Методическая статья

SILAC основе Протеомный Характеристика экзосомы от ВИЧ-1-инфицированных клеток

10.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54799

⸱

3 марта 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Brown University, 2COBRE Center for Cancer Research, Lifespan Laboratories, Rhode Island and Miriam Hospitals, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Warren Alpert Medical School, Brown University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем количественный метод протеомики с помощью метода стабильных изотопов маркировки аминокислот в клеточной культуре (SILAC) для анализа последствий инфекции ВИЧ-1 на хосте exosomal протеомов. Этот протокол может быть легко адаптирован к клеткам при различных стрессовых условиях или инфекции.

Аннотация

Протеомика — это крупномасштабный анализ белков. Протеомные методы, такие как жидкостная хроматография и тандемная масс-спектроскопия (ЖХ-МС/МС), могут характеризовать тысячи белков одновременно. Эти мощные методы позволяют нам иметь системное представление о клеточных изменениях, особенно когда клетки подвергаются воздействию различных стимулов, таких как инфекции, стрессы и специфические условия тестирования. Даже с учетом последних разработок анализ экзосомального протеома занимает много времени и часто включает в себя сложные методологии. Кроме того, полученный в результате большой набор данных часто нуждается в надежном и оптимизированном анализе, чтобы исследователи могли проводить дальнейшие последующие исследования. В данной статье мы описываем основанный на SILAC протокол для характеристики экзосомального протеома при инфицировании клеток ВИЧ-1. Метод основан на простом мечении изотопов, выделении экзосом из дифференциально меченых клеток и масс-спектрометрическом анализе. Далее следует подробный интеллектуальный анализ данных и биоинформатический анализ протеомных попаданий. Полученные наборы данных и кандидаты просты для понимания и часто содержат большой объем информации, полезной для последующего анализа. Этот протокол применим к другим субклеточным компартментам и широкому спектру условий тестирования.

Введение

Многие заболевания человека, в том числе вирусных инфекций, часто связаны с характерными клеточными процессами, которые происходят внутри и вокруг пораженных клеток. Белки, часто выступая в качестве конечных клеточных эффекторов, опосредуют эти процессы. Анализ белков часто может дать ценную информацию относительно локального окружения пораженных клеток и помогают нам понять основной механизм патогенеза болезни. Среди различных методов анализа белков, протеомики имеет особенно большие перспективы. В качестве мощного, крупномасштабного инструмента, протеомики может обеспечить системное понимание клеточных процессов, в частности, в области функции и взаимодействия белков. Анализ специфических белков становится проще путем разработки методов маркировки, которые позволяют исследователям контролировать экспрессию клеточных компонентов, в частности белков, в месте расследования. Хотя многие протеомики анализы были выполнены на клеточномпротеом шкала, протеомические характеризации на субклеточных отсеков оказались особенно информативными 1. Примером этого может служить также в исследованиях ВИЧ-1-инфекции.

Экзосомы, 30-100 нм мембранные везикулы , секретируемые широким спектром типов клеток 2, 3, являются важнейшими компонентами межклеточной коммуникации и молекулярного транспорта. Они были ранее обнаружены, играют важную роль в процессе ВИЧ-1 многообещающий 4, 5. Объединив Протеомические анализ с функциональным рассечения, мы обнаружили , что экзосомы , освобожденные из инфицированных ВИЧ-1 клеток состоят из уникальных и количественно различных белков подписи и гавани регуляторных молекул , которые влияют на клеточные свойства на соседних восприимчивых клеток, в том числе клеточного апоптоза и пролиферации 6. Эти методы описаны в данном протоколе,а именно SILAC (стабильный изотоп маркировки аминокислотами в культуре клеток) 7 на основе протеомики характеристик экзосомы от инфицированных ВИЧ-1 клеток. Аналогичные подходы могут быть применены, чтобы лучше понять других субклеточных компартментах в процессе патогенеза, регулируя экспериментальную нагрузку на конкретном отделении или доли интереса и внесение необходимых изменений в описанных процедур.

