Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

подготовки и

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54776

⸱

4 декабря 2016 г.

 ,  ,  , 
1MR Neuroimaging Agents, Max Planck Institute for Biological Cybernetics

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает получение и характеристика дендритного магнитно-резонансная томография (МРТ) контрастного агента, который несет Cyclen на основе макроциклических хелатов координирующие парамагнитные ионы гадолиния. В серии экспериментов МРТ в пробирке, этот агент произвел усиленный сигнал МРТ по сравнению с коммерчески доступным мономерного аналога.

Аннотация

Парамагнитные комплексы гадолиния (III) с ациклическими или макроциклических хелатов являются наиболее часто используемые контрастные вещества (КАС) для магнитно-резонансной томографии (МРТ). Их цель состоит в том, чтобы повысить скорость релаксации протонов воды в тканях, тем самым увеличивая MR контраст изображения и специфичность измерений МРТ. В настоящее время клинически апробирована контрастные агенты низкой молекулярной массой молекулы, которые быстро выводятся из организма. Использование дендримеров в качестве носителей парамагнитных энтеросорбенты могут играть важную роль в будущем развитии более эффективных MRI контрастных агентов. В частности, увеличение локальной концентрации парамагнитных результатов видов в более высокой контрастности сигнала. Кроме того, этот центр сертификации обеспечивает более длительное время удерживания ткани вследствие его высокой молекулярной массой и размером. Здесь мы демонстрируем удобную процедуру получения высокомолекулярных MRI контрастных агентов на основе поли (амидоамин) (ПАМАМ) дендримеров с monomacroциклические энтеросорбенты DOTA типа (DOTA - 1,4,7,10-тетраазациклодекана-1,4,7,10-тетраацетат). Устройство хелатирующий было приложено путем использования реакционной способности изотиоцианат (NCS) группы, к поверхности аминогруппами ПАМАМ-дендримера, с образованием тиомочевины мостов. Дендритные продукты очищают и анализируют с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса, масс-спектрометрии и элементного анализа. И, наконец, высокое разрешение MR печатали изображения и сравнивали сигнал контрасты, полученные из подготовленного дендритный и коммерчески доступных мономерных агентов.

Введение

Магнитно-резонансная томография (МРТ) является мощным и неионизирующих метод визуализации широко используется в медико-биологических исследований и клинической диагностики благодаря своей неинвазивной природы и превосходной внутренней контраста мягких тканей. Наиболее часто используемые методы МРТ используют сигнал, полученный от протонов воды, обеспечивая изображения высокого разрешения и подробную информацию в тканях, основанных на различиях в плотности воды сигналов. Интенсивность сигнала и специфичность экспериментов МРТ может быть дополнительно улучшена с использованием контрастных агентов (КАН). Они являются парамагнитные или суперпарамагнитныо виды , которые влияют на продольную (Т 1) и поперечные (T 2) времена релаксации, соответственно 1,2.

Комплексы лантанидов иона гадолиния с полиаминокислоты лигандами поликарбоновых кислот являются наиболее часто используемыми T 1 центры сертификации. Гадолиния (III) укорачивает релаксации T 1Время протонов воды, тем самым увеличивая контраст сигнала в МРТ экспериментов 3. Тем не менее, ионная гадолиний токсичен; его размер приблизительно равен кальция (II), и это серьезно влияет на кальций-помощь сигнализации в клетках. Поэтому, ациклические и макроциклические хелаты используются для нейтрализации этой токсичности. Различные мультидентатные лиганды были разработаны до сих пор, что приводит к гадолиний (III) комплексов с высокой термодинамической устойчивостью и кинетической инертности 1. Те, которые основаны на 12-членных azamacrocycle циклена, в частности, его тетракарбоновой производное DOTA (1,4,7,10-тетраазациклодекана-1,4,7,10-тетраацетат) являются наиболее исследованные и прикладные комплексы этого класса СА.

