также для выявления новых генетических и неврологических регуляторов ожирения ^16,17.

Протокол

1. собирать яйца от мух с генотипами интересов

Примечание: Идеальное место кресты состоят из 150 целинных мух и, по меньшей мере 75 мужчин. Сток коллекции должны состоять не менее чем 200 мух.

1. Подготовьте виноградные пластины.
   1. Добавить 37,5 г агара в 1,5 л дистиллированной воды в 4-литровую колбу.
   2. Автоклавы смесь вода / агар в течение 50 мин при 121 ° С (250 ° F).
   3. В то время как вода / агар смесь является автоклавирование, добавляют 50 г сахарозы в 500 мл виноградного сока и перемешать с мешалкой на мешалке с подогревом до сахарозы не растворится.
   4. Выключите огонь и продолжайте помешивать, чтобы охладить виноградный сок / смесь сахарозы до температуры ниже 70 ° С. Проверьте внутреннюю температуру с термометром спирта.
   5. Добавьте 3 г Drosophila противогрибковое средство (например, Tegosept) нагреться виноградный сок / смесь сахарозы и размешать до растворения.
   6. Когда вода / агар смесь из автоклава, позволяют колбу охладиться на ощупь кружением время от времени.
   7. Зерноуборочный вода / агар смесь и виноградный сок / смесь сахарозы и размешать до хорошо перемешивается.
   8. С помощью серологической пипетки, чтобы добавить 8 - 10 мл виноградного смеси к крышке небольшую чашку пластины (35 х 10 мм) типа. Позвольте смеси довершение выше, чем высота стенок крышки, чтобы сформировать выпуклую форму.
   9. Дайте винограда пластины остыть в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем хранить в герметичном контейнере при температуре 4 ° С.
2. Приготовьте дрожжевое пасту.
   1. Добавить 6 мл фосфатный буферный раствор (PBS) до 4 г живого активного сухих дрожжей в 50 мл коническую трубку и перемешать с лопаточкой до получения однородной массы.
   2. Хранить дрожжи пасты при температуре 4 ° С.
3. Добавьте небольшое ложку (примерно 1/8 чайной ложки) дрожжевой пасты к середине виноградного пластины. Сгладить любые острые углы с помощью шпателя.
4. Поместите винограда пластины в инкубаторе, пока они не достигли температуры окружающей среды.
5. Передача мух интерес в коллекции яйцевой камеры и место виноградного пластины шIth дрожжи паста обращена внутрь на вершине. Лента винограда пластины для сбора яиц камеры, чтобы не позволить пластины выпадать. Убедитесь в том, чтобы написать важную генотип и актуальную информацию о дне виноградной пластины.
6. Перевернуть сбор яиц камеру, чтобы позволить мухи откладывают яйца на тарелке винограда.
7. Поместите коробку или крышку над камерами сбора яиц и поместить их в инкубаторе при 25 ° С.
8. Разрешить мухи откладывают яйца в течение 4 - 6 часов.
9. Завершить сбор, беря виноградный пластину из коллекции яиц камеры и передачи мух обратно в бутылку пищи. Используйте лопаточку, чтобы стереть любой избыток дрожжевой пасты из винограда пластины. Хранить виноградный пластины в большую чашку Петри в увлажненном инкубаторе при температуре 25 ° С в течение ~ 24 ч.

