Методическая статья

Mouse микрохирургии Настой Техника для Targeted вещества Доставка в ЦНС с помощью Артерию внутренней сонной

DOI:

10.3791/54804

⸱

31 января 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2The Jerzy Kukuczka Academy of Physical Education

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает технику микрохирургической инфузии мышей, которая эффективно доставляет вещества непосредственно в мозг через внутреннюю сонную артерию.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Животные модели заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) и, следовательно, болезней нарушения гематоэнцефалического барьера требуют доставки экзогенных веществ в мозг. Эти экзогенные вещества могут оказывать вредное воздействие или составлять терапевтическую стратегию. Наиболее распространенные методы доставки экзогенных веществ в мозг основаны на системных доставках, таких как подкожные или внутривенные пути. Несмотря на то, что эти подходы широко используются, они имеют ряд ограничений, в том числе низкую эффективность доставки в мозг. Напротив, хирургические методы, которые локально доставляют вещества в ЦНС, более специфичны и предотвращают поглощение экзогенных веществ другими органами. Существует несколько хирургических методов доставки ЦНС; Тем не менее, они, как правило, очень травматичны. Здесь мы описываем технику микрохирургии инфузии мышей, которая эффективно доставляет вещества в мозг через внутреннюю сонную артерию с минимальной травматизацией и без вмешательства в нормальную функциональность ЦНС.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В естественных условиях модели центральной нервной системы (ЦНС) , заболевания требуют эффективной доставки экзогенных веществ, таких как наркотики, патогенных микроорганизмов, или экзосомы, в мозг. Следовательно, идеальный способ доставки должен вызывать минимальную травму животному, сохранить целостность нейронной сети, и достигать высоких концентраций веществ в головном мозге 1.

Несколько хирургических методов локальной доставки действующего вещества были описаны, в том числе внутри-оболочки, внутрицеребральная, внутрижелудочкового инъекций или имплантатов 2, 3, 4, 5. Эти подходы, однако, считаются травматическое в ЦНС, и позволить введение только низких объемов вещества, представляющего интерес. Кроме того, было высказано предположение , что экзогенные вещества могут быть быстро удалены спинно - мозговой жидкости 6 , и низкий диапазон проникновения в паренхиме головного мозга наблюдалась 7 , когда вышеуказанные методы используются. Системные методы доставки, такие как пероральный, легочный, подкожного и внутривенного путей, чаще используются в моделях на животных, хотя они демонстрируют низкую эффективность в доставке веществ в ЦНС, благодаря поглощению другими органами 8, 9. Таким образом, эти маршруты поставки требуют повышенных доз на администрируемых веществ, увеличивая риск побочных эффектов и токсичности 10, 11.

Здесь мы опишем метод микрохирургии мыши настой, который эффективно доставляет вещества непосредственно в мозг через внутреннюю сонную артерию. В дополнение к ориентации на доставку в ЦНС, этот метод не обходит нормальные физиологические барьеры и поэтому весьма актуальным для Биологическийл процессы, участвующие в проходах терапевтических средств или патогенов в мозг.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедуры, участвующие в следующем протоколе были одобрены в Университете Майами Institutional уходу и использованию животных комитета (IACUC). Кроме того, все процедуры проводятся в учреждениях, утвержденных Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторных животных Care International (AAALAC).

1. Подготовка мышей для хирургии

  1. Обезболить мышь с изофлуран в смеси с кислородом, с использованием лабораторной системы анестезии. Используйте изофлуран при установке между 4-5% и расход кислорода при 2 л / мин на коммерческой машине (см Материалы таблицу). Передача животное на поверхность хирургии, под стереомикроскопа, и поддерживать анестезии с помощью носовой конус (используйте настройку 1,5 изофлуран - 2,5 и кислорода поток со скоростью 2 л / мин).
    1. Убедитесь в том, что частота дыхания мыши составляет около 1 - 2 дыхания / сек без задыхаться. Кроме того, убедитесь, что животное не проявляет усов реакции стимуляции и педали гeflex (носок щепотку). Монитор частоты дыхания и сил во время операции, по крайней мере , каждые 5 мин. Следуйте конкретным институциональным уходу и использованию животных комитета и ветеринарные руководящие принципы для мониторинга грызун анестезии.
  2. Нанесите каплю глазной смазки на каждый глаз, используя стерильный тампон, чтобы предотвратить сухость кожи. Администрация противовоспалительного и обезболивающего, чтобы облегчить дискомфорт рекомендуется.
  3. С животное, лежа на спине, поддержания анестезии с помощью носовой конус.
  4. Очистите область шеи животного, протерев площадь в три раза с этанолом 70% и хлоргексидин. Бритье область хирургии животного с помощью бритвы (подробно изложено ниже).