Принимая во внимание недавнее развитие количественных методов протеомическим, есть много, чтобы выбрать из при выборе наиболее эффективного метода для конкретного эксперимента. Среди них на химической основе iTRAQ (изобарических метки для относительного и абсолютного квантификации) 8 и метка свободной МРМ (множественный мониторинг реакции) 9 методов. Оба метода являются мощными инструментами и являются хорошим выбором для конкретных установок. Для типичной лаборатории в основном работают с клеточными линиями, однако, эти два метода имеют relativelу более высокие затраты и более трудоемким по сравнению с методом, основанным SILAC. SILAC является метаболическим на основе технологии маркировки, которая включает в себя нерадиоактивных изотопные формы аминокислот из культуральной среды в клеточные белки. Как правило, SILAC эксперименты начинаются с двух клеточных популяций, например, для инфицированных и неинфицированных. Каждый из них по-разному маркированы в своей специфической среде изотопного до полной маркировки не будет достигнута. Меченые экзосомы этих клеток затем подвергают экстракции белка. После извлечения меченые exosomal белки анализировали с помощью жидкостной хроматографии тандемной масс - спектроскопии 10. Наконец, результаты масс-спектрометрии и значительно меченые белки подвергаются статистической и биоинформатика анализа, а также строгой биохимического контроля. Наши предыдущие следственные доклады свидетельствуют о том, что процедуры SILAC / экзосома являются более подходящими для клеточных линий, чем первичные клетки, так как клеточные линии, как правило, находятся вАктивное состояние пролиферирующих для эффективной маркировки изотопном,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура клеток и ВИЧ-1 инфекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом экспериментов, рекомендуется проверить жизнеспособность клеток через трипанового синего окрашивания 11 и их пролиферацию через МТТ 12. Также важно использовать недавно подготовленный SILAC среду. Различные клеточные линии могут быть использованы, пока они находятся в активно пролиферативной стадии, и восприимчивы к инфекции ВИЧ-1, либо испытуемое условием выбора. В этом протоколе, используют клеточную линию H9 в качестве примера.

  1. Семя 2 × 10 6 клеток H9 в каждую колбу для культивирования клеток. Grow одну группу в 10 мл среды RPMI 1640 , меченных среду , содержащую 10% диализированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 мг / л 13 C 6 L-лизин и 100 мг / л 13 C 6 15 N 4 L-аргинин. Grow другую группу в 10 мл среды RPMI непомеченная 1640 с добавлением 10% FBS, диализу, 100 мг / л L-лизина и 100 мг / л L-аргинина.
  2. Grow клетки в течение шести удвоений в какой момент белки клеток в меченой среды практически полностью размеченный (> 99%) с тяжелыми аминокислотами. Добавить свежую среду, или регулярно менять носители (каждые 1-3 дней в зависимости от типа клетки. Для H9 клетки, менять среду каждые 3 дня). В конце маркировки, увеличение объема культуры (например , ~ 30 мл) , чтобы учитывать рост более ячеек.
    Примечание: Для точного определения ячейки время удвоения в начале эксперимента через окрашивания трипановым синим и подсчета клеток.
  3. Инфицировать меченых клеток с ВИЧ-1 NL4-3 с использованием стандартного ВИЧ-1 инфекции протокол 13 в течение 48 часов. Инкубируйте клетки с соответствующими количествами вируса с множественностью инфекции (MOI) около 0,3. Проверка на ВИЧ-1-инфекции путем p24 квантификации супернатантов культуры с помощью ВИЧ-1-антигена р24 ELISA набор. Провести анализ 14 иммунофлюоресценции для подтверждения успешного инфицирования клеток. Keeр растет немеченых клеток в немаркированной среде без ВИЧ-1 инфекции.
  4. Урожай супернатантах обеих групп в конце инфекции (этап 2.1).

2. экзосома Изоляция

Примечание: Через ряд шагов ультрацентрифугирования, exosomal фракции из супернатантов культур обогащены 15. Выполните все следующие шаги при 4 ° С, с ультрацентрифуге ротора, который может достигать скорости по меньшей мере 100000 х г.

  1. Собирают супернатанты культур в 50 мл конические пробирки, избегая клеток. Центрифуга их в течение 10 мин при 300 мкг для удаления оставшихся клеток.
  2. Собирают супернатанты в новые 50 мл конические пробирки и центрифуге их в течение 10 мин при 2000 мкг для удаления мертвых клеток. Передача в результате супернатанты на коммерческих роторных-совместимых трубок, которые способны выдерживать ультрацентрифугирования.
  3. Обязательно, чтобы сбалансировать ультрацентрифуге трубки. Центрифуга пробирки в течение 30 мин при 10000 мкг, чтобы удалитьостатков клеток.
  4. Собирают супернатанты в ультрацентрифуге труб и центрифуги в течение 70 мин при 100000 х г. Откажитесь от супернатантов.
  5. Ресуспендируют экзосома богатых гранул в 5 мл свежего PBS. Перенесите решения свежих ультрацентрифуге труб и центрифуга снова в течение 70 мин при 100000 х г.
  6. Отбросить супернатанты. Для хранения экзосомы долгосрочных, ресуспендируют гранул в 50 мкл PBS и хранить при температуре -80 ° C. В качестве альтернативы, переходить непосредственно к экстракции белка, как показано ниже.

