Method Article

Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный S -citalopram

DOI:

10.3791/54792

⸱

November 27th, 2016

 ,  , 
1Vollum Institute, Oregon Health & Science University, 2Graduate Group in Biophysics, University of California, San Francisco, 3Howard Hughes Medical Institute, Oregon Health & Science University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись описывает , как для скрининга thermostabilizing мутации, очищают человека переносчик серотонина, генерировать высокоаффинных антител, и кристаллизовать переносчика серотонина-антитело , связанный с антидепрессант S -citalopram. Этот протокол может быть адаптирован к изучению других сложных мембранных транспортеров, рецепторов и каналов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Переносчика серотонина является переносчика натрия и хлорида в сочетании , что "насосы" внеклеточного серотонина в клетки. S -citalopram является препарат , используемый для лечения депрессии и тревоги путем связывания с переносчика серотонина с высоким сродством, блокируя обратный захват серотонина. Здесь мы сообщаем эффективную процедуру и набор инструментов для стабилизации ситуации , экспресс, очищающих и кристаллизуются переносчика серотонина-антитело комплексы , связанные с S -citalopram и других антидепрессантов. Мутации , которые стабилизируют переносчик серотонина были идентифицированы с помощью S -citalopram анализа связывания. Серотонин Транспортер выражается в бакуловирусом трансдуцированных HEK293S GnTI - клеток, был воссоздан в протеолипосом и используется для повышения высоким сродством антител. Мы разработали стратегию, чтобы обнаружить антитела, которые являются полезными для структурных исследований. Также было установлено, Прямолинейный подход для экспрессии фрагментов антител в клетках Sf9.Транспортер-антитело очищают с использованием этой процедуры хорошо вели себя и легко кристаллизуется, создавая комплексы с S -citalopram , что дифрагируют рентгеновские лучи до 3-4 Å разрешение. Разработанные стратегии здесь могут быть использованы для определения структуры других сложных мембранных белков.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Переносчик серотонина (SERT) представляет собой интегральный мембранный белок , который обеспечивает транспорт серотонина через клеточные мембраны 1. SERT принадлежит к семейству нейромедиатора симпорт натрия (НСС) , который также включает в себя дофамин и норадреналин транспортеров 2. SERT является молекулярная мишень широко назначаемых антидепрессантами и успокаивающие препараты , которые действуют конкурентно ингибируют серотонина транспорта 3. SERT эксплуатирует энергетически выгодный cotransport натрия для удаления нейромедиатора из синаптической щели. Обширный характеристика серотонинергической системы показал , что изменения в метаболизме серотонина , очевидно, влияет практически все неврологические процессы , включая настроение, сон, боль, познания, и агрессия поведения , 4. Функция SERT может быть изменена за счет использования антидепрессантов и селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (СИОЗС) как S -citalopram, а также psychostimulaNTS и наркотики наркомании , такие как амфетамин и 3,4-метилендиокси- N -methylamphetamine или "экстази" 1,2.

СИОЗС чрезвычайно важны для лечения расстройств настроения, однако точная структурная основа для их действия не очень хорошо изучены. WT СЕРТ нестабилен в моющих мицелл, препятствуя тем самым продвижение к трехмерной (3D) структуры SERT 5,6. В последнее время , мы разработали варианты SERT , которые являются стабильными робастно в широком диапазоне моющих средств и удержанию SSRI связывающей активности 6. Эти термостабильные варианты SERT были выбраны с использованием анализа термостабильность мерцаний на основе близости. Здесь мы опишем процедуру генерации высокоаффинных антител , которые могут связываться SERT, а также очистки и кристаллизации термостабильной SERT, в комплексе с антителом и S -citalopram.

Этот протокол предполагает, что SERT и 8B6 гены были успешнаY клонировали в BacMam 7 и насекомых экспрессирующих векторов, соответственно. Для получения антител, кДНК , кодирующие остатки 73-616 из WT SERT был клонирован в вектор BacMam с С-концевым Стрептококковое II теге (СЕРТ IC). Для экрана термостабильности, была использована SERT остатки 73-616 с C-концевой GFP, Strep II, и 10-His - теги (SERT TC). Мутации Отдельные точки были созданы в фоновом режиме SERT ТС. Для протокола кристаллизации, слитый белок СЕРТ-GFP , был использован с двумя раздельными -Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] и 10-His тегов, неся термостабильные мутанты, Y110A, I291A, и T439S и мутации поверхностных цистеинов , C554A, C580A и C622A (SERT CC). Расщепления тромбином последовательности (LVPRGS) также были вставлены в SERT CC после Q76 и T618 , чтобы позволить удаление N- и С-концами. Плазмиду, кодирующую 8B6 Fab был разработан, чтобы выразить как тяжелые и легкиецепи антитела с последовательностями секреции gp67 под контролем двух отдельных полиэдрина промоторов. C-конце тяжелой цепи антитела 8B6 была помечена с 8-His меткой и сайт расщепления тромбином был вставлен между тяжелой цепи и меткой.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Трансфекция Приверженец HEK293S GnTI - Клетки для термостабильность экрана

  1. Подготовка поли-D-лизином (PDL) -покрытие 96-луночные планшеты. Выполнить все работы в стерильном ламинарном потоке.
    1. Фильтр 25 мкг / мл раствора (PDL), молекулярный вес 70,000-150,000 Da, используя стерильный фильтр 0,2 мкм. Добавьте 50 мкл PDL в каждую лунку 96-луночного планшета культуры ткани (TC) пластины, обеспечивая дно равномерно покрыты, и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
    2. Раствор Аспирируйте PDL и промывают 200 мкл стерильной воды.
    3. Разрешить пластины высохнуть на воздухе в течение 2 ч до хранения при 4 ° С. PDL пластины с покрытием можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель.
  2. Трипсином адгезивных HEK293S клеток.
    1. Grow HEK293S до 80% сплошности в 10 см чашку выдерживали при 37 ° С с 8% CO 2. Один 10 см блюдо должно иметь приблизительно 10 миллионов HEK293S клеток. Не используйте клетки после 30-го пассажа!
    2. Вытяжку носители и промывают 5 мл фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Добавить 1 мл раствора трипсина-ЭДТА (0,25% трипсина, 0,02% ЭДТА) к клеткам и инкубируют в течение 2 мин при 37 ° С.
    3. Добавить 10 мл раствора Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и ресуспендирования клеток путем многократного пипетированием вверх и вниз с помощью серологической пипетки.
    4. Пипетка 10 мкл клеток и смешивают с 10 мкл раствора трипанового синего (0,4%). Определение плотности клеток с помощью гемоцитометра и светового микроскопа. Не рассчитывайте клетки, которые окрашен в голубой цвет, как они мертвы. Убедитесь, что жизнеспособность клеток превышает 90%.
  3. Тщательно Ресуспендируют трипсином HEK293S GnTI - клеток в среде DMEM с добавлением 10% FBS , дополненной до плотности 0,5 × 10 6 клеток / мл в Пипеткой резервуаре. Приблизительно 5 миллионов HEK293S клетки будут необходимы для каждой пластины. В общей сложности 24 конструкции могут быть трансфицированы на каждой пластине с помощью этой прotocol.
  4. С помощью многоканальной пипетки, добавьте 100 мкл клеток в каждую лунку планшета PDL покрытием. Ресуспендируют клеток в пипетку резервуаре после заполнения каждой пластины, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубируйте клетки в 37 ° C инкубаторе с 8% СО 2. Через 24 ч клетки, должны достигать примерно 80% сплошности.
  5. 1 ч до трансфекции замены носителя. Готовят комплексы реагента ДНК-трансфекции для трансфекции.
    1. Для каждой конструкции в фоновом режиме СЕРТ TC , чтобы быть подвергнуты скринингу, смешайте 450 нг ДНК с 45 мкл не содержащей сыворотки DMEM и перемешать. Добавить 1,6 мкл реагента для трансфекции в 45 мкл не содержащей сыворотки DMEM и перемешать.
    2. Немедленно добавьте разбавленный раствор реагента для трансфекции ДНК-раствора и перемешать. Не следует смешивать растворы в обратном порядке. Подождите 10 - 15 мин и добавляют 20 мкл трансфекции смеси реагентов / ДНК 4 лунок.
  6. После того, как все скважины были трансфицированы, смешайте пластину осторожно покачайте часть спинкие вперед и вернуться к 37 ° С инкубатор.
  7. После 16 - 24 ч заменить носитель с DMEM, содержащей сыворотку и 10 мМ бутирата натрия.
  8. Приблизительно через 48 часов после трансфекции удалить носитель и либо сразу приступить к термостабильности экрана или заморозить клетки при -80 ° C, которые будут использоваться в дальнейшем. Клетки можно хранить при температуре -80 ° С в течение нескольких недель.