2. Рассечение общей сонной артерии (ССА)

  1. Выполните всю процедуру микрохирургии под стереомикроскопа. Используя хирургические ножницы и пинцет выполняют неглубокую срединный разрез в области шеи, сверху грудины до уровня ниже тон челюсти (примерно от 3 до 4 см).
  2. Использование щипцов тщательно отдельной жирной и соединительной ткани подвергать трахеи.
  3. Поместите подушку (круглый предмет, около 0,5 см в диаметре) на задней части шеи мыши, чтобы продлить шеи, далее подвергая область.
  4. Отделить ткани, используя либо механизм втягивания ткани или крючки.
  5. На левой стороне животного трахеи, тщательно выщипывать друг от друга соединительной ткани, чтобы выставить левую CCA.
  6. Использование щипцов тщательно удалить все соединительные ткани, чтобы разоблачить развилки CCA, и начало как внешних, так и внутренних сонных артерий.

3. Подготовка ОАС для вещества Infusion

  1. Вставьте два сегмента нейлоновой нити (около 1 см каждая) под наружной сонной артерии (ЭКА), с помощью пинцета.
  2. Поместите постоянный узел на самом высоком ЕКСХ точки.
  3. В самой нижней точке возможного ЕКСХ, непосредственно над бифуркацией ОСА, местосъемный узел. Этот узел должен быть свободным по сравнению с верхним узлом.
  4. Закройте CCA с помощью клипа судна, по самой низкой возможной точки.
  5. Закройте внутренней сонной артерии (ВСА), используя зажим судна.
  6. Использование микродиссекция пружинные ножницы выполняют небольшой разрез в ECA (около 2 мм), между этими двумя узлами.

4. Вещество Настой через ICA

  1. Собрать систему для инфузии. Приложить 6 дюймов капиллярной трубки (идеальные размеры: 2,5 мм х 1,2 мм) к туберкулину шприц, содержащий 250 мкл вещества, подлежащего инфузии (наркотики, патогены, внеклеточные везикулы, среди других) и вставьте кончик капилляра осторожно в разрез выполняется на шаге 3.6.
  2. Продолжайте скользить вниз капилляр, пока он не достигнет средней точки между бифуркацией и зажимом закрытия ОАС.
  3. Свяжите вниз нижний ECA узел. Убедитесь в том, что узел достаточно, чтобы позволить капиллярную текучестью свободно и достаточно плотно, чтобы предотвратить leakinг.
  4. Удалить клип из ВСА.
  5. Осторожно надавливайте на поршень шприца, позволяющего вещества инфузии приблизительно 10 мкл в секунду.

5. Процедуры после инфузии

  1. Поместите клип обратно на ВСА.
  2. Осторожно удалите капиллярной трубки.
  3. Свяжите вниз нижний ECA узел полностью.
  4. Удалить клипы из ВСА и ОСА.

6. Разрез Закрытие и послеоперационный уход

  1. Удалите втягивающего устройства или ткани крючки и подушку.
  2. Очистить поверхность шва с помощью стерильного физиологического раствора.
  3. Закрыть разрез с помощью нейлоновой шовный / иглы и пинцета.
  4. Администрирование противовоспалительное и обезболивающее, чтобы облегчить послеоперационный дискомфорт.
  5. Поместите животное в клетке, размещенной на грелку в течение по крайней мере 1 ч и восстановление монитора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Техника микрохирургии мышь вливание описанный здесь очень универсальна и используется для доставки различных веществ непосредственно в мозг, в том числе доставку опухолевых клеток в репрезентативной модели формирования метастаз головного мозга 1, 12.

Этот метод также подходит для оценки