3. Белки Добыча и подготовка

  1. Растворите изолированные exosomal гранулы в 100-200 мкл RIPA лизиса и экстракции буфером с добавлением коктейлей ингибиторов протеазы. Буфер состоит из 25 мМ Трис-гидрохлорида, 150 мМ хлорида натрия, 1% NP-40, 1% дезоксихолата натри и 0,1% SDS (додецилсульфата натрия), при рН 7,6. Коктейли ингибитор протеазы должны содержать различные ингибиторы протеазы, такие как апротинин, бестатин, Leupeptin, пепстатин А и ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты), что может ингибировать полный спектр протеиназ.
  2. Центрифуга растворенные растворов в течение 10 мин при 13000 х г (4 ° C), и передавать очищенные супернатанты к новым 1,5 мл микропробирок.
  3. Количественно концентрации белка в каждом образце экзосомы с использованием бицинхониновой кислоты (BCA) или Бредфорда 16.
  4. Смешайте равное количество белков (2 мкг) из меченых и немеченых образцов и запустить равную смесь на 4-20% геле SDS-PAGE при 120 мА / 200 В в течение 30 мин.
  5. Пятно гель с Кумасси синим с последующим Обесцвечивание 17.
  6. С помощью лезвия бритвы, вырезать образец полосу из геля. Затем вырежьте полосу геля на 10-15 равных частей. Положите каждый кусок в свежую 1,5 мл микроцентрифужных трубки в общей сложности 10-15 трубок.
  7. Погрузитесь кубов в 25 мМ NH 4 HCO 3 в 50% ацетонитрила, вихря, и отбросить супернатанты. Повторите дважды. сухойкубов в вакуумном концентраторе 18, 19.
  8. Увлажняет кубов с 10 мМ дитиотреитола (DTT), вихревые и центрифуги кратко. Инкубируют при 56 ° С в течение 1 часа. Удалите супернатант.
  9. Погрузитесь гель кубов в 55 мМ иодацетамида, вихря, и спина. Инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 45 мин. Удалите супернатант.
  10. Погрузитесь кубов в 25 мМ NH 4 HCO 3, вихря, спина, и отбросить супернатант.
  11. Погрузитесь кубов в 25 мМ NH 4 HCO 3 в 50% ацетонитрила, вихря, и спина. Повторите 3.9 и 3.10.
  12. Сухие кубы в вакуумной концентратором. Добавьте 25 мкл секвенирование сорта модифицированного трипсина в 25 мМ NH 4 HCO 3, инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 мин, и отбрасывать избыток раствора. Погрузить кубики в 25 мМ NH 4 HCO 3 без трипсина и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.
  13. Кратко спина кубы вниз и передать полученный пептид дополнительныйкт в новую пробирку. Добавить 30 мкл 5% -ной муравьиной кислоты в 50% ацетонитрила в кубах, вортексе в течение 30 мин, и спина. Смешайте супернатант с экстрактом. Сухие пептидные экстракты с вакуумным концентраторе до менее чем 5 мкл.
  14. Представить образцы для масс-спектрометрического основного средства для анализа ЖХ-МС / МС. Анализ данных МС, которые могут быть сгенерированы из программного обеспечения с открытым исходным кодом, как правило, включает в себя инвентарный номер для каждого белка идентифицирована, маркированная / немаркированные соотношения и количество уникальных пептидов, идентифицированных.

4. Вестерн-блоттинг Проверка

Примечание: Вестерн-блоттинг рекомендуется проверить результаты масс-спектрометрии.

  1. Последующие стандартные протоколы Вестерн-блоттинга и обеспечить, чтобы равное количество белка из каждой группы загружены. Использование антител против белков , представляющих интерес (например , аннексина A5, лактатдегидрогеназы B - цепи) , выявленных с помощью МС. Вестерн-блоттинга обнаружения, наряду с денситометрии analysis, может подтвердить, что идентификация белков MS и количественное определение являются правильными.

5. Анализ данных Протеомный

Примечание: Оценка качества данных, предварительная обработка данных, расчет и определение значимых кандидатов белка сделаны отдельно для каждой MS репликации. После того, как вышеуказанные анализы будут завершены, анализируемые данные повторах сравниваются и комбинированные 6, 20, 21.

