Этот протокол описывает косвенную нейрон-астроцитов сокультивирования для анализа на секции нейрон-глиальных взаимодействий.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Непрямой Нейрон-астроцитов Анализ Совместное культивирование:
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Правильное развитие нейронов и функции является предпосылкой развивающегося и взрослого мозга. Однако механизмы, лежащие в основе высоко контролируемого формирования и поддержания сложных нейронных сетей не совсем понятны до сих пор. Открытые вопросы , касающиеся нейронов в области здравоохранения и болезни разнообразны и идущие от понимания базового развития к исследованию патологий , связанных с человека, например, болезнь Альцгеймера и шизофрения. Наиболее детальный анализ нейронов может быть выполнена в пробирке. Тем не менее, нейроны требуют клетки и нуждаются в дополнительной поддержке астроцитов для их выживания в долгосрочной перспективе. Эта клеточная гетерогенность находится в конфликте с целью расчленения анализа нейронов и астроцитов. Мы представляем здесь анализ клеточной культуры, которая позволяет для долгосрочного совместного культивирования чистых первичных нейронов и астроцитов, которые разделяют ту же химически определенной среде, в то же время физическиразделены. В этой установке, культуры выжить в течение до четырех недель, и анализ подходит для разнообразия исследований, касающихся взаимодействия Нейрон-глии.
Введение
На протяжении последних десятилетий, общая интерпретация функции нейроглия превратилась из приписывание лишь поддерживает к активной регулирующей роли в отношении функции нейронов 1. Из - за их влияния на видных гомеостаза мозга в здоровье и болезни 2, астроциты представляют особый интерес для научного сообщества. За последние несколько лет, разнообразие исследований были сосредоточены на нейрон-глиальных взаимодействий в естественных условиях и в пробирке 3. Тем не менее, большинство систем культивирования не позволяют проводить раздельный анализ обоих типов клеток и их соответствующих secretomes.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты с мышами были в соответствии с Законом немецкой и Немецкого общества Neuroscience руководящих принципов животноводства. Комитеты по уходу за животными и использования Рурского университета Бохума предоставили соответствующие разрешения.
1. Подготовка и культивирование корковых астроцитов
Примечание: Выполните следующие действия протокола по меньшей мере за 7 дней, прежде чем перейти к следующему шагу, как астроцитов культуры должны развиться в сливающихся монослоев до того, как нейроны получают. Первичные астроциты получают из смешанных глиальных культур, полученных из мышат мыши вокруг постнатальны....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Анализ нейрональных культур посредством непрямого системы сокультивирования многогранно и может быть выполнена на различных стадиях культивирования созревания. В связи с тем, что клетки могут сохраняться в течение до 4 недель, долгосрочные исследования культур возможны.
Схема в середине левой панели Рисунок 1 демонстрирует установку сокультивации. При использовании этой системы, живых клеток изображений обоих .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Основной целью текущего протокола является полностью отдельными нейронными и астроцитарные культуры, сохраняя при этом их в общей среде. По этой причине, чистота культур, полученных должно быть проверено в начале процедуры. Мы рекомендуем использовать нейрон специфические тубулина, нейрофиламентов или белка NeuN в качестве нейрональных маркеров, GFAP в качестве маркера астроцитов, O4 антиген в качестве маркера предшественника олигодендроцитов и белка Iba1 для выявления микроглии.
Обратите ос.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Данная работа была поддержана Немецким исследовательским фондом (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; исследовательской школой Рурского университета в Бохуме (GSC98/1) и приоритетной программой SSP 1172 "Глия и синапс", Fa 159/11-1,2,3).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильные>реагенты | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Водные культуры клеточных культур | MilliQ | ||
| Cytosine-β-D-арабинофуранозид (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | ВНИМАНИЕ: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| ДНК | Уортингтон | LS002007 | |
| Гентамицин | Сигма-Олдрич | G1397 | ВНИМАНИЕ: H317-334 |
| Глюкоза Серва | 22700 | ||
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Сыворотка для лошадей | Biochrom AG | S9135 | |
| L-цистеин | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Овальбумин | Sigma-Aldrich | A7641 | ВНИМАНИЕ: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | самодельный | ||
| поли-D-лизин | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Поли-L-орнитин | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Пируват натрия | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Трипсин-ЭДТА | Gibco (Life Technologies) | 25300054< | |
| Strong>Equipment | |||
| 24-луночные пластины | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-луночная пластина (для непрямая кокультура) | BD Falcon | 353504 | |
| Бинокль | Leica | MZ6 | |
| Вставки для клеточных культур | BD Falcon | 353095 | |
| Центрифуга | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Счетная камера | Marienfeld | 650010 | |
| Щипцы | FST Dumont | 411254-20 | |
| Стеклопакеты (12 mm) | Карл Рот (Menzel- Glä ser) | P231.1 | |
| Инкубатор | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro-tube (2 мл) | Sarstedt | 72,691 | |
| Микроскоп | Leica | DMIL | |
| Millex Шприцевой фильтрующий блок | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Парапленка | Bemis | PM-996 | |
| Чашки Петри (10 см) | Пипетка Sarstedt | 833,902 | |
| (1 мл) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Стерильный верстак | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Хирургические ножницы | FST Dumont | 14094-11 | |
| Шприц | Henry Schein | 9003016 | |
| Колба T75 | Sarstedt | 833,911,002 | |
| туба (15 мл) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Водяная баня | GFL | Водяная баня тип 1004 |
Ссылки
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