2. Передача Личинки на экспериментальной еде

1. Подготовьте экспериментальную пищу.
   Примечание: Этот рецепт пищи основан на центральном рецепте ¹⁸ Блумингтон акций. Важные изменениявключают увеличение количества дрожжей, чтобы оптимизировать питательную ценность продукта, которое оценивали по времени блуждающего этапа (между 112 - 120 ч после сбора яиц при 25 ° С). В то время как мы нашли этот рецепт идеально подходит для здоровья и развития наших экспериментальных личинок, любой рецепт пищи является приемлемым с учетом калибровки с положительным и отрицательным контролем, примеры которых перечислены в пункте 3.10.
   1. Мера 1600 мл дистиллированной воды.
   2. Смешайте 134 г кукурузной муки, 10,6 г агара Drosophila типа II, и некоторые из воды (~ 500 мл) в 1 л лабораторный стакан. Смесь в течение 2 мин с моторизованным ручным миксером.
   3. Смешайте 70 г живого активных сухих дрожжей, 18,4 г соевой муки, 84,8 г солодового экстракта, и некоторое количество воды (~ 500 мл) в другой 1 л стакан. Смесь в течение 2 мин с моторизованным ручным миксером.
   4. Вихревой каждый стакан и налить в 4-литровую колбу. Используйте оставшуюся воду, чтобы промыть мензурки и добавляют в колбу.
   5. Мера 140 мл легкий кукурузный сироп и добавить в колбу, перемешать с помощью закрученного.
   6. Автоклавы в течение 50 мин при 121 ° С (250 ° F) в жидкой обстановке.
   7. После автоклавирования, залить пищу в 4 л лабораторный стакан и дайте ему остыть. Помощь процесс охлаждения путем смешивания с моторизованным ручным миксером.
   8. После того , как колбу охладится достаточно , чтобы коснуться, добавьте 8,8 мл пропионовой кислоты и 16,8 мл противогрибковое раствора агента / этанол дрозофилы. Хорошо перемешать. (Сделайте Drosophila противогрибковое раствора агента путем добавления 380 г Drosophila противогрибковое средство к 1 л этанола пробы 200. и перемешивания на теплую тарелку , пока не растворится, убедившись , что раствор не превышает 70 ºC.)
   9. Налейте пищу во флаконы, пока пища не будет приблизительно 1 дюйм глубиной и дать остыть при комнатной температуре в течение 2 - 3 ч. Подключите ампул и хранить в термостате при 25 ° С. Использовать в течение недели.
2. Окунитесь шпателем несколько раз в верхний слой флакона пищи, чтобы выиграть его. Это поможет личинки зарыться и кормить.
3. 22 - 24 ч после сбора яиц имеетсостава, используйте маленькую кисть, чтобы собрать 50 личиночных (L1) личинок одного и того же приблизительный размер. Поместите личинок в экспериментальной пищи. Очистите кисть на лаборатории салфетку и убедитесь, что там не осталось личинок на кисточкой перед продолжением другого генотипа.
4. Поместите пузырек личинок в термостате при 25 ° С и позволяют развивать.

