Method Article

Оптимизированного протокола для эффективного радиоактивной наночастиц золота с помощью 125 I-меченый Azide простетической группы

DOI:

10.3791/54759

⸱

October 10th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробный порядок синтеза 125 I-меченого азида и радиомечения из dibenzocyclooctyne (DBCO) -группа-сопряженными, 13-нм размера наночастиц золота с использованием меди , свободной от реакции щелчка описана.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы демонстрируем подробный протокол радиосинтеза 125-меченойазидной группы протезов и его применение для эффективного радиоактивного мечения функционализированных наночастиц золота DBCO-группы с использованием клик-реакции без меди. Радиойодирование оловянного прекурсора (2) проводили с использованием [125I]NaI и хлорамина Т в качестве окислителя при комнатной температуре в течение 15 мин. После очистки сырого продукта от ВЭЖХ получали очищенный 125I-меченый азид (1) с высоким радиохимическим выходом (75 ± 10%, n = 8) и отличной радиохимической чистотой (>99%). Для синтеза радиоактивно меченых наночастиц золота размером 13 нм функционализированные DBCO наночастицы золота (3) получали с использованием тиолированного полимера полиэтиленгликоля. Безмедная клик-реакция между 1 и 3 давала 125меченых I наночастиц золота (4) с более чем 95% радиохимического выхода, как это было определено с помощью радиотонкослойной хроматографии (радио-TLC). Эти результаты ясно указывают на то, что представленный в настоящем виде метод радиоактивного мечения с использованием стимулируемой штаммом клик-реакции без использования меди будет полезен для эффективного и удобного радиоактивного мечения наноматериалов, содержащих DBCO-группу.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стимулируемая штаммом безмедная клик-реакция между азидами и циклоктинами широко применяется для эффективного биоортогонального мечения широкого спектра биомолекул, наноматериалов и живых субъектов1-7. Благодаря превосходной сайт-специфичности и быстрой скорости реакции этой реакции конъюгации, он также используется для синтеза радиоактивно меченных индикаторов. Несколько 18F-меченых азидных групп или групп протезов DBCO были подготовлены для мечения in vitro различных видов рака, нацеленных на пептиды и антитела, а также для предварительной таргетной визуализации опухолей8-13 in vivo. В дополнение к этим примерам, та же реакция конъюгации была применена к мечению наноматериалов металл-радиоизотопами для исследований визуализации с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ)14-16.

В течение нескольких десятилетий радиоактивные йоды использовались для биомедицинских исследований и клинических испытаний с помощью ПЭТ-визуализации (124I), однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) (123I, 125I) и лечения рака щитовидной железы (131I)17-21. Таким образом, эффективный метод мечения радиоактивным йодом принципиально важен для различных исследований, включая молекулярную визуализацию, анализ распределения биомолекул в органах, идентификацию биомаркеров и разработку лекарств. Стратегия клик-реакции без меди может быть использована для мечения радиоактивным йодом. Тем не менее, это применение не было исследовано так же широко, как 18F-меченых биомолекул22-23. Здесь мы предоставим пошаговый протокол синтеза 125-I-меченногоазида для радиоактивного мечения молекул, полученных из группы DBCO. Процедуры, описанные в настоящем отчете, будут включать радиойодирование оловянного прекурсора, этапы очистки с помощью ВЭЖХ и твердофазную экстракцию. Мы также демонстрируем эффективное радиоактивное мечение модифицированных DBCO-группой наночастиц золота размером 13 нм с использованием 125-I-меченногоазида. Подробный протокол, представленный в этом отчете, поможет специалистам по синтетической маркировке понять новую методологию радиоактивного мечения для синтеза продуктов с радиоактивной меченой.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внимание: окисленная форма радиоактивного йода довольно неустойчив и должны быть обработаны с адекватными свинцовыми щитами и свинцовых флаконах. Все радиохимических шаги должны проводиться в хорошо вентилируемом активированным углем капот, а также экспериментальные процедуры должны контролироваться устройствами обнаружения радиоактивности.

1. Приготовление химических веществ и обратного фазового картриджа для синтеза 125 I-меченого азида

  1. Приготовление реагентов в растворе
    1. Растворите 1 мг азида предшественника (2) в 150 мкл абсолютного этилового спирта (рисунок 1).
      Примечание: Подробное синтетическая процедура предшественника азида (2) сообщалось в предыдущей статье 22.
    2. Растворите 1 мг хлорамина T в 20 мкл 1х фосфатного буфера солевым раствором (рН = 7,4).
    3. Растворите 2 мг метабисульфит натрия в 20 мкл H 2 O.
  2. PREPARAции картриджа
    1. Промыть картридж tC18 с 10 мл абсолютного этанола , а затем 10 мл H 2 O. Не сушить матрицу картриджа с воздухом.