Тем не менее, GdDOTA типа СА представляют собой системы с низким молекулярным весом, отображающие определенные недостатки, такие как низкая эффективность контраста и быстрой почечной экскреции. Макромолекулярные и многовалентного центры сертификации может быть хорошим решением 4 этих проблем. Так как CA biodistribuния в основном определяется их размерами, высокомолекулярные центры сертификации отображать гораздо более длительное время удерживания в тканях. Не менее важно то , что поливалентность этих агентов приводит к увеличению локальной концентрации мономерного MR зонда (например, GdDOTA комплекс), существенно улучшая полученного сигнала MR и качество измерений.

Дендримеров являются одними из наиболее предпочтительных подмостей для получения поливалентной КАС для МРТ 4,5. Эти высоко разветвленные макромолекулы с четко определенными размерами склонны к различным реакциям сочетания на их поверхности. В этой работе мы сообщаем о подготовке, очистку и характеристику дендритного CA для МРТ, состоящей из 4-го поколения (G4) поли (амидоамин) (ПАМАМ) дендример в сочетании с GdDOTA-как хелатов (DCA). Описаны синтез реакционно-способного производного DOTA и то его связь с ПАМАМ-дендримера. После комплексообразования с Gd (III), стандартной физико-химических характеристик процедуры, применяемыеповторное АКН была выполнена. Наконец, эксперименты были проведены МРТ, чтобы продемонстрировать способность DCA производить МР-изображений с более сильным контраст, чем полученные с низкой молекулярной массой УЦ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Получение DCA