  1. Оценка качества данных MS.
    1. Во-первых, log2 преобразование SILAC-MS маркированная / немаркированные соотношения белков в количественной оценке программе электронных таблиц.
    2. В научных графиков и статистического программного обеспечения, групповые отношения в 40-100 отношение бункеров и построить число коэффициентов в бункере для создания гистограммы. Нормальное распределение гистограммы указывает на хорошее качество данных MS 6. Сделайте этот шаг для всех MS размножается.
  2. Для повышения уверенности и точности коэффициентов пептидных MS, рассмотреть возможность удаления белков, которые имеют менее двух количественных пептидов.
  3. Чтобы определить , значительно вверх и вниз регулируется кандидатов белка, используйте следующие шаги для расчета значения порогов 22.
    1. В научных графиков и статистического программного обеспечения, генерировать нелинейной регрессии или кривой подгонки к данным распределения частот. Этот шаг дает значения, которые могут быть использованы для расчета значений среза. Вычислить значения светотеневой границы, как медиана ± 1,96 а, для 95% предельных величин или 2,56 сг на 99% предельных величин.
      Примечание: Конкретные детали расчета отсечек можно найти на сайте Эммотт и др. 22.
    2. Выберите кандидатов белка, чьи отношения либо больше, чем 1,96 (или 2,56) стандартных отклонений выше средней (значительно сверхвыражен) или ниже, чем 1,96 (или 2,56) стандартных отклонений ниже медианы (значительно недостаточно выражены).
  4. Сравните повторов идентифицированного выше значимых кандидатов для достижения согласованности. Убедитесь в том, что они отвечают следующим критериям, чтобы пройти этот заключительный этап отбора: кандидаты должны быть последовательно определены во всех повторах; и повторностях кандидата должны быть последовательными в их направлении регулирования (предпочтительно, по меньшей мере, 2 из 3-х повторах кандидата должны быть либо вверх или вниз регулируется регулируемым).
  5. Доработка данные для кандидатов, которые отвечают вышеупомянутым критериям путем объединения данных своих повторах.

6. Биоинформатика Проверка и определение характеристик

Примечание: Существующий геномных и биоинформатики информация предлагает огромное количество информации практически для каждого белка. Интеллектуальный анализ данных и анализ биоинформатики на этой информации может помочь в получении большое понимание в собственность и функциях значимых кандидатов. Это процесс, как правило, необходимо разработать соответствующие эксперименты вниз по течению мокрой лаборатории.