2. Сцинтилляционный Proximity на основе термостабильность экран с S -citalopram

  1. Инкубируйте клетки с 200 нМ S -citalopram в 25 мкл TBS (трис - буферном солевом растворе - 20 мМ Трис, рН 8, 100 мМ NaCl) в течение 5 мин при комнатной температуре.
  2. Солюбилизации клеток путем добавления 25 мкл 8 мМ н-додецил-бета-D-maltopyranoside (C12M), 1 мМ холестериновый hemmisuccinate (CHS), ингибиторов протеаз (2 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), 0,1 мг / мл апротинина, 4 г / мл пепстатина а, и 4 мкг / мл лейпептина) в TBS, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Добавить 50 мкл TBS Wiй 20 нМ [3 H] циталопрам (81,7 Ки / ммоль), 0,1% бычьего сывороточного альбумина, и 2 мг / мл His-метка для анализа сродства сцинтилляционной близости (SPA) бусинки на три лунки для каждой конструкции. Для последнего также добавить такое же решение перечисленных, а дополняют 100 мкМ сертралина для определения неспецифического связывания. Убедитесь, что His-Tag сродством SPA бусин тщательно перемешивают при добавлении к 96-луночного планшета.
  4. Мера [3 H] циталопрам связывания с использованием 96-луночного сцинтилляционный счетчик при комнатной температуре с 1 мин Время счета на лунку. Продолжить подсчет пластин до суммарного количества не плато (примерно через 36 часов).
  5. Тепловые пластины в течение 15 мин в нагревательном блоке с нагретой крышкой при 33 ° C. Мера [3 Н] циталопрам связывание снова после нагрева , как это описано в разделе 2.4.
  6. Повторите шаг 2,4 - 2,5 и изменить стадию нагревания до 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C и 51 ° C. Регулировать нагрев температуры в зависимости от температуры плавления кажущийся (Гт)белка-мишени и термостабильности наиболее стабильной конструкции. Продолжайте нагревать пластины, пока все конструкции не имеют низкие удельные счетчики.
  7. Анализ данных для определения значений Tm.
    1. Определить среднее значение общего счета в минуту (CPM) каждого из них построить для скважин, которые не содержат сертралин путем усреднения 3 дублирующие скважин. Определить неспецифическую CPM путем усреднения CPM каждой лунки, содержащей сертралин в одной тарелке.
    2. Рассчитать удельную CPM путем вычитания неспецифического CPM от общей CPM.
    3. Вычислить Tm по нелинейной подгонки к сигмоидальной функции Больцмана. Конструкты с низким удельным CPM при комнатной температуре (<10% от WT) , как правило , не имеют точных значений Tm. Мутации от наиболее термостойких конструкции могут быть объединены вместе и подвергают скринингу на аддитивных увеличение термостойкости.

3. Выражение Transporter Человека Серотонин в HEK293S GnTI - клетки

  1. Transform химически компетентных клеток DH10Bac с 1 нг плазмиды.
    1. Добавить плазмиды к 50 мкл клеток DH10Bac и инкубировать на льду в течение 30 мин.
    2. Теплового шока DH10Bac клетки при 42 ° С в течение 30 сек. Добавить 200 мкл SOC среды и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 4 часов при встряхивании.
    3. Тарелка все бактерии на более Лурии Бульон (LB), пластину, содержащую 50 мкг / мл канамицина, 7 мкг / мл гентамицина, 10 мкг / мл тетрациклина, 100 мкг / мл 5-бром-3-индолил бета-D-галактопиранозида, и 40 мкг / мл изопропил- β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG).
  2. Изолировать LacZ - колонии (белые колонии) , выращенные при 37 ° С в течение 2 дней на чашках с LB.
  3. Вырастить несколько колоний O / N при 37 ° С в 5 мл LB, содержащих антибиотики и изолировать Бакмидную ДНК.
    1. Спин вниз бактерии при 1000 мкг в центрифуге в течение 5 мин. Удалите супернатант. Ресуспендируют бактерии с 200 мкл минипрепаративную гesuspension буфера.
    2. Лизировать бактерии путем добавления 200 мкл буфера для лизиса минипрепаративную и переворачивая трубку осторожно 10 раз. Добавьте 200 мкл нейтрализующего буфера.
    3. Удалить нерастворимой фракции центрифугированием при 14000 х г в течение 10 мин в центрифуге. Добавить 1 мл изопропанола, супернатант и прохлады при температуре от -20 & deg; С в течение 20 мин, чтобы осадить ДНК.
    4. Спин при 14000 мкг в течение 15 мин в центрифуге и отбросить супернатант.
    5. Промыть ДНК гранул с 70% этанола и снова вращаются со скоростью 14.000 х г в течение 15 мин. Удалите супернатант. Воздух сухой ДНК пока все этанола испарилась и ресуспендируют в 50 мкл воды.
      Примечание: Бакмидную ДНК должна быть трансфицированы в клетки Sf9 сразу для достижения наилучших результатов, но и может храниться при температуре от -20 & deg; C в течение нескольких недель.
  4. Трансфекцию Бакмидную ДНК в 1х10 6 клеток адгезивных Sf9 , выращенных в увлажненной камере при 27 ° С в чашке 6-луночного. Выполните все манипуляции культивирования клеток в стерильном ламинарном потоке.
      <литий> Удалить носитель из клеток и добавляют 2 мл свежей среды, Sf9. Добавить 5 мкг Бакмидную ДНК к 100 мкл сред Sf9 (раствор А).
    1. Добавить 8 мкл реагента для трансфекции sF9 катионного липида к 100 мкл сред Sf9 (раствор Б). Инкубируйте пробирку, содержащую раствор B в течение 5 мин.
    2. Смешать пробирку, содержащую Раствор А с раствором Б и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и добавляют весь раствор в клетки Sf9.
    3. Через 96 ч, урожай супернатант (вирус P1) путем пропускания через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Вирус Р1 может храниться в течение нескольких месяцев при температуре 4 ° С в темноте и использоваться повторно, чтобы сделать вирус P2 по мере необходимости.
  5. Добавить 100 мкл вируса от Р1 до 1 л клеток Sf9 при плотности 1 х 10 6 клеток / мл в Sf9 средах. Инфицировать клетки в течение 96 ч, растет при 27 ° С на качалке при 100 оборотах в минуту.
  6. Спин вниз клетки в центрифуге при 4000 х г в течение 15 мин и супернатант, содержащий фильтровальную вирусные частицы через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Выбросите осадок клеток. Determине вирусной плотности с использованием вирусного анализа бляшек или счетчик вирусов. Плотность вируса должна быть> 1 × 10 8 вирусных частиц на миллилитр. Вирус P2 можно хранить при температуре 4 ° С в темноте и использоваться в течение нескольких месяцев.
  7. Infect 10 л HEK293S GnTI - клетки 7 , выращиваемых в суспензии при 37 ° С с 8% CO 2 и 85% влажности на качалке при 130 оборотах в минуту в 293 экспрессирующих среде с 2% FBS при множественности инфекции (MOI) 2 и плотностью 3 × 10 6 клеток / мл, как правило , 30 - 50 мл вируса P2 на 800 мл клеток в 2 л колбе с перегородками.
    Примечание: Не рекомендуется использовать более чем 80 мл вируса P2 , так как HEK293S GnTI - клетки будут расти медленно и может стать нежизнеспособным из - за изменения рН. Sf9 СМИ более кислый, чем 293 Expression Media.
  8. 12 - 16 ч после заражения, добавить бутират натрия до концентрации 10 мМ с 1 М запас. 48 - 60 ч после заражения, урожай клетки центрифугированием при4000 мкг в течение 15 мин. Удалить супернатант.
  9. Не Ресуспендируют клеток в 150 мл TBS, 2 мкМ S -citalopram или другие ингибиторы SERT и хранят при -80 ° С до готовности для очистки.