  1. Синтез мономерного звена 4 6.
    1. Синтез 4- (4-нитрофенил) -2- (4,7,10-три- трет-бутоксикарбонилметил 1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-ил) бутановой кислоты трет - бутилового эфира (2).
      1. Растворите (4,7-бис - трет-бутоксикарбонилметил 1,4,7,10-тетрааза-cyclododec-1-ил) уксусной кислоты трет - бутилового эфира 1 (1,00 г, 1,94 ммоль) в N, N - диметилформамиде ( ДМФ, 5 мл), добавляют карбонат калия (0,67 г, 4,86 ​​ммоль, 2,5 экв.) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 45 мин.
        Примечание: макроцикла 1 получали из циклена и трет - бутил эфир бромуксусной в соответствии с ранее опубликованным способом 7.
      2. Добавить трет - бутил-2-бром-4- (4-нитрофенил) бутановой кислоты (0,87 г, 2,53 ммоль, 1,3 экв.) Порци ми в течение 1 ч. Продолжайте перемешивание смеси при тон же условия реакции для следующих 18 часов.
        Примечание: Трет - бутиловый-2-бром-4- (4-нитрофенил) бутановой кислоты получают из 4- (4-нитрофенил) бутановой кислоты, тионилхлорид, и брома в соответствии с ранее опубликованным способом 8.
      3. Удалить DMF с помощью лампы-к-колбы вакуумной перегонки при 40-60 ° C 9.
      4. Очищают остаток методом колоночной хроматографии (силикагель, 7% метанол / дихлорметан) с получением указанного продукта 2 в виде коричневого аморфного твердого вещества (1,09 г, 72%) 10.
    2. Синтез 4- (4-аминофенил) -2- (4,7,10-три- трет-бутоксикарбонилметил 1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-ил) бутановой кислоты трет - бутилового эфира (3).
      1. Растворить производного нитробензола 2 (1,00 г, 1,28 ммоль) в этаноле (10 мл) и 7 н раствора аммиака в метаноле (150 мкл). Добавить палладий на активированном угле в качестве катализатора (Pd / C, 150 мг, 15% мас) до Solutiна.
      2. Взболтать гетерогенную смесь в течение 16 ч в атмосфере водорода (2,5 бара) в Hydrogenator аппарате Парра.
      3. Приготовьте торт кизельгура, приостановив его в этаноле и фильтрации суспензии через воронку из спеченного стекла. Налейте суспензии из 1.1.2.2 по подготовленной торт, чтобы удалить катализатор Pd / C фильтрованием.
      4. Растворитель удаляют путем осторожного перегонке на роторном испарителе (температура бани воды ~ 40 ° C) , чтобы получить соединение 3 в виде коричневого аморфного твердого вещества (0,91 г, 95%).
    3. Синтез 4- (4-изотиоцианатофенил) -2- (4,7,10-три- трет tetraazacyclododec-1-ил бутоксикарбонилметил-1,4,7,10-) трет - бутилового эфира бутановой кислоты (4).
      1. Добавить тиофосген (0,124 мл, 1,58 ммоль, 1,3 экв.) В смеси 3 (0,91 г, 1,22 ммоль) и триэтиламин (0,685 мл, 4,87 ммоль, 4 экв.) В дихлорметане (15 мл).
      2. Энергично размешайте ми реакцииxture с магнитной мешалкой при комнатной температуре в течение 16 ч.
      3. Растворитель удаляют путем осторожного перегонке на роторном испарителе (температура бани воды ~ 40 ° C), а затем очищают сырого продукта с помощью хроматографии на колонке (силикагель, 5% метанол / дихлорметан) с получением продукта 4 в виде светло - коричневого аморфного твердого вещества (0,51 г, 53%).
  2. Синтез дендримеров DCA.
    1. Синтез дендримера 5.
      1. Возьмем G4-ПАМАМ-дендримера (667 мг, 10% раствор дендримера в метаноле, 4,67 мкмоль), выпаривание метанола путем осторожного перегонке на роторном испарителе (температура воды в ванне ~ 40 ° C), и остаток растворяют в ДМФА (4 мл) ,
      2. Добавить триэтиламин (0,105 мл, 0,75 ммоль, 160 экв.), Перемешивают в течение 45 мин при 60 ° С, и добавляют изотиоцианат 4 (354 мг, 0,45 ммоль, 1,5 экв. По отношению к амино поверхностных групп дендримера) порционного Овег 1 ч.