2. Radiosynthesis 125 I-меченого азида ортопедической группы

  1. Радиоиодирования реакции предшественника
    1. Добавляют раствор предшественника азид (1 мг в 150 мкл абсолютного этанола) и уксусную кислоту (10 мкл) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
    2. Добавьте 150 МБк [125 I] NaI в 0,1 М NaOH (50 мкл) к реакционной смеси.
    3. Добавление хлорамин Т раствор (1 мг в 20 мкл 1х фосфатного буферного раствора) и закройте микроцентрифужных пробирку, содержащую реакционную смесь.
    4. Инкубируют реакционную смесь при комнатной температуре в течение 15 мин, пока реакция радиоиодирования не будет завершена.
    5. Добавление метабисульфит натрия (2 мг в 20 мкл H 2 O) к реакционной смеси ,для гашения реакции радиоиодирования.
    6. Вывод 0,2 мкл неочищенного продукта , а затем разбавить его 100 мкл раствора (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) для анализа ВЭЖХ.
      Примечание: Для всех экспериментов ВЭЖХ используют 0,1% муравьиной кислоты , содержащей H 2 O (растворитель А) и 0,1% кислоты , содержащей ацетонитрил муравьиную (растворитель B) в качестве растворителей.
    7. Анализ разбавленный сырой продукт с помощью обращенно-фазовой аналитической радио-ВЭЖХ (С18 с обращенной фазой; скорость потока: 1 мл / мин, элюент градиент: 20% растворител в течение 0-2 мин, 20-80% растворител для 2-22 мин, 80-100% растворител в течение 22-23 мин, и 100% растворителя в в течение 23-28 мин; время удерживания: 16,4 мин) (рисунок 2).
  2. После очистки сырого продукта с помощью препаративной ВЭЖХ
    Примечание: Обеспечить достаточное количество свинца экранирование вокруг ВЭЖХ частей, таких как инжектор, колонка, детектор, сбор флаконов, и контейнером, в котором собирается выходящий поток.
    1. Вывод-йе Всю реакционную смесь в ВЭЖХ емкость. Ополосните реакционную трубку с ацетонитрилом (0,5 мл) и добавляют полоскание в том же флаконе для инъекций. Развести собранный раствор с H 2 O (1 мл).
    2. Вводят сырой продукт на препаративной радио-ВЭЖХ (С18 с обращенной фазой; скорость потока: 10 мл / мин; элюирование с градиентом: 20% растворител в течение 0-2 мин, 20-80% растворител в течение 2-22 мин, 80-100% растворител в течение 22-23 мин, и 100% растворител в течение 23-28 мин).
    3. Собирают радиоактивный пик , представляющий 125 I-меченый азид (1) (T R в этих условиях ВЭЖХ 17.8-18.8 мин) в стеклянной пробирке (рисунок 2).
    4. Измерьте радиохимический выход фракции с использованием радиоактивной дозы калибратор в соответствии с протоколом производителя.
    5. Вводят очищенного продукта на аналитическую радио-ВЭЖХ с использованием тех же условиях ВЭЖХ для определения радиохимической чистоты продукта.
  3. Твердофазной экстракции продукта
    1. Развести фракцию , содержащую целевой продукт реакции (1) с 40 мл чистого H 2 O.
    2. Добавьте разбавленный раствор в переобусловленного tC18 картриджа.
    3. Промыть картридж с дополнительным 15 мл H 2 O.
    4. Элюции продукт (1) запертых в картридже с 2 мл ацетона в 10 мл стеклянную пробирку, которая защищена свинцовым экраном. Измерьте радиоактивность элюированного продукта с использованием радиоактивной дозы калибратор в соответствии с протоколом производителя.
      Примечание: диметилсульфоксиде (ДМСО) или абсолютный этанол также может быть использован для элюирования продукта из картриджа. Примерно 5-10% радиоактивности обычно прилипает к патрону, а оставшийся радиоактивно меченный продукт не может быть полностью элюировали с использованием избыточных количеств органического растворителя.
    5. Выпаривают ацетон с потоком азота или газообразного аргона.
    6. Растворить повторноsidue с ДМСО (100-200 мкл) на следующей стадии радиоактивной.

3. Синтез DBCO-группа-сопряженного наночастиц золота

  1. Поверхностная модификация 13-нм размера наночастиц золота с DBCO-группы , содержащей полиэтиленгликоль
    1. Готовят натрия цитрат-стабилизированные наночастицы золота (3) (средний размер = 13 нм) , в соответствии с предыдущим докладе 24.
    2. Добавление водного раствора Tween 20 (1 мМ, 1,5 мл) к цитратной-стабилизированных наночастиц золота (10 нМ, 15 мл). Взболтать раствор в течение 20 мин на орбитальном шейкере.
    3. Добавьте водный раствор DBCO-группы, содержащей полиэтиленгликоль тиола (средняя молекулярная масса = 5000, 100 мкМ, 1,5 мл). Встряхнуть раствор в течение 2 ч на орбитальном шейкере.
  2. Очистка наночастиц золота с модифицированной DBCO-группы,
    1. Очищают модифицированные DBCO-группы-наночастицы золота (4) </ Сильный> путем последовательного центрифугирования (11400 XG, 15 мин х 3).
    2. Слейте супернатант и добавить чистую воду для взмучивания золотых наночастиц гранул.