4. Affinity Очистка переносчика серотонина для иммунизации и кристаллизацией

  1. Оттепель клетки от 10 л культуры в теплой воде (примерно 30 ° C) и ресуспендируют путем быстро не проходящие сквозь 10 мл пипеткой до однородного состояния.
  2. Готовят раствор моющего средства для солюбилизации (150 мл): 80 мМ Трис, рН 8, 150 мМ NaCl, содержащего 40 мМ C12M, 5 мМ CHS, и ингибиторов протеаз.
  3. Добавить все клетки в химический стакан с мешалкой и добавить весь раствор моющего средства к клеткам при перемешивании. Солюбилизации при температуре 4 ° С в течение 1 ч при перемешивании.
  4. Спин лизата при 8000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Откажитесь гранулы и декантируйте супернатант в чистую Ультрацентрифуга труб. Спин при 100000 мкг в течение 1 ч в ultracentrifuge. Выбросите осадок и фильтр супернатанта через фильтр с размером пор 0,2 мкм.
  5. Pass лизат в течение 10 мл стрептококкового сродства смолы помещенной в колонку с помощью перистальтического насоса , уравновешенной буфером для промывки: 1 мМ C12M, 0,2 мМ CHS, 5% глицерина, 25 мкМ липидный (1-пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро 3-фосфохолин, 1-пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3-фосфоэтаноламин, и 1-пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3-phosphoglycerol при мольном соотношении 1: 1: 1), и 1 S мкМ -citalopram или SSRI в TBS.
  6. Подключение Strep аффинной колонки к хроматографии (FPLC) жидкостной системы быстрого белка и промыть колонку со скоростью 2 мл / мин с 66 мл (объемы 6,6 колонка) промывочного буфера. Элюировать очищенный белок в то же буфере с добавлением 5 мМ desthiobiotin со скоростью 0,5 мл / мин с использованием 33 мл (объемы 3,3 столбцов) буфера. Собрать 1 мл фракции; Фракции пика будет ~ 10 мл. Очищенный белок можно хранить при температуре 4 ° С в течение 2 - 3 дней, если это необходимо.
    Примечание: Общий выход будет 3 -4 мг SERT CC и 1 мг SERT IC. Абсорбция 2 AU при 280 нм, равна 1 мг / мл SERT.

5. Воссоздание Transporter в липосомы для иммунизации

  1. Приготовьте липосом, содержащих asolectin: холестерин: липид А: мозга полярный липидный (мольное отношение 60: 17: 3: 20). Растворите липиды в 1 мл хлороформа и добавляют 40 мг общего липида до 100 мл стеклянную круглодонную колбу на указанном молярном соотношении.
    1. Выпаривают хлороформа в течение не менее 1 ч в вакууме при круглодонную колбу вращается в теплой воде, примерно 30 ° C.
    2. Увлажняет липиды путем добавления 10 мл TBS. Выдержите в буфере в течение 10 мин.
    3. Замораживание липида, помещая колбу в жидком N 2.
    4. Оттепель. Погрузитесь сферическое дно колбы в стакан с теплой водой, примерно 30 ° C. Разрушать ультразвуком в ванне для обработки ультразвуком в течение 5 мин.
    5. Вихревые и повторить шаги 5.1.3 - 5.1.4 10 раз или до липидаполностью ресуспендировали из нижней части и образует мутной суспензии.
    6. Выдавливание всю липидную смесь дважды через 200 нм фильтров. Липидный появится в виде суспензии молочного цвета до экструзии; после этого она будет полупрозрачной. Не следует добавлять всю липидную смесь в экструдер сразу, так как он может засориться, что приводит к потере образца.
    7. Спин липидов при 100000 х г в течение 20 мин и ресуспендируют в 0,5 - 1 мл TBS при концентрации 40 мг / мл.
  2. Концентрат очищенный Sert : IC 250 - 500 мкл с использованием белка концентраторы 100 кДа MWCO центрифуге 2 - 4 мг / мл и насыщают липосом с 5 мМ C12M. Добавить очищенный SERT с моющим средством: липидной смеси в 1 мл конечного объема.
  3. Удалить C12M с помощью 3-х последовательных добавлений 80 мг / мл гидрофобный абсорбционной смолой. В течение первых 2-х добавлений, инкубировать смолой с вращением в течение 2 ч при 4 ° С. Удалить смолу путем пропускания через стекловату. Выполните окончательную инкубации с смолойс ночевкой.
  4. Концентрат Протеолипосомы центрифугированием при 100000 х г в течение 20 мин. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 250 - 500 мкл TBS.
  5. Добавляют 10 мкМ конечную концентрацию S -citalopram в разведенном белка после окончательного удаления смолы.
  6. Солюбилизации 2,5 мкл протеолипосомах в ДСН-ПААГ-загрузочном буфере (62,5 мМ Трис, рН 6,8, 10% глицерина, 2% ДСН, 0,01% бромфенолового синего, 100 мМ DTT), и работать на геле SDS-PAGE при 200 В в течение 1 ч, чтобы гарантировать, что SERT был успешно восстановлен. Протеолипосомы можно хранить при температуре -80 ° С в виде аликвот при длительном хранении и оттаивали на льду до каждой иммунизации.