      3. Реакционную смесь перемешивают с помощью магнитной мешалки при 45 ° C в течение 48 часов.
      4. Растворитель удаляют с помощью лампы-к-колбы вакуумной перегонки при 40-60 ° С.
      5. Очищают остаток с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием липофильную среду гель-фильтрации и метанола в качестве элюента. Чтобы упаковать колонку, набухают фильтрующей среды в метаноле в течение не менее 3 ч при комнатной температуре (> 4 мл метанола на 1 г порошка) без применения давления. Выполнение гравитационного разделения путем сбора 1 мл фракции.
      6. Анализ собранных фракций тонкослойной хроматографии (ТСХ). Разработка пластины тонкослойной хроматограммы, в 15% метанол / дихлорметан (только наиболее полярное пятно расположено на базовой линии является производным от дендримерного продукта). Выпарить собранных фракций путем осторожного перегонке на роторном испарителе (температура бани воды ~ 40 ° C) , чтобы получить продукт 5 (270 мг, 91%).
    2. Синтез дендримера 6.
      1. Растворить защищенный дендритное хелатор 5 (270 мг, 4,23 мкмоль) в муравьиной кислоте (5 мл) и перемешивали смесь при 60 ° С в течение 24 ч.
      2. Упаривают муравьиной кислоты путем перегонки в роторном испарителе (~ 15 мбар давления, температуры водяной бани ~ 40 ° C) и подвергают сублимационной сушки продукта , чтобы дать 6 (давление ~ 0,2 мбар) 9.
    3. Синтез дендритного контрастного вещества (DCA)
      1. Растворите дендритное хелатор 6 (4,35 мкмоль) в воде и доведения рН до 7,0 с помощью гидроксида натрия 0,1 М.
      2. Растворите GDCL 3 · 6H 2 O (113 мг, 304 мкмоль) в воде (1 мл) и добавляют его по каплям к раствору хелатор 6 в течение периода 4 часов; поддерживать рН на уровне 7,0 с помощью водного раствора гидроксида натрия (0,05 М) путем измерения рН с помощью рН-метра.
      3. Перемешать смесь с помощью магнитной мешалки при комнатной темпера тура в течение 24 часов.
      4. Добавить этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА, 158 мг, 426 мкмоль) в порционно раствор в течение 4 ч, чтобы удалить избыток Gd (III), при поддержании рН на уровне 7,0 с водным раствором гидроксида натрия (0,05 М). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч.
      5. Выполнение эксклюзионной хроматографии для удаления большинства GdEDTA и избыток ЭДТА. Используйте гидрофильную среду гель-фильтрации набуханию в воде для упаковки колонки. Снизить смесь до подходящего объема и загрузить колонку. Элюируют колонку деионизированной воды без применения давления.
      6. Центрифуга образца с использованием центробежного блока фильтров 3 кД в течение 30 мин при центробежной силы 1,800 XG, чтобы удалить остатки GdEDTA и ЭДТА. Повторите этот шаг (около пяти раз) до тех пор, пока фильтрат не показывает отсутствие ЭДТА и GdEDTA. Переноса образца в колбу, испарить его, и затем подвергают сублимационной высушить растворитель с получением не совсем белого продукта в качестве окончательного DCA (186 мг, 71%).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте отсутствие ЭДТА и GdEDTA с помощью ESI-MS.
      7. Подтвердите отсутствие Gd (III) в виде свободного иона с использованием тест ксиленол оранжевый. Растворите фильтрат (0,5 мл) в качестве ацетатный буферный раствор (рН 5,8). Добавьте несколько капель ксиленол оранжевого раствора и отслеживать изменение цвета (желтый или фиолетовый цвет указывает на отсутствие или наличие свободного Gd (III) ионов в растворе, соответственно) 11.

