Оптические зонды на основе наночастиц были разработаны как средство для обнаружения антигенов с помощью рамановской и УФ-ВИД спектроскопии. В данной статье мы описываем протокол подготовки таких зондов для иммуноферментного анализа методом УФ-Видим/комбинационного рассеяния света таким образом, чтобы в нем были задействованы будущие возможности мультиплексирования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Фабрикации UV-VIS и спектроскопии комбинационного рассеяния света иммуноанализа платформы
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Иммунологические используются для обнаружения белков, основанные на присутствии ассоциированных антител. Из-за их широкого использования в исследованиях и клинических условиях, большая инфраструктура иммунологического инструментов и материалов можно найти. Например, 96- и 384-луночные полистироловые планшеты имеются в продаже и имеют стандартную конструкцию для размещения видимой области ультрафиолетового (УФ-Вид) спектроскопии машины от различных производителей. Кроме того, большое разнообразие иммуноглобулины, меток обнаружения и блокирующих агентов для индивидуальных конструкций иммунологического анализа, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) доступны.
Несмотря на существующую инфраструктуру, стандартные наборы ELISA не удовлетворяют все потребности исследований, требующих индивидуального развития иммунологического анализа, который может быть дорогостоящим и отнимает много времени. Например, ELISA наборы имеют низкую мультиплексирование (обнаружение более чем одного анализируемого вещества в то время) возможности, поскольку они, как правило, зависят от флуоресценции или Colкалориметрические методы обнаружения. Колориметрический и флуоресцентные на основе анализа имеют ограниченные возможности мультиплексирования из-за широких спектральных пиков. В противоположность этому, спектроскопии комбинационного рассеяния света на основе метода имеют гораздо больше возможностей для мультиплексирования из-за узких пиков выбросов. Еще одним преимуществом спектроскопии комбинационного рассеяния света является то , что комбинационные журналисты испытывают значительно меньше , чем фотообесцвечивания флуоресцентных меток 1. Несмотря на преимущества, которые комбинационные репортеры над флуоресцентных и колориметрических тегов, протоколы для изготовления комбинационного рассеяния на основе иммунологические ограничены. Целью данной работы является создание протокола для подготовки функционализированных зондов для использования в сочетании с пенополистирольных плит для непосредственного обнаружения аналитов с помощью УФ-Vis анализа и спектроскопии комбинационного рассеяния света. Этот протокол позволит исследователям принять сделай сам подход для будущего обнаружения мульти-аналита в то время как спекулируя на заранее установленной инфраструктуры.
Введение
Типичные иммунологические сэндвич косвенно обнаружить присутствие антигена с использованием двух антител. Антитело захвата связан с твердой поверхностью и образует комплекс антитело-антиген, когда в непосредственной близости к соответствующему антигену. Антитело обнаружения затем вводят и связывается с антигеном. После промывания антитело / антиген / антитело остается и детектируют с помощью меченого антитела обнаружения , как показано на рисунке 1А. Типичное определение производится с помощью флуоресцентного или колориметрического детектора, ограничивая мультиплексирование до 10 аналитов из - за широких спектральных пиков 2,3. В отличие о....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Приготовление буферами
- Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) ,
- Развести 50 мл 10х PBS с 450 мл воды класса ВЭЖХ, чтобы сделать концентрацию 1x PBS. Стерильный фильтр, раствор с фильтром 0,22 мкм.
- Решение Хранить при комнатной температуре.
- Получение Трис - солевом буферном + Tween 20 (TBST)
- Развести 50 мл 10х Трис солевым буфером (TBS) с 450 мл воды класса ВЭЖХ, чтобы сделать концентрацию 1x. Добавьте 250 мкл Tween-20 в течение 0,05% (об / об) Tween-20. Стерильный фильтр, раствор с фильтром 0,22 мкм.
- Хранить при комнатной температуре....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом исследовании, 60 нм частицы золота были использованы для УФ-видимой спектроскопии. УФ-Vis спектров поглощения от 400 до 700 нм были собраны и площадей пиков для каждой концентрации AuNP определяли с помощью программного обеспечения 8 спектрального анализа с открытым исходным кодом. До пика интеграции, собранные спектры подверглись коррекции базовой линии с использованием трехточечного полиномом. Площади пиков были использованы для создания логарифмической кривой калибровки , как показано на рис.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В подробном протоколе, существует несколько критических точек обратиться. Одной из проблем является выбор репортера комбинационного и наночастиц золота. Хотя протокол был написан быть адаптирован для индивидуального использования, рамановские репортер DTTC был использован в качестве примера. DTTC представляет собой положительно заряженный репортер и связывается с отрицательно заряженными поверхностями, такие как цитрат ограничен AuNPs. Этот протокол может быть адаптирован для отрицательно заряженных репортеров с использ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана премией Research Catalyst Award от Университета штата Юта. Авторы хотели бы поблагодарить Аннелиз Дайкс, Кэмерон Забриски и Дональда Вули за их вклад.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Наночастицы золота 60 нм | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | Это наночастицы золота с цитратным покрытием. Пожалуйста, ознакомьтесь с обсуждением взаимосвязи между репортером комбинационного рассеяния света и надводным зарядом AuNP и ее влиянием на правильный выбор репортера AuNP и/или репортера комбинационного рассеяния. |
| Бикарбонат натрия | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Метанол | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Трис Буферизованный физиологический раствор (10x) pH 7,5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Установка для фильтрации в бутылке | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (полисорбат 20) | Scy Tek | TWN500 | Используется в качестве эмульгатора для этапов мойки. |
| Фосфатно-солевой буферный концентрат 10x, pH 7,4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2,0 ml | Пробирки Eppendorf 22431102 | пробирки LoBind предотвращают связывание белков и AuNP с поверхностью пробирок. | |
| Протеин LoBind Tube 0,5 ml | Пробирки Eppendorf 22431064 | пробирки LoBind предотвращают связывание белков и AuNP с поверхностью пробирок. | |
| Микропланшеты UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Используются для герметизации и хранения функционализированных пластин. |
| Пробирная пластина, с низкой испарительной крышкой, 96 лунок плоское дно | Costar | 3370 | |
| ВЭЖХ Вода | класса Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Диэтилтиатрикарбоцианина йодид (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Рамановский репортер |
| mPEG-Тиол, MW 5,000 - 1 грамм | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1G | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 грамм | Лайсан Био, Инк. | OPSS-PEG-SVA-5000-1G | OPSS-PEG-SVA имеет конец NHS. |
| Мышиный IgG, контроль целой молекулы | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Антиген |
| козья антимышиная IgG (H+L) Перекрестно адсорбированное вторичное антитело | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Антитело |
| Сыворотка крови человека Блокирующий раствор альбумина | Sigma Aldrich | A1887-1G | Бычий сывороточный альбумин может быть использован вместо этого. |
| Мини-центрифуга | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| УФ-ВИД спектрофотометр | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| УФ-вид спектрофотометр | BioTek | Synergy 2 | |
| Обессоливающие колонны | Thermor Scientific | 87766 | |
| Собственное производство 785 нм инвертированный рамановский микроскоп | н/д н | /д | Инвертированный рамановский микроскоп лучше всего подходит для правильной фокусировки на поверхности луночного планшета. В противном случае будет использоваться очень низкое увеличение из-за высоты 96-луночного планшета. Была использована система собственного производства, так как это было дешевле, чем покупка у поставщика. Тем не менее, можно использовать любую коммерчески доступную систему инвертированного рамановского микроскопа. |
Ссылки
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582(2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