6. Скрининг антител, распознающих эпитопы 3D

  1. Экран гибридомных клеточных линий с помощью Вестерн-блоттинга. Антитела, которые распознают SERT с помощью Вестерн-блоттинга, вероятно, связывать линейные эпитопы и, вероятно, не будет полезным для структурных исследований.
    1. Смешайте 1 мкг purifiред SERT IC или SERT CC и работать на 4 с - 15% -ном SDS-PAGE при 200 V в течение 1 ч.
    2. Передача на нитроцеллюлозную мембрану при 200 мА в течение 30 мин с использованием буфера Towbin (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 20% (об / об) метанол, 0,1% SDS). Мембрану можно сушить и хранить неопределенно долго при комнатной температуре.
    3. Повторное смачивание мембрана с 10% метанола и промывают PBS (10 мМ фосфата, рН 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl).
    4. Блок с 5% сухого молока в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре.
    5. Промывают ЗФР и инкубируют с 1 мкг / мл антитела в PBS с 0,1% молока.
    6. Промыть экстенсивно с PBS, содержащим 0,1% Tween-20.
    7. Инкубируйте с антителом козы к антигенам мыши, конъюгированным с ИК-краситель разводили 1: 10000 в PBS с 0,1% твина 20 и 0,1% молока.
    8. Вымойте экстенсивно и сканирование с использованием системы визуализации.
  2. Смешайте супернатанта гибридомы , содержащий западные отрицательные антитела с 100 нМ СЕРТ CC белка , используя молярное соотношение 1: 2 (SERТ: МАБ) в 200 мкл TBS с 1 мМ C12M, 0,2 мМ CHS и 1 мкМ S -citalopram. Центрифуга при 100000 х г в течение 20 мин. Анализ супернатанта , содержащего SERT-мАт комплексы и анализируют с помощью флуоресцентной обнаружения вытеснительной хроматографии (фс) 8. Выбросите осадок.
    1. Выполнить по 100 мкл супернатанта на колонку вытеснительной при 0,5 мл / мин с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), снабженном флуоресцентным детектором (раздражений: 480 нм, эмиссия: 510 нм) с использованием рабочего буфера, содержащего TBS, 0,4 мМ лаурил мальтозу неопентилгликоль и 1 мкМ S -citalopram. Антитела, которые образуют комплексы заставит GFP-слитый белок, который элюируетс раньше, чем свободный транспортером из колонки вытеснительной.
    2. Развести комплексов до 10, 1, 0,1 нМ в 200 мкл TBS с 1 мМ C12M, 0,2 мМ CHS и 1 мкМ S -citalopram и запускать ФКЦБ. Антитела, которые до сих пор можно сдвинуть пик транспортеров при низких концентрациях наномолярными являютсявысокие вяжущие сродства и хорошими кандидатами для структурных исследований.
  3. Retest связывание ФКЦБ в присутствии 1 мМ серотонина. Антитела, которые специфически распознают СИОЗС конформации св зей не будет связываться в присутствии субстрата. Антитела, которые распознают 3D-эпитоп, который не изменяется в результате конформации будет связываться независимо от лиганда, присутствующего.
  4. Смешайте попарно различные комбинации антител и проверить связывания с ФКЦБ. Антитела, которые распознают различные эпитопы заставит СЕРТ для элюирования ранее в сочетании друг с другом по сравнению с связывание одного антитела.
  5. Для начальных структурных исследований, выбрать наибольшим сродством антитела, которые распознают эпитопы 3D.

7. Экспрессия фрагмент антитела в клетках Sf9

  1. Клон переменной и константные домены Fab с помощью ПЦР в насекомых системе экспрессии для экспрессии в клетках Sf9 с использованием стандартных протоколов.
  2. Трансфекцию 1 х 10 6 Sf9 клеток с 5 мкг Бакмидную ДНК , кодирующие легкие и тяжелые цепи 8-Его помеченной 8B6 Fab с последовательностью секреции gp67 (как указано в разделе 3.4).
  3. Урожай Р1 вируса 96 ч после трансфекции и добавляют 500 мкл вируса от Р1 до 1 л клеток Sf9 при плотности 1 х 10 6 клеток / мл в 2 - литровую колбу , чтобы сделать вирус P2. Инфицировать клетки в течение 96 ч при 27 ° С.
  4. Урожай вируса P2 (как указано в разделе 3.6).
  5. Infect 6 л Sf9 клеток при плотности 2 - 3 × 10 6 клеток / мл с MOI 2 с вирусом P2, обычно 40 - 50 мл на колбу с 1 л клеток Sf9 в каждом 2 - литровой колбе.
  6. Урожай клетки приблизительно 96 ч постинфекционной. Добавляют 50 мл фосфатного буфера, рН 8 при конечной концентрации 50 мМ в клетки и спина при 4000 х г в течение 20 мин. Выбросите осадок клеток и фильтр супернатанта через ячейки тангенциальным потоком с фильтром 0,2 мкм. Соберите супернатант и хранят при температуре 4 ° С в течение 2 - 3 дней, если это необходимо.

8. Очистка фрагментов антител из sF9 супернатанта

  1. Концентрат Sf9 супернатанта с использованием 30 кДа Молекулярный вес Cut Off (MWCO) тангенциальной проточной ячейки приблизительно 400 - 800 мл.
  2. Добавить имидазола, рН 8 при конечной концентрации 10 мМ и 10 мл His-меткой сродства смолы. Смешать в стакане в течение 1 ч при 4 ° С.
  3. Соберите His-метку сродства смолы путем центрифугирования при 2000 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант.
  4. Паковать-тег сродства смолы в колонку и подключиться к FPLC.
  5. Мытье His-метку сродства смолы в 2 мл / мин с 66 мл (объемы 6,6 колонка) 50 мМ фосфата рН 8, 150 мМ NaCl, 25 мМ имидазола.
  6. Элюировать 8B6 Fab-в 33 мл 50 мМ фосфата рН 8, 150 мМ NaCl, 250 мМ имидазола. Собрать 1 мл фракции.
  7. Развести аффинно-очищенные Fab с 10-кратным объемом охлажденного льдом 20 мМ ацетата, рН 5.
  8. Bind ФАБ 1 мл катионообменной колонке с использованием перистальтического насоса при 1 мл / мин.
  9. Отдельные Fab с использованием 30 мл Linуха градиент NaCl (0 - 500 мМ) в 20 мМ ацетата рН 5,5 с помощью FPLC. Fab будет элюировать в виде единственного пика при ~ 300 мМ NaCl.
  10. Анализ на 12,5% геле SDS-PAGE с использованием буфера, содержащего 100 мМ ДТТ. Тяжелые и легкие цепи 8B6 Fab будет работать на 27 и 25 кДа, соответственно, на редукционной геле SDS-PAGE.
  11. Фракции, содержащие фрагменты Fab бассейн и концентрируют, по крайней мере, на 10 - 15 мг / мл с использованием 30 кДа MWCO белка концентраторы в Бакет центрифуге при 3000 х г.
  12. Отрегулировать до рН 8 добавлением 1 М Трис рН 8 до конечной концентрации 50 мМ и хранят очищенный Fab в течение длительного времени при температуре 4 ° С. Общий выход составит 25 - 30 мг. Оптическую плотность 1,4 AU при 280 нм, равна 1 мг / мл 8B6 Fab.

9. Формирование Transporter-антитело и разделение с помощью вытеснительной хроматографии

  1. Для кристаллизации, очищают SERT CC стрептококком аффинной хроматографии в C12M , как описано ранее (раздел 4).
  2. Дайджест с тромбином для удаления меток (1: 100 м / м) и ЭндоН (в соотношении 1:10 вес / вес) O / N при комнатной температуре. Концентрат до 250 - 300 мкл с использованием 100 кДа MWCO центрифуга белка концентраторы до концентрации белка 10 мг / мл.
  3. Смешайте концентрированное SERT с Fab при мольном соотношении 1: 1,2 в объеме менее 500 мкл. Центрифуга при 100000 х г при 4 ° С в течение 20 мин. Собирают супернатант, содержащий комплекс SERT-Fab. Отбросить осадок.
  4. Раздельное с помощью вытеснительной хроматографии (SEC) с использованием FPLC на колонке вытеснительной уравновешенной в TBS с добавлением 40 мМ н-октил-β-D-maltoside (С8М), 0,5 мМ CHS, 5% глицерина, 25 мкМ липидов (то же, как на шаге 4.5) и 1 мкМ S -citalopram при 0,5 мл / мин.
  5. Сбор 0,5 мл фракции и анализируют на 4 - 15% SDS-PAGE гелей, а также с помощью флуоресценции триптофана по SEC. GFP, помеченный СЕРТ будет работать при температуре примерно 80 кДа на геле SDS-PAGE. После удаления и N-концов-связанных сахаров он будет работать как белок 45 кДа.
  6. Determine, какие фракции объединить путем объединения только фракции, которые монодисперсных судить по анализу фракции с помощью флуоресценции триптофана SEC (раздражений: 280, Излучение: 335 нм).
  7. Хранить очищенный SERT-8B6 комплекс при 4 ° С в течение до 1 недели.