3. Определить уровни жира в Личинка

1. Готовят растворы.
   1. Подготовьте 1 L 10х PBS запас.
      1. Добавляют 80 г NaCl, 2 г хлорида калия, 14,4 г Na ₂ HPO ₄ и 2,4 г KH ₂ PO ₄ до 800 мл воды в 2 л стакан , содержащий мешалку. Перемешать, без тепла, пока все соли не будут включены. Довести рН до 7,4. Увеличение объема до 1 л водой.
   2. Подготовьте 2 L 1x PBS. Добавить 200 мл 10х PBS исходный раствор до 1800 мл воды.
   3. Используйте этот запас 1x PBS, чтобы сделать 20% вес / объем сахарозы.
2. Удалите флакон личинок изинкубатор раз есть 20 - 40 личинок блуждающих вверх по сторонам флакона (как правило, на пятый день после коллекции яиц). Запишите дату и время проведения анализа, а также количество блуждающих личинок.
3. Подготовка экспериментального раствора путем добавления 11,5 мл PBS и 9 мл 20% сахарозы в 50 мл коническую пробирку.
4. Добавить 20% сахарозы в пробирку до тех пор, пока 0,5 - 1 дюйм от верхней части флакона.
5. Используйте лопаточку, чтобы осторожно перемешать до верхнего слоя пищи для свободного личинок, которые до сих пор закапывания в пище. Все личинки поднимаются к поверхности раствора сахарозы.
6. Используйте пинцет, чтобы аккуратно перенести личинок в исходную концентрацию сахарозы с шага 3.3.
7. Используйте лопаточку, чтобы осторожно перемешать личинки в этом растворе.
8. Закрывают коническую трубку и вверх ногами несколько раз, чтобы тщательно перемешать раствор.
9. Открывать коническую трубку и вихрем, чтобы создать нежный вихрь.
10. Разрешить личинки осесть либо плавающие в верхней части раствора или сиnking на дно. Подождите 2 - 5 мин для личинок осесть.
    Примечание: Если есть еще личинки, которые не являются определенно либо с плавающей или тонет, выбрать линию, чтобы использовать в качестве отправной точки для обозначения обрезания личинок либо как поплавка или грузила. Примените этот же критерий для всех генотипов. Мы используем угол в нижней части конической трубки в качестве нашего края. АДФ или SIR2 ¹⁷ мутантных личинок могут быть использованы в качестве положительного контроля и lsd2 ¹⁹ мутанты могут быть использованы в качестве отрицательного контроля для калибровки анализа.
11. Запишите количество плавающих личинок и конкретной тестируемой концентрации.
12. Добавить 1 мл 20% сахарозы в экспериментальном растворе для увеличения его плотности.
13. Повторите шаги 3.7 до 3.10. Запишите количество плавучего личинок и эту новую концентрацию.
14. Продолжить шаги 3.12 и 3.13 до по меньшей мере 95% личинок плавают.
15. Используйте пинцет, чтобы собрать все личинки в рассечение блюдо, заполнены PBS.
16. Obsличинки Erve под микроскопом и примечание, если есть какие-либо мелкие личинки, предварительно куколки, куколки, или любые другие различия между генотипами.
    Примечание: В идеале, все личинки должны появиться однородна и на той же стадии развития. Мы только наблюдали последовательные измерения жира в этих условиях.
17. Записать общее число личинок.
18. С помощью щипцов, перевести 10 личинок в лабораторию протирать, чтобы высохнуть. Этикетка микроцентрифужных трубки и поместить 10 личинок в трубке.
19. Вспышка замерзают личинки в жидком азоте. Хранить трубку при -20 ° С.

Результаты

На рисунке 1 представлен пример того , как анализ плавучести на основе может обнаружить как более высокие и более низкие запасы жира в генетически модифицированных личинок. Рисунок 1А показывает , что возбуждение или глушителей некоторого подмножества нейронов (E347) в личиночной мозге вызывает все ниже и с большим содержанием жира магазины соответственно. В тот же генетический контроль фон был использован в обоих случаях. На рисунке 1б ...

Обсуждение

Есть множество методов , которые были разработаны для измерения уровней липидов в ^{8 - 10.} Тем не менее, каждый из этих методов идет с некоторыми существенными недостатками, которые решаются с помощью анализа плавучести на основе описанной выше. Во-первых, этот анализ является чрезвычайно быстрым. Тестирование полного градиента концентрации занимает не более 30 - 60 мин. Это огромное улучшение по сравнению с большинством методов используемых в настоящее время. Например, липидный Количеств...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Bacto Agar	VWR	214030
Welch's Original 100% виноградный сок
Сахароза	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Этанол			200 пруф
Пекарские дрожжи	Fleichmann's
Yellow Кукурузная мука	Quaker		Обогащенная дегерминированная
дрозофила Агар тип II	Apex	66-104
Соевая мука	ADM Специальные ингредиенты	062-100
Солодовый экстракт	Breiss	5748
Светлый кукурузный сироп	Karo
Пропионовая кислота	VWR	U330-09
Хлорид натрия	Fisher	50147491
Фосфат калия одноосновной	Sigma	P5655-100G
Фосфат натрия безводный	Fisher	S3933
Хлорид калия	Fisher	P330-500
35 x 10 мм пластина	Петри Фишер	08-757-100A
50 мл конический	Фишер	50-869-569