  1. Используя их номера GenBank , или идентификаторы UniProt, поиск кандидатов против текущих баз данных экзосом (Exocarta 23, Evpedia 24) , чтобы убедиться , что кандидат белки были ранее найдены в экзосома. Этот шаг добавляет уровень уверенности, что кандидаты действительно в экзосомы.
    1. http://www.exocarta.org/ Access, нажмите на кнопку "Запрос" и введите либо ген или белок, имя / присоединение. Сводка появится страница и доказательства в экзосома будет показано ниже, при условии, если есть.
  2. Поиск кандидатов против ВИЧ-1 и базы данных Взаимодействие человеческого белка 25. В качестве альтернативы, поиск конкретных баз данных, которые могут предоставить информацию о взаимодействии кандидата белков и условия испытания.
    1. Доступ к базе данных на www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVВзаимодействий. На записи "доменного имени белка ', введите имена кандидатов или инвентарные номера, и нажмите кнопку поиска. Результаты поиска могут дать представление о взаимодействии между ВИЧ-1 и кандидатов белка, и предполагают, кто из кандидатов может быть действительно ВИЧ-1 связаны.
  3. Импорт GenBank числа присоединение или идентификаторы UniProt кандидатов в программное обеспечение анализа GO (например, FunRich, функциональный обогатительной инструмент 26 анализа) и запустить программное обеспечение.
    1. Скачать программное обеспечение на http://www.funrich.org/. После установки, откройте программное обеспечение, при обогащении анализа, нажмите кнопку "Добавить набор данных", и загрузить список белков / генов. Затем выберите тип диаграммы для визуализации анализа GO.
      Примечание: GO Результаты анализа будут визуализированы в виде круговых диаграмм. Этот шаг поможет нам получить представление о глобальной, связанной с кандидатами в области биологического процесса (BP), клеточный компонент (CС), и молекулярной функции (МФ).
  4. Доступ к DAVID на http://david.ncifcrf.gov/ 27, нажмите кнопку "функциональная аннотация Tool" на своем веб - сайте. Введите список кандидатов, выберите "Идентификатор" гена, таких как "UniProt ID", выберите "Список ген" и поиска. Обогащенный GO термины, р-значения, а также другие параметры можно найти, перейдя на страницу "Аннотация Краткое изложение результатов" в категории "Gene_Ontology".
  5. Для того, чтобы исследовать потенциальные взаимодействия кандидатов с другими белками, открыто использовать базу данных , доступную 28 STRING для выяснения потенциальных взаимодействий белок-белковых и возможных биохимических путей.
    Примечание: GO анализ и функциональная аннотация (раздел 6,3-6,4) также может быть выполнена с использованием последней версии программного обеспечения струна.
    1. Доступ к базе данных на http://string-db.org/. Введите ID белок или последовательность в обозначенных хкоробка и нить поиск выбрать правильные виды для анализа. Нажмите кнопку "Поиск". Результаты будут давать информацию о как прямых (физических) и косвенных (функциональных) ассоциаций. Первые десять известных матчей за кандидата exosomal будут отображаться и должны быть рассмотрены для значительного отбора кандидатов.
      Примечание: Большое количество информации, связанной с кандидатами могут быть проанализированы с использованием описанных выше действий. Наиболее значимые кандидаты могут быть выбраны для дальнейшего вниз по течению молекулярного и биохимического анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1А представлена блок - схема с изложением процедуры 21 маркировки SILAC. Для того, чтобы очистить экзосомы, образцы должны быть осаждали с помощью центрифуги. На фиг.1В показаны этапы очистки экзосома от последовательного ультрацентрифугирования 21. После очистки экзосомы подлежат экспериментальной протеомики анализа, как описано в процедуре.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В процедурах, описанных в этой статье, мы продемонстрировали применение методики SILAC, чтобы исследовать влияние ВИЧ-1-инфекции на хосте exosomal протеома. Первоначально неинфицированных и инфицированных ВИЧ-1 клетки дифференцированно меченого изотопом. Дифференциально меченые экзосомы затем очищают перед проведением экстракции белка. Затем жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии используют для анализа exosomal протеома. И, наконец, полученные данные масс-спектрометрии и потенциальные кандидаты белки подв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана ARRA дополнения к / Продолжительность жизни Тафтса / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 и K24HD080539 БР. Эта работа была также поддержана Фондом Продолжительность жизни пилотного исследования (# 701- 5857), Род-Айленд Фонда медицинских исследований Грант (# 20133969) и NIH Кобре URI / Роге пилотного исследования Grant (P20GM104317) ОД. Мы благодарим Джеймса Myall и Vy Dang за помощь в рукописи и фигурного подготовки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
H9 клеточная линияATCCHTB-176
Trypan BlueThermo Fisher15250061
MTT набор для анализаThermo FisherV13154
Диализированная фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo Fisher26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640Thermo Fisher89982DMEM версия (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 для SILACThermo Fisher88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 для SILACThermo Fisher88431
HIV-1 NL4-3NIH AIDS Reagent Program2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kitPerkinElmerNEK050001KT
Охлаждаемая сверхскоростная центрифугаEppendorf22628045
Охлаждаемая ультрацентрифугаBeckman Coulter363118Должна достигать 100 000 x
g 50 мл Конические центрифужные пробиркиThermo Fisher14-432-22
Ультрацентрифужные пробиркиBeckman Coulter326823
SW 32 TiRotor Beckman Coulter369694
RIPA буферThermo Fisher89900
Коктейли ингибиторов протеазыThermo Fisher  78430
Термомиксер Eppendorf5384000020
набор для анализа белка BCA Спектрофотометр Thermo Fisher23250
Biorad1702525
SDS PAGE Гелевый аппаратThermo FisherEI0001
Novex 4-20% Трис-глицин Мини ГелиNovexXV04200PK20
Гель окрашивающий реактивSigma AldrichG1041
Секвенирование класса модифицированный трипсинPromegaV5111
Концентратор SpeedVacThermo FisherSPD131DDA
Антитело к аннексину человека A5Abcamab14196
Антитело к человеческой лактатдегидрогеназе B-цепиAbcamab53292
Графическое и статистическое программное обеспечениеSystat СигмаПлот Или GraphPad Prism
Пакет программного обеспечения для количественной протеомикиИнститут биохимии им. Макса Планка Maxquant 
Программное обеспечение и базы данныхРазличные поставщикиОбратитесь к основному тексту для получения подробной информации

Ссылки

  1. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
  2. Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
  3. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
  5. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
  6. Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
  7. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  8. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  9. Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
  10. Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
  11. Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
  13. Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
  14. Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).
  16. Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  17. Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
  18. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  20. Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
  21. Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
  22. Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  24. Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
  25. Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
  26. Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
  27. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  28. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
  29. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  30. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
  31. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  32. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
  33. Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
  34. Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SILAC1LC MS MSSDS PAGEGOSTRING

Похожие статьи