10. Кристаллизация Transporter-антитело комплексов свисающими

  1. Перед кристаллизацией концентрат Пиковые фракции из разделения SEC комплекса СЕРТ-8B6 до 2 мг / мл, с помощью 100 кДа MWCO центрифуга белка концентраторы. Абсорбция 2 AU при 280 нм, равна 1 мг / мл.
  2. Добавление дополнительных Fab в соотношении 1: 0,05 комплекса: свободный Fab. Добавьте 10 мкМ свободный S -citalopram.
  3. Центрифуга при 100000 х г при 4 ° С в течение 20 мин. Собирают супернатант, содержащий SERT-Fab комплекс. Отбросить осадок.
  4. Настройка висячей капли экран 24-а при 4 ° С в соответствии с таблицей 1. Вырастить кристаллы качества дифракции над пластовых растворовсодержащего 100 мМ Трис-NaOH, рН 8,5, 25 - 125 мМ KCl, 32,5 - 34% ПЭГ 400 и 0,5% 6-аминокапроновой кислоты.
    Примечание: Используйте Трис скорректированные с помощью NaOH до рН 8,5 в качестве буфера. Не используйте Трис основание, установленное с HCl. Экран может быть получен в 2 мл пробирки и использовали пока не закончено. Позаботьтесь, чтобы точно пипеткой PEG 400 с использованием позитивного пипетку смещения как это чрезвычайно вязкая!
    1. Пипетка 500 мкл каждого резервуара раствора в низкопрофильных 24-луночный планшет с герметиком, приложенного к каждой лунке. Пипетка 1,5, 1,75, и 2 мкл комплекса СЕРТ-8B6 на обложку силиконизированный стекла скольжением 18 мм. Пипетка 1 мкл резервуарного раствора на верхней части образца белка.
      Примечание: Пластина была приобретена с уплотнителем уже нанесенного на ободе лунок.
    2. Нанесите крышку слайд на 24-луночных с каплями, с которыми сталкивается раствор пластового и запечатать сразу, нажав на покровное стекло герметик предварительно нанесен в каждую лунку.
    3. Продолжайте, пока все 24 скважины не были созданы.
    4. Оставьте готовую плиту в хорошо изолированном помещении при температуре 4 ° С. Не беспокоить пластины, по крайней мере, 3-х дней
      Примечание: монокристаллы будут появляться в течение примерно 3 дней и вырасти до 100-175 мкм через 14 дней.
  5. Кристаллы урожая в cryoloops и непосредственно флэш-прохладно в жидком N 2 до рентгеновской дифракции сбора данных.
  6. При необходимости найти дополнительные условия кристаллизации широкого скрининга с висячей капли. Используйте три капли с белком: осадителя соотношение 2: 1, 1,5: 1, 1: 1. Если робот доступен, а затем установить 100-150 Н.Л. падает на 70 мкл раствора резервуара в 96-луночный планшет. Большие 3D кристаллы можно выращивать в 24-луночных.
  7. Оценка основана на внешнем виде капли: 0, ясно; 1, пыли; 2, гранулированный осадок; 3, разделение фаз; 4, микрокристаллическая; 5, иглы; 6, плиты; 7, 3D кристаллы.
  8. Настройка кристаллизации путем повешения методы падения в 24-лунок, как описано выше вокруг вновь выявленных кондitions.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Библиотека одиночных точечных мутантов в фоновом режиме SERT TC был создан , чтобы экран для thermostabilizing мутации. Отдельные мутанты были получены с использованием стандартных мутагенеза. Протокол скрининга утилизирует трансфицированы клетки HEK293S и экран термостабильность сцинтилляционной близости на основе быстрого идентичности полезных мутаций для кристаллизации , как показано на рисунке 1А. Значения Plotting Tm в зависимости от связанного [3 H] циталопрам при КТ показывает конструкции с высоким уровнем термостабильности и выражение , пригодное для очистки белков (Фигура 1В). Три мутантов (Y110A, I291A, и T439S) были объединены , чтобы сформировать высокостабильный конструкцию (фиг.1С). Термостойкость также коррелирует с повышенной стабильностью в коротких моющих средств цепи, необходимых для кристаллизации комплекса СЕРТ-разборное.

Крупномасштабное выражение человеческого SERT использованием бакуловируса-TRansduced HEK293S GnTI - клетки может занять менее 2 -х недель и может производить миллиграмм количествах, как показано на рисунке 2А. Использование GFP-меченый СЕРТ CC белка позволяет СЕРТ быть удобно следуют во время экспрессии и очистки с помощью флуоресценции (Фигура 2В). Наша стратегия очистки включают 1) солюбилизацию SERT , связанный с S -citalopram из HEK293S GnTI - клеток в C12M в присутствии CHS в качестве стабилизирующего липидного; 2) связывание SERT к аффинной матрицы Стрептококкового; 3) удаление загрязняющих белков путем тщательной промывки; и 4) элюирование функциональной SERT с буфером , содержащим desthiobiotin (фиг.2с). Элюированный белок в значительной степени свободен от других обнаруживаемых белков кумасси синим окрашиванием и монодисперсных судить по ФКЦБ (рис 2D, E).

Аналогичная стратегия была взята для очистки SERT с меткой Strep II, который был использован для reconstitutioп и иммунизации (рис 3A, B). Включение SERT в протеолипосомах повышает время полужизни в сыворотке и стабильность SERT и повышает вероятность выделения высокой аффинности антител. Кроме того, включение липида А, компонента клеточной стенки бактерий, служит в качестве сильнодействующего адъюванта 9. Многослойные липосомы получают путем добавления буфера в высушенном липидной смеси в стеклянных трубках и ресуспендировали в буфере. Экструзия липосом через фильтры с размером пор 200 нм производит монодисперсных однослойные липосомальные суспензии. Липосомы затем насыщают с помощью моющих средств с последующим добавлением очищенной SERT в производстве моющих средств. И, наконец, моющее средство удаляют путем добавления гидрофобного поглощения смолы к липидной: моющее средство смеси. Дополнительный лиганд должен быть добавлен в разведенном образце, чтобы выбрать для антител, которые распознают антидепрессивный конформации св зей. Присутствие SERT в протеолипосом должны быть подтвержденысолюбилизации небольшой образец с ДСН-ПААГ-красителем или C12M и работает на SDS-PAGE и фс (рис 3C, D).