2. In Vitro Характеристика дендритного продуктов

  1. Оценка числа макроциклических DOTA-единиц , соединенных с ПАМАМ - дендримера (загрузка с дендримером с DOTA-подобных макроциклов)
    1. Оценка с 1 H ЯМР (ЯМР - спектроскопии ядерного магнитного резонанса).
      Примечание: Эта процедура возможна на дендримеров 5 и 6, но не на АКН.
      1. Запись спектра 1 H ЯМР 12.
      2. Интеграция ароматическую область и двух отдельных алифатических областей (1. сигналы алифатической дендримера и макроциклических протонов; 2. сигналы т - Bu групп) , или просто алифатический область для дендримеров 5 и 6, соответственно.
        Примечание: Там нет отдельного сигнала в алифатической области возник из Т - Bu групп в дендримера 6 , так как они были гидролизованы.
      3. С помощью уравнения. 1 или уравнение. 2 для оценки числа макроциклических единиц (п), где R = отношение интегралов (алифатические / ароматические в уравнении. 1 или алифатического-дендример / Bu t- алифатические в уравнении. 2), H = dend число протонов в дендримера, H Ar = количество ароматических протонов, Н т Ви = число протонов в т - Bu групп и H = макинтош число протонов в одном макроцикла.
        Примечание: В любом уравнение. 1 или уравнение. 2 может быть использован FOг дендример 5, в то время как только уравнения. 1 может быть использован для дендримера 6. Поскольку обмениваемые протоны (на амины, амиды, тиомочевины, или карбоксилаты), как правило, заменяются дейтерием, они не принимались в расчетах. Здесь H dend использовались = 1128 (на 5) или 1000 (для 6), H Ar = 4, и H = 27 макинтош.
        figure-protocol-1 (1)
        figure-protocol-2 (2)
    2. Оценка с помощью элементного анализа, используя соотношение количества азота к сере.
      1. Выполните элементный анализ на твердом дендритного образце (DCA в этой работе).
      2. С помощью уравнения. 3 для оценки количества макроциклических единиц (п), где R = соотношение определяется% N и% S, N или S dend dend = числоазота или атомы серы в дендримера, и N или Макинтош S = макинтош число атомов азота или серы в одном макроциклических блоке.
        Примечание: Коэффициент 2,29 получается из соотношения в атомных масс серы и азота. В этой работе были использованы N dend = 250, S dend = 2, N = 5 макинтош, и S = 1 макинтош.
        figure-protocol-3 (3)
    3. Оценка с матрицей при содействии лазерного времени десорбции / ионизации полета (MALDI-TOF).
      1. Проведение анализа MALDI-TOF MS 13.
      2. Подсчитать количество макроциклических единиц (п) в соответствии с уравнением. 4, где М г = наблюдаемая масса (м / г), г = заряд вида, M = dend масса дендритного части, а М макинтош = масса одного макроциклического единицы.
        НЕТTE: M dend = 14306 и М = макинтош 719 были использованы в данной работе.
        figure-protocol-4 (4)
  2. Определение концентрации DCA ([DCA]): Bulk измерение магнитной восприимчивости (BMS)
    1. Растворите DCA (5-10 мг) в воде (360 мкл) в пластиковом флаконе трубки ([DCA] ~ 5-10 мМ).
      Примечание: [DCA] должна находиться в диапазоне 5-10 мм , чтобы избежать возможного дублирования Т- BuOH резонансов при концентрации образца> 15 мм, с резонансом воды при & delta ; = 4,7 частей на миллион.
    2. Добавьте 60 мкл D 2 O: t- смесь BuOH (2: 1 об / об) к водному раствору DCA и смешивают полученный раствор (420 мкл) с использованием вихревой мешалки.
    3. Передача 400 мкл образца в наружную ЯМР трубки и поместить коаксиальный ЯМР вставная измерительная трубка с t- BuOH: Н смесь 2 O (10:90 об / об) в пробирку для образца.
    4. запись1 Н - ЯМР - спектр и измерить сдвиг частоты между резонансных сигналов , вытекающих из Т- BuOH во внутренних и внешних трубок ЯМР (эталон) 12.
    5. С помощью уравнения. 5 для определения [DCA], где Т = абсолютная температура, Δχ = зарегистрированный сдвиг, ц эфф = эффективный магнитный момент для иона лантанида (М эфф = 7.94 для Gd (III) 14, и S = константа , зависящая от формы образца и его положение в магнитном поле (0, 1/3, и 1/6 в случае сферы, цилиндра, параллельной и цилиндра, перпендикулярной к магнитному полю, соответственно).
      Примечание: Вычисленное значение , полученное для [DCA] должно быть скорректировано до исходной концентрации из - за добавления D 2 O: t- раствор BuOH (60 мкл).
      figure-protocol-5 (5)
  3. Динамический светрассеяния (DLS) измерения.
    1. Приготовьте отфильтрованного раствора DCA (0,2 мкм политетрафторэтилена / PTFE фильтр, 0,75 мМ на Gd (III)), в 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) буфере (25 мМ, рН 7,4) и передать его в кювета для измерения DLS.
    2. Поместите кювету в DLS аппарата и установите следующие параметры: 5 повторений 15 сканирований (1 сканирование = 12 сек, показатель преломления = 1,345, поглощение = 1%), без задержек между сканирований и уравновешивания температуры 30 сек до записи ,
    3. Экспорт полученных данных и получить гистограмму распределения частиц по размерам, откладывая населения (%) в зависимости от размера (гидродинамический диаметр).
  4. Измерение продольной и поперечной relaxivities.
    Примечание: Аналогичная процедура была описана уже с использованием анализатора времени релаксации 15; Эта процедура была выполнена с использованием 300 МГц ЯМР-спектрометр с Topspinпрограммного обеспечения.
    1. Подготовить набор решений DCA в H 2 O: D 2 O (500 мкл, 10% D 2 O в H 2 O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 и 5,0 мМ, [HEPES ] = 25 мМ) от DCA фондовой образца (смотри раздел 2.2).
    2. Передача 450 мкл раствора в ЯМР-трубки и поместить его в прибор.
    3. Оптимизация параметров измерения (длительность 90 ° импульс возбуждения (p1), и облучения сдвиг частоты (O 1)) , а затем выполнить Т 1 и Т 2 эксперименты с использованием восстановления инверсии (ИК) и автомобилей-Перселла-Meiboom-Gill (CPMG ) импульсных последовательностей, соответственно.
    4. Определение времени Т 1 и Т 2 релаксации.
      1. Выберите Записанная измерения, обрабатывать 2D-спектр в размерности F2, а также выполнять интерактивную коррекцию фазы.
      2. Выберите нужный фрагмент (пик с максимальной интенсивностью) в анализе / T 1 / T 2 окна релаксации, интегрировать его, а также экспортировать область к модулю релаксации.
      3. Выберите соответствующую функцию фитинга (invrec или uxnmrt2 для ИК и CPMG экспериментов соответственно) , чтобы получить времена релаксации T 1 или T 2.
    5. Повторите шаги 2.4.4.2-2.4.4.4 для всех остальных [DCA] решений.
    6. Расчет скорости релаксации (R 1 и R 2) из полученных значений T 1 (R 1,2 = 1 / T 1,2).
    7. Участок R 1 и R 2 (с -1) в зависимости от концентрации Gd (III) , в мм.
    8. Определить продольные и поперечные relaxivities, R 1 и R 2 (мм -1 с -1), из наклона подобранной линии, как определено формулой. 6, где R я, набл = продольная (я = 1) или поперечной (я = 2) диамагнитны скорость релаксациивода в отсутствие парамагнитных частиц и [Gd] = концентрации Gd (III), используемых в эксперименте.
      figure-protocol-6 (6)