4. радиоактивной из DBCO-модифицированной группы наночастиц золота через неомедненная Нажмите реакции

  1. Синтез 125 I-меченных наночастиц золота с использованием 125 I-меченый азид (1)
    1. Приготовить концентрированный раствор наночастиц золота модифицированного DBCO-группы, с помощью центрифугирования (11400 XG, 15 мин), а также регулировать концентрацию наночастиц золота до 2 мкм.
    2. Добавить 4,1 МБк 125 I-меченый азида (1) в ДМСО (5 мкл) к суспензии наночастиц золота (4) (2 мкМ, 50 мкл).
    3. Выдержите полученной реакционной смеси при 40 & deg; С в течение 60 мин.
    4. Вывод аликвоту (0,2 мкл) из сырого продукта и применять его на кремнезем-COованные тонкослойной хроматографии (ТСХ) пластины.
    5. Разработка пластины тонкослойной хроматограммы, использу этилацетат в качестве подвижной фазы.
    6. Поместите пластину ТСХ на сканер радио-ТСХ и запустить сканер для контроля реакции радиоактивной (рисунок 3) в соответствии с протоколом производителя.
  2. После очистки сырого продукта
    1. Очищают реакционной смеси , содержащей 125 I-меченных наночастиц золота (4) путем центрифугирования (11400 XG, 15 мин).
    2. Слейте супернатант и добавить чистую воду для взмучивания золотых наночастиц гранул.
    3. Вывод аликвоту (0,2 мкл) из очищенного продукта и применять его на кремнеземную покрытием ТСХ пластины.
    4. Разработка пластины тонкослойной хроматограммы, использу этилацетат в качестве подвижной фазы.
    5. Поместите пластину ТСХ на сканер радио-ТСХ и запустить сканер для определения радиохимический выход и радиохимической чистоты 125 I-меченый голег наночастицы (4) (Рисунок 3) в соответствии с протоколом производителя.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реакция радиоиодирования из stannylated предшественника (2) проводили с использованием 150 МБк [125 I] NaI, уксусную кислоту, и хлорамин Т при комнатной температуре в течение 15 мин , чтобы обеспечить радиоактивно меченого продукта (1). После препаративной ВЭЖХ очистки сырой смеси целевой продукт был получен с 75 ± 10% (n = 8) радиохимический выход. Аналитическую ВЭЖХ показал , что радиохимической чистоты 125 I-меченого продукта был...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В общем случае , наблюдаемая радиохимический выход очищенного 125 I-меченый азида (1) составляло 75 ± 10% (n = 8). Радиоактивной была выполнена с 50-150 МБк радиоактивности и радиохимического результаты вполне согласуются. Если [125 I] NaI (T 1/2 = 59,4 г) , который подвергся радиоактивному распаду в течение более одного месяца использовали в реакции радиоиодирования наблюдалось радиохимический выход 1 , чтобы быть незначительно снизилась (53-65...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Национального исследовательского фонда Кореи, финансируемыми правительством Республики Корея (гранты NoNo 2012M2B2B1055245 и 2012M2A2A6011335) и Центром биомики RI-Biomics Корейского научно-исследовательского института атомной энергии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Тригидрат хлорамина ТSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
метабисульфит натрия SigmaS9000
Муравьиная кислотаSigma251364
Sep-Pak tC18 плюс картриджВодыWAT036800
диметилсульфоксидом SigmaD2650
АцетонСигма650501
этанолСигма459844
тригидрат хлорида золота (III)Сигма520918
Твин 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5,000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC силикагель 60 F254Merck
Аналитический ВЭЖХAgilent1290 БесконечностьНомер модели
Препаративная ВЭЖХAgilent1260 БесконечностьНомер модели
Аналитическая колонка C18 с обратной фазойAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Препаративная колонка с обратной фазой C18AgilentPrepHT XDB-C18
Радиосканер TLCBioscanAR-2000Номер модели
Радиоизотопный калибратор дозыCapintec, IncCRC -25R Калибратор дозыНомер модели

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
  2. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
  3. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
  4. Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
  5. Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
  6. Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
  7. Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
  8. Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
  9. Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
  10. Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
  11. Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
  12. Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
  13. Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
  14. Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
  15. Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
  16. Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
  17. Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
  18. Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
  19. Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
  20. Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
  21. Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
  22. Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
  23. Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
  24. Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Radiolabeling Gold NanoparticlesCopper Free Click ReactionIodine 125 Azide Prosthetic GroupRadioiodination ProtocolHPLC PurificationRadio TLC AnalysisDBCO Functionalized NanoparticlesStrain Promoted Azide Alkyne CycloadditionRadiochemical Yield MeasurementSolid Phase Extraction

Related Articles