гибридомные клеточные линии, экспрессирующие Sert, антитела могут быть подвергнуты скринингу на высокой аффинности связующими, распознания 3D эпитопы. Эти свойства имеют решающее значение для конечного успеха кристаллизации, так как антитела должны оставаться прочно связанными с структурированной области для содействия кристаллической упаковки однородных, хорошо упорядоченных областей. На первом этапе, антитела, которые распознают неструктурированных участков идентифицированы. СЕРТ денатурацию и блоттинга на нитроцеллюлозную мембрану; антитела, которые связываются с денатурированным SERT будет западным положительным и, вероятно, признают линейные эпитопы. На фиг.4А показано , 2 примеры антител , которые являются вестерн-положительными и , вероятно , не является полезным для содействия кристаллогенезисе. На фиг.4В, остальные вестерн-отрицательные антитела инкубировали с 100 нМ SERT-GFP и разделеныFSEC. Антитела, которые связываются СЕРТ сместит GFP-положительных пиков на более ранней позиции. В SERT-антитело может быть разбавлен дополнительно в производстве моющих средств, чтобы определить, могут ли они связываться с наномолярной сродством с последующим анализом ФКЦБ. Добавление результатов серотонина в конформационных изменений в транспортере и, таким образом антитела могут быть снова просеивают, чтобы определить, могут ли они специфически распознают СИОЗС конформации св зей. На фигуре 4C, антитела , связываются SERT в присутствии серотонина, показывая , что эпитоп (ы) не изменяются от СИОЗС к субстрату связанного состояния. И, наконец, на фиг.4D комбинации антител тестируют на предмет их способности связывать различные эпитопы, что приводит к дальнейшему сдвигом влево. Здесь 15B8 или 8A11 антитела распознают эпитоп, который отличается от 8B6.

8B6 антител был выбран для дальнейшего структурного анализа на основе предварительного скрининга кристаллов с папаином сточTed Fab. Гены 8B6 Fab были клонированы в насекомое векторе экспрессии клеток. Fab может быть выражена и секретируемый из клеток Sf9, выращиваемых в суспензии. 8B6 Fab может быть очищен от клеток супернатанта Sf9 с помощью His-меткой аффинности (рис 5А, В) и катионообменной хроматографии (5С, D) , что приводит к протеину , который появляется без загрязнений на ДСН-ПААГ-гелей. На рисунке 5E, рекомбинантный 8B6 Fab показан для связывания SERT и используется в последующих биохимических и биофизических экспериментов.

Аффинно очищенные СЕРТ CC переваривали с тромбином и ЭндоН и смешивают с 8B6 Fab с образованием комплекса в присутствии S -citalopram. Транспортер-антитело затем отделяют SEC в С8М (6А) , и пиковые фракции содержат как SERT и Fab , как показано с помощью SDS-PAGE (Фиг.6В). Использование С8М имеет решающее значение для образования кристаллов, вероятно, потому, чтокороткая цепь моющее средство позволяет лучше упаковку между молекулами в кристаллической решетке. FSEC используется , чтобы определить , какие фракции должны быть объединены для кристаллизации (6С); Фракции, которые не являются монодисперсных и / или содержат большое количество свободного SERT или Fab не должны быть объединены.

Prism формы SERT-антитело кристаллы можно выращивать в присутствии S -citalopram с использованием этого протокола путем повешения диффузии паров капли (рис 7А). Полученные кристаллы рассеивают рентгеновские лучи с разрешением 3.15 Å 10 (рис 7б).

figure-results-1
Рисунок 1: сцинтилляционный Proximity на основе термостабильность Пробирной A.. Обзор протокола для скрининга термостабильность в присутствии [3 H] циталопрама. B. Максимальная связанный [3 (Tm). Пунктирные линии представляют значения для переносчика WT. 3 наиболее термостабильные мутанты помечены. Серая область представляет собой мутанты , которые имеют менее 10% [3 H] циталопрама связывания по сравнению с WT и , таким образом , неточных значений Tm из - за низкого сигнала к шуму. C. Кривые термостабильности для WT SERT TC и топ - 3 мутантов. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение (SD). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Обзор млекопитающим гетерологичного белка Expression A.. Схематизированы обзор поколения вируса BacMam и экспрессию SERT в HEK293S GnTI. - Клетки B. ОНK293S GnTI - клетки , экспрессирующие SERT CC (GFP флюоресценции) С.. Элюирование профиль SERT CC на Стрептококкового сродства смолы. Зеленый след представляет собой концентрацию desthiobiotin, 0 - 100% (0 - 5 мМ) D.. Анализ сродства очистили SERT CC на 4 с - 15% SDS-PAGE гель E.. FSEC аффинности очищенного SERT CC обнаруженного GFP флуоресценции (возбуждение: 480 нм; эмиссия: 510 нм). Пик элюирование в 15 мл SERT (#) и 18 мл свободно GFP (*). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Представитель Affinity Очистка и восстановление SERT IC A.. Схематический обзор генерации антител. <сильный> B. Профиль элюции наблюдается при 280 нм аффинной очистки SERT IC на Strep аффинной смолой. Зеленый след представляет собой концентрацию desthiobiotin, 0 - 100%. (0 - 5 мМ) C. Анализ сродства очищают и восстанавливают SERT на 4 с - 15% SDS-PAGE гель D.. FSEC солюбилизированного SERT после восстановления. Флуоресценции остатков триптофана использовали для обнаружения SERT (возбуждение: 280 нм, эмиссии: 335 нм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рис . 4: анализ представительных SERT антител A. Скрининг антител с помощью Вестерн-блоттинга. Примерно 1 мкг SERT CC с добавлением или без GFP наносили на 4 - 15% SDS -гель PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Связывание детектировали с использованием антитела козы к антигенам мыши, конъюгированного с ИК-красителем. 2G4 и 10F2 являются западные положительными. B. Связывание антител к 100 нМ GFP-меченый SERT и обнаружения с помощью обнаруженных с помощью ФКЦБ GFP флуоресценции. C. Связывание выбранных Fabs до 100 нМ GFP-меченый SERT в присутствии 1 мМ серотонина. D. Связывание 8A11 или 15B8 Fabs к SERT-8B6 Fab. Небольшие пики при элюировании в 18 мл свободны GFP. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Представитель Очистка 8B6 Fab из Sf9 сотами A.. Профиль элюции наблюдается при 280 нм очистки 8B6 Fab Его-тегом сродства chromatograp гип. Зеленый след представляет собой концентрацию имидазола, 0 - 50% (0 - 250 мМ) Б.. Невосстанавливающих и снижения SDS-PAGE гель после аффинной очистки His-меткой. Белок , который проходит около 50 кДа является нередуцированными Fab (#) и второстепенных видов при 25 кДа уменьшенные Fab (*). C. Профиль элюции наблюдается при 280 нм очистки 8B6 Fab катионным обменом, отображающего единственный симметричный пик, который элюирует под линейным градиентом хлорида натрия. Зеленый след представляет собой концентрацию NaCl, 0 - 100%. (0 - 500 мМ) D. Анализ 8B6 Fab на 12,5% геле SDS-PAGE После очистки с помощью катионообменной. E. Связывание 8B6 Fab 10 нМ GFP-меченый SERT, детектируют с использованием флуоресценции GFP. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

е 6 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg "/>
Рисунок 6: Представитель гельфильтрации Комплекса SERT-8B6 в присутствии S -citalopram A.. Гель-фильтрация элюирование профиль очищенного комплекса SERT-8B6. Основной пик при элюировании 11,5 мл является SERT-8B6 комплекс. Пик при 15 - 17 мл содержит GFP и Fab B.. Анализ очищенного SERT-8B6 комплекса на 4 с - 15% -ном SDS-PAGE. Позиции SERT и тяжелых и легких цепей Fab показаны черточками. C. FSEC размерных разделенных фракций. SERT-8B6 комплексов были обнаружены с помощью флуоресценции триптофана. Фракция 17 содержит большее количество SERT, которое не было сложным с Fab. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6 Рисунок 7: Кристаллизация комплекса SERT-8B6 привязанные к S -citalopram A.. При световой микроскопии параллелепипеда формы кристаллов СЕРТ-8B6 комплекса после 2-х недель роста. Шкала бар составляет 200 мкм. B. кристаллы SERT-8B6 дифракцию рентгеновских лучей до 3,15 Å. Синий кольцо представляет собой 3,15 Å. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1:. Кристаллизационной экран для комплекса SERT-8B6 привязанные к S -citalopram Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить эту таблицу.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определение структуры мембранных белков с помощью биофизических методов остается сложной задачей для многих с медицинской точки зрения значимых транспортеров, рецепторов и каналов 11. Здесь мы разделяем детальную экспертизу , разработанную для определения структуры человеческого переносчика серотонина , связанного с S -citalopram. Мы ожидаем, что эти методы будут полезны для определения структуры SERT в других конформационных состояний, а также структур других сложных мембранных белков. Кроме того, биохимические методы, описанные здесь, также могут быть использованы для изучения функции очищенного SERT в производстве моющих средств и почти нативный липидной среде.