3. In Vitro МРТ; Сравнение между АКН и GdDOTA

  1. Подготовка труб фантомов
    1. Готовят водные растворы DCA (4 х 350 мкл) и GdDOTA (4 х 350 мкл), а также проб воды (4 х 350 мкл) для двух наборов экспериментов, в которых рассчитывается концентрация контрастных веществ: (3.1.1.1) в Б-г (III), или (3.1.1.2) на молекулу.
      1. Подготовить два образца DCA и два GdDOTA Образцы с концентрацией 0,5 и 1,0 мМ на Gd (III), соответственно. Кроме того, подготовить две пробы воды (в качестве контрольных трубок).
      2. Подготовить два образца DCA (2,5 и 5,0 мм в Б-га (III) или 0,05 и 0,1 мм в дендритного молекулы), два образца GdDOTA (0,25, 0,5 мм) и две пробы воды (CONTROл трубы).
        Примечание: Соответствующие концентрации DCA и GdDOTA должны быть получены путем разбавления соответствующих образцов сырья с концентрацией определяемых с помощью метода BMS (смотри раздел 2.2) с HEPES буфера (рН 7,4). Для упрощения вычислений, п = 50 предполагалось, для среднего числа макроциклических звеньев на молекулу дендримера. Таким образом, отношение DCA: GdDOTA было 1: 5, рассчитанный на одну молекулу основе.
    2. Поместите образцы в 300 мкл пластиковый флакон пробирки, избегая наличие пузырьков воздуха в растворе.
      Примечание: Размер пластиковых флаконах труб зависит от типа и размера катушки, используемой радиочастотная (здесь приведен пример с катушкой объема дается).
    3. Вставьте образцы внутри шприца (60 мл объема), залейте его 1 мМ GdDOTA решение, и поместить его в сканер.
      Примечание: Образцы помещали в водный раствор GdDOTA, чтобы избежать восприимчивости эффектов (вариации в поле с магнитнойtrength, которые происходят вблизи границы раздела между веществами различной магнитной восприимчивости).
  2. Оптимизация параметров и обработки изображений.
    1. Используйте анатомическое сканирование (локализатор / Tripilot), чтобы поместить шприц с образцами в изоцентру магнита.
    2. Нажмите светофор (настройка сканирования) для выполнения регулировок для подкладок (регулировка однородности магнитного поля) всего объема, центральная частота (O 1), усиление приемника (RG), а также усиления передачи (Tx0 и TX1).
    3. Для T 1 -weighted (T 1w) изображения, выберите способ быстрого низкий угол выстрела (FLASH).
    4. Выберите корональной кусочек для образцов, помещенных вертикально (шприц горизонтально) в сканер с помощью радиомаяка сканирования.
    5. С помощью уравнения. 7 для оптимизации контраста к шуму (CNR) приобретения параметров 16, где α = угол флип, TE = эхо времени, TR =время повторения, и T 1, A, T 1, B = Т 1 раз образца А (Т 1, А) и образца В (Т 1, B) , для которых CNR должен быть максимальным (то же самое справедливо для T 2 раза: T 2, а и Т 2, Б).
      Примечание: Т 1 и Т 2 времена релаксации должны быть установлены в значения , полученные из измерений продольных и поперечных relaxivities (раздел 2.4), в то время как ТЕ, ТР, и α должны быть получены из расчета оптимизации CNR.
      figure-protocol-7 (7)
    6. Приобретать изображение, используя параметры, полученные на предыдущем этапе (3.2.5).
    7. Вычислить отношение сигнал-шум (SNR).
      1. Загрузите приобретенный T 1w изображение (Сканирование) на дисплей и обработка изображенийокно и нажмите Определить области интереса (ROI).
      2. Выберите круглую ROI и нарисуйте его на позиции образца и фона. Затем нажмите на дисплее для получения средней амплитуды сигнала (S) сигнала и стандартного отклонения фона (S - шум).
      3. Повторите шаг 3.2.7.2 для АКН, GdDOTA и проб воды.
      4. Вычислить SNR , используя формулу: SNR = S сигнал / шум S.
    8. После слегка измененной процедуры выполнения T 2 -weighted (T 2W) изображений с помощью быстрого приобретения с (редком) методом улучшения релаксации. Для оптимизации параметров приобретения CNR, использовать уравнение. 8.
      figure-protocol-8 (8)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Получение DCA состояла из двух этапов: 1) синтез мономерный DOTA типа хелатор (рисунок 1) и 2) сочетания комплексообразователя с G4 ПАМАМ - дендримера и последующей подготовки дендритного Gd (III) комплекса (Рисунок 2) , На первом этапе был подготовлен Циклен на основе DOTA типа хелатор, содержащий четыре карбоновых кислот и ортогональная группа пригодна для дальнейших синтетических модификаций. Подготовка началась с 1 (...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Подготовка дендритного МРТ контрастного агента требует соответствующего выбора мономерной единицы (т.е. хелатор для Gd (III)). Они снижают токсичность этого парамагнитного иона и, на сегодняшний день широкий спектр ациклических и макроциклических энтеросорбенты Этой цели служат 1-3. Среди них, макроциклические комплексоны DOTA типа обладают самой высокой термодинамической стабильностью и кинетической инертностью и, следовательно, являются наиболее предпочтительным выбором для приготовления инертны MR...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Выражаем благодарность за финансовую поддержку Общества Макса Планка, Министерства национального образования Турции (стипендия доктора философии для С. Г.) и Немецкой академической службы обмена (DAAD, стипендия доктора философии для Т. С.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CyclenCheMatechC002
tert-бутилбромоацетат Альфа АесарA14917
N,N-диметилформамидFluka40248
Карбонат калияSigma-Aldrich209619
4-(4-Nitrophenyl)бутриевая кислотаAldrich335339
Thionylхлорид Acros Organics382662500Примечание: Коррозионное вещество; токсичен при вдыхании
БромAcros Organics402841000Примечание: вызывает сильные ожоги кожи, смертельный исход при вдыхании.
Диэтиловый эфирлюбого источника
сульфат натрияAcros Organics196640010
хлороформ;VWR Chemicals22711.29
tert-Бутил 2,2,2-трихлорацетимидатОлдрич364789Примечание: легковоспламеняющееся вещество; раздражает кожу и глаза
трифторид бора эфиратAcros Organics17456025048% BF<суб>3. Примечание: Легковоспламеняющееся вещество; вызывает ожоги кожи, приводит к летальному исходу при вдыхании
бикарбонат натрияAcros Organics424270010
этилацетатлюбой источникДля колоночной хроматографии
< em>n-Hexaneлюбой источникДля колоночной хроматографии
Лампочка в колбу (Kugelrohr) дистилляционный аппаратBü chiТип модели: Стеклянная печь B-585
СиликагельCarl Roth GmbHP090.2
Метаноллюбой источникДля колоночной хроматографии
Дихлорметан любой источникДля колоночной хроматографии
ЭтанолVWR Chemicals20821.296
АммиакAcros Organics4283810007 N Раствор в метаноле
ПалладийAldrich64318115% влажный
аппарат для гидрогенизации PARRPARR Instrument Company
Celite 503Aldrich22151
Спеченное стекло воронкалюбого источника
ТиофосгенОлдрич115150Примечание: раздражает кожу; токсичен при вдыхании
ТриэтиламинАльфа Аэсар А12646
Дихлорметан Acros Organics348460010Экстра Сухие 
Магнитная мешалкалюбого источника
PAMAM G4 ДендримерAndrews ChemServiceAuCS - 29710% масс. раствор в MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20SigmaLH20100
Тонкослойные хроматографические пластиныMerck Millipore1.05554.0001
Муравьиная кислотаVWR Chemicals20318.297
Лофилизатор любой источник
Гадоллиний(III) хлорид гексагидратAldrichG7532
Гидроксид натрияAcros Organics134070010
pH-метрлюбой источник
Этилендиаминтетрауксусная кислота динатриевая соль дигидратAldrichE5134
Масс-спектрометр (ESI)AgilentIon Ловушка SL 1100 
Ацетатный буферлюбого источникаpH 5,8
Ксиленол оранжевыйAldrich5209720 μ M в ацетатном буфере
Hydrophylic Sephadex G-15GE Healthcare17-0020-01
Amicon Ultra-15 Центробежный фильтрующий блокMerck MilliporeUFC900324мембрана Ultracel-3 (MWCO 3000)
Центрифугалюбого источника
ЯМР-спектрометр BrukerAvance III 300 МГц
TopspinBrukerVersion 2.1
Прибор для анализа горенияEuroVector SpAEuroEA 3000 Элементный анализатор 
MALDI-ToF MS приборПрикладные биосистемыVoyager-STR
DeuteriumoxidCarl Roth GmbH6672.3
tert-бутиловый спиртCarl Roth GmbHAE16.1
Вихревой смесительлюбой источник
ЯМР трубки NorellDeutero GmbH507-HP-7
ЯМР коаксиальная трубкаDeutero GmbHcoaxialb-5-7
DLS instrumentMalvernZetasizer Nano ZS
0.20 μ m Фильтр из ПТФЭ Carl Roth GmbHKC94.1
HEPESFisher BioReagentsBP310
Пластиковые пробиркилюбого источника
DotaremGuerbetNDC 67684-2000-1
МРТ сканерBrukerBioSpec 70/30 USR магнит (7 Тл). Примечание: потенциальная опасность, связанная с сильными магнитными полями
ВЧ катушкиBrukerDual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (программное обеспечение)BrukerVersion 5.1
, ,

Ссылки

  1. Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, É The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , Wiley. (2013).
  2. Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).
  3. Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).
  4. Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).
  5. Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).
  6. Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).
  7. Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
  8. Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).
  9. Vogel, A. I., Furniss, B. S. Vogel's textbook of practical organic chemistry. 5th ed. , Longman. (1989).
  10. Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. , Wiley-VCH. (2013).
  11. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
  12. Keeler, J. Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. , Wiley. (2010).
  13. Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. , Wiley-VCH. (2007).
  14. Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
  15. Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844(2011).
  16. Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).
  17. Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).
  18. Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. Primer on Gadolinium Chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
  19. Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).
  20. Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).
  21. Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).
  22. Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).
  23. Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge. Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).
  24. Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).
  25. Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).
  26. Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).
  27. Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).
  28. Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Приготовление контрастного вещества для МРТсинтез дендримера PAMAMконъюгация хелатора DOTA-типахелатирование гадолинияэксклюзионная хроматографияанализ методом протонного ЯМРизмерение релаксивностиТ1-взвешенная визуализацияТ2-взвешенная визуализация
подготовки и
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.