SERT кристаллизации навесные при разработке ряда инструментов и методов. Во- первых, улучшение переносчика термостабильность производства варианты SERT , которые хорошо вели себя в различных моющих мицеллы после экстракции переносчика из мембран 6. Во-вторых, использованиевысокого сродства лиганда S -citalopram всей очистки и кристаллизации дополнительно улучшенную стабильность и снижение конформационной гетерогенности. В- третьих, развитие системы экспрессии BacMam 7 допускало для производства больших количеств SERT в течение короткого периода 2 -х недель, облегчающей как иммунизацию и кристаллизации. И, наконец, разработка стратегий, чтобы выбрать для высокого сродства антител, которые распознают эпитопы 3D разрешенные для открытия 8B6 антитела, которое способствует хорошо упорядоченную упаковку SERT-антитело комплексов в кристаллах.

Есть целый ряд критических этапов и реагентов, а также общие проблемы, которые часто встречаются по всему протоколу. Во-первых, поколение с высоким титром вируса СЕРТ P2 может быть проблематичным. Добавление низких концентраций вируса P1 генерировать вирус P2, как описано в данном протоколе, как правило, смягчает эту проблему, а также в тех случаях, когда титр вируса Р2 низкий, вирус Р3 может быть USINг вируса при MOI 0,0001. Вирусы с титром менее 1 × 10 8 вирусных частиц / мл не следует использовать , и почти всегда приводит к низким выходам протеина. Для экспрессии, HEK293S GnTI - клетки были выбраны , так как они не имеют N -acetylglucosaminyltransferase I активностью и , следовательно , не могут синтезировать сложные N -glycans, вместо того, чтобы производить только с высоким содержанием маннозы N -glycans. ЭндоН расщепляет N -связанной гликозилирование с высоким содержанием маннозы гликанах в двух местах в внеклеточной петле 2 (EL2), в результате чего N -acetylglucosamine присоединенный к аспарагин. Расщепление N -связанной сахара уменьшает поверхностную энтропию EL2 , которая , вероятно , важна для кристаллизации. Для получения антител, то СЕРТ ИС следует использовать для иммунизации. GFP является высокой иммуногенностью 12 и не должны использоваться в качестве слитого тега для получения антител , так как трудно полностью удалить с помощью SEC. Гибкий N- и С-конец SERT также не быливключены в конструкцию, чтобы избежать антител против этих регионов. Мыши могут быть иммунизированы 30 мкг высушенной белка; продолжают иммунизацией мышей до тех пор , высокие концентрации в сыворотке крови антител , не могут быть обнаружены и производить гибридомных клеток , как описано 13. Термостабилизированного конструкция, как правило, лучший выбор для иммунизации; если переносчик хорошо ведет себя и сохраняет биологическую активность После очистки этого часто бывает достаточно, чтобы поднять антитела. 8B6 антител индуцированные против WT SERT. Для кристаллизации, только пиковые фракции, содержащие от ОЦС монодисперсное комплекса можно судить по ФКЦБ должны быть объединены и сконцентрированы. кристаллы SERT-8B6 растут в узком диапазоне условий и существует целый ряд шагов, которые должны быть приняты для устранения проблем, непосредственно связанных с ростом SERT кристалла. Трис-основание регулируется с помощью НСl, не следует использовать в растворе резервуара, так как этот буфер не поддерживает рост кристаллов; Таким образом, CRITical вместо этого использовать Трис регулируется с помощью NaOH. Кристаллы SERT растут в узком диапазоне концентраций ПЭГ 400, так что, если кристаллы не растут или если наблюдаются много мелких кристаллов, даже небольшое увеличение или уменьшение концентрации ПЭГ 400 будет информирован. Кроме того, добавка 6-аминокапроновой кислоты, также был использован в оптимизированном экрана для улучшения зародышеобразования. Отношение капли белка: раствора а также является ключевым определяющим фактором для роста кристаллов. Отбросьте соотношения 1,5 - 2: 1 рекомендуется, при уменьшении соотношения ближе к 2: 1, как правило, поддерживая рост крупных 3-мерных кристаллов. И, наконец, использование низкопрофильных 24-луночные планшеты, также имеет решающее значение в направлении роста кристаллов, по-видимому из-за изменения скорости диффузии из паровой фазы.

Альтернативный подход к методу SPA был разработан для скрининга мутантов , которые стабилизируют крысы переносчик серотонина в кокаином переплете конформации с использованием фильтра анализа связывания 5. В противоположность этому, ба SPAСЕПГ анализ позволяет последовательных стадий нагревания следующих путем определения доли SERT, которая остается связанной с лигандом. Таким образом, это дает возможность быстрого определения температуры плавления от небольшого количества образцов. Метод СПА зависит от наличия радиоизотопный высокого сродства лиганда и, если не лиганды не известны, которые связываются с субмикромолярных сродством тогда альтернативный подход будет необходимо. Многие другие методы, как правило , используются для измерения стабильности белка , таких как связывание флуоресцентных красителей и калориметрии 14 , но имеют низкую пропускную способность, и либо не могут непосредственно измерить функцию или требуют большого количества белка. Если метод SPA не может быть использован, один альтернативный высокой пропускной подход является FSEC на основе анализа Термостойкость 15 (FSEC-TS), где образец нагревают с последующим отделением фракции остальных транспортером. FSEC-TS является полезным подходом для доступа к поведению хроматографического и олигомерного состояния и арowerful дополнительный инструмент, который может быть использован вместе с методом SPA.

Сравнение различных систем экспрессии общего белка было также установлено, пользу использования клеток млекопитающих для экспрессии SERT 16 и Unsurprisingly это, вероятно , в случае многих белков млекопитающего. Методы, которые мы использовали для выражения были приспособлены для SERT, но, скорее всего, могут быть легко адаптированы. Условия, которые благоприятствуют высокие уровни экспрессии должны быть тщательно определены путем изменения времени экспрессии, температуры, концентрации вируса, а также присутствие ингибиторов гистондеацетилазы, таких как бутират натрия.

Мы обычно предпочитают аффинной очистки в мягкой длинной цепью моющего средства, такие как C12M вместе с CHS до восстановления сохранить связывания высокого сродства лиганда. Разбавление с использованием гидрофобного поглощения является мягким методом, который мы нашли, чтобы быть эффективными в течение нескольких других транспортеров и рецепторов. Если этоне увенчались успехом, удаление моющих средств с высокой концентрацией критических мицелл диализом, разбавления или SEC может быть использовано при условии , 17 антиген является достаточно стабильным в таких моющих средствах. В тех случаях, когда не обнаружено подходящих антител, мы почти всегда находим вопрос в связи с потерей функции или денатурации антигена и в таких случаях мы успешно провели новые прививки, уделяя особое внимание биохимии белка. Наконец, лиганды и антитела, которые связываются с высоким сродством должны служить основой для рационального планируемого эксперимента кристаллизации и воспользовавшись термостабильной варианта, можно экранировать более широкий диапазон условий, изменяя свойства различных моющих средств. Кроме того, кристаллизация в липидной мезофазы 18 или с помощью бицелл 19 всегда следует рассматривать в качестве альтернативы кристаллизации в мицеллах.

Эти принципы и методы могут быть использованы с некоторыми modifiКатион для многих других трансмембранных белков, которые трудно выразить и очистить от других хостов экспрессии, и будут особенно полезны для определения структуры мишеней высокой аффинности препаратов.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Д. Коули за создание моноклональных антител. Мы благодарим А. Пенматсу и К. Ванга за обмен идеями и опытом, полученным с помощью транспортера дофамина. Л. Васкалису за помощь с рисунками, Х. Оуэну за помощь в подготовке рукописи и другим сотрудникам лаборатории Гуо за полезные дискуссии. J.A.C. получает поддержку от постдокторской стипендии Бантинга от Канадского института исследований в области здравоохранения. E.M.G. поддерживается стипендией Национального научного фонда для аспирантов. Мы особенно благодарны Берни и Дженнифер Лакрут за их щедрую поддержку, а также за финансирование от NIH (5R37MH070039). Э.Г. является научным сотрудником Медицинского института Говарда Хьюза.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DH10BacInvitrogen10361-012
КанамицинФишераBP906-5
ГентамицинФишераBP918-1
ТетрациклинSigmaT-7660
Bluo-galInvitrogen15519-0285-Бромо-3-индолил &бета;-D-галактопиранозид
изопропил бета-D-1-тиогалактопиранозидAnatraceI1003IPTG
Miniprep kitQiagen27106
Cellfectin IIInvitrogen10362-100Sf9 реагент для трансфекции
Sf9ATCCCRL-1711
Sf-900 III SFM media LifeTechnologies12658-027
HEK-293S GnTI-ATCCCRL-3022
Freestyle 293 медиаLife Technologies12338-018293 экспрессия медиа
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Life Technologies0984018DJ
Бутират натрияSigma303410
S-циталопрамSigmaE4786Anagrade
n-Dodecyl-beta-D-MaltopyranosideAnatraceD310
Холестерил геммисукцинатSigmaC6013
1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолинAvanti Polar Lipids850457P
1-пальмитоил-2-олеоил-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar Lipids850757P
1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоглицеринAvanti Polar Lipids840457P
ЛейпептинSigmaL2884
Пепстатин АSigmaP5318
АпротининSigmaA1153
PMSFSigmaP7626
Дестиобиотинiba Life Sciences2-1000-05
АзолектинSigma11145
ХолестеринSigmaC-8667
Липид АSigmaL5399
Полярный липид мозгаAvanti Полярные липиды141101C
BiobeadsBiorad152-3920Гидрофобная абсорбционная смола
Козья антимышиная IRDye 680RDOdyssey926-68070Используется в качестве вторичного антитела для вестерн-блоттинг
Лаурилмальтоза неопентилгликольAnatraceNG310Анаград
СеротонинSigmaH9523
pFastBac 8B6Доступно от авторов
pEG Bacmam SERT Strep IISERTIC, Доступно у авторов
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep HisSERTTC, Доступно у авторов
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep HisSERTCC, Доступно у авторов
ImidazoleSigma56749
n-Octyl β-D-мальтозидAnatraceO310Anagrade
ThrombinHaematologic TechnologiesHCT-0020
EndoHNew England BiolabsP0702
Trizma-HClSigmaT5941Tris используется для приготовления кристаллизационных резервуаров
PEG 400Sigma91893
6-аминогексановая кислотаSigma7260
Trypsin-EDTAFisherMT25052CV
Isoplate-96 TCPerkinElmer6005070
PolyJetSignaGenSL100688Полимерный реагент для трансфекции мамалийских клеток
Медь HIS-Tag YSI SPA БусиныPerkinElmerRPNQ0096His-tag affinity SPA бусины
Циталопрам, [N-Methyl-3H]PerkinElmerNET1039250UC
ThermoMixer CEppendorf5382000023нагревательный блок для анализа термостабильности
ThermoTopEppendorf5308000003
SmartBlock PCR 96, термоблок для ПЦР-планшетовEppendorf5306000006
0.2 &; m шприцевой фильтрOlympus Plastics25-243
1 лфильтрующая система Corning430517
2 л плоскодонный колба для культуры тканейGenemateF-5909-2000
л колба для культуры тканей с перегородкойGenemateF-5909-2000B
CO2 инкубаторThermo Scientific3950
Forma Orbital ШейкерThermo Scientific416
Strep-Tactin смолаIba Life Sciences2-1208-025Strep affinity смола
ЭкструдерСеверные липиды
Li-Cor система визуализацииOdysseyвестерн-блоттинг система визуализации
XK16 колонкаGE Healthcare28-9889-37колонка используется для очистки стрептококтатина и талона
Концентратор белка MWCO 100 кДаMilliporeUFC910096
концентратор белка MWCO 30 кДа Концентратор белка MWCOMilliporeUFC903024
Ä kta FPLCGE HealthcareUPC-900
HPLCShimadzu51476
Superose 6 (10/300) колонкаGE Healthcare17-5172-01Используется для FSEC
Тангенциальный проточный аппаратPall Filtron
0.2 &микро; m фильтр тангенциальный проточный ячеекPall FiltronPSM20C11
30 кДа концентратор тангенциального потока MWCO концентратор тангенциального потокаPall FiltronOS030T12
смола TalonClonetech635504смола аффинности His-tag используется для очистки Fab
1 мл колонка HiTrap SP GEHealthcare17115101катионный теплообменник используется для очистки Fab колонка
Superdex 200 10/300 GLGE Healthcare17-5175-01Используется для разделения SEC SERT-8B6
24-луночная пластина VDXmHampton ResearchHR3-306
18 мм покровные стеклаHamptonResearch HR3-239
Virocyt счетчик вирусовVirocyt2100
MicroBeta TriluxPerkinElmer145096-луночный счетчик сцинтилляции
HiTrap SP колонкаGE Healthcare17115101
SertralineSigmaS6319
2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).">Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).
  2. The solute carrier 6 family of transporters. Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).">Broer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters. Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).
  3. Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters. Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).">Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters. Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).
  4. The functional impact of SLC6 transporter genetic variation. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).">Hahn, M. K., Blakely, R. D. The functional impact of SLC6 transporter genetic variation. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).
  5. Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation. J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).">Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation. J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).
  6. Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation. Plos One. 10 (12), e0145688(2015).">Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation. Plos One. 10 (12), e0145688(2015).
  7. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).">Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  8. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).">Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  9. The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells. Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).">De Becker, G., et al. The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells. Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).
  10. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. , (2016).">Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. , (2016).
  11. The progress of membrane protein structure determination. Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).">White, S. H. The progress of membrane protein structure determination. Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).
  12. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).">Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).
  13. Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines. Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).">Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines. Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).
  14. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).">Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).
  15. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).">Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  16. Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter. Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).">Tate, C. G., et al. Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter. Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).
  17. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).">Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  18. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).">Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
  19. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).">Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Serotonin TransporterS citalopram BindingThermostabilizationBaculovirus ExpressionHEK293S CellsProteoliposome ReconstitutionAntibody Fragment ExpressionSize Exclusion ChromatographyX ray CrystallographyMembrane Protein Stabilization

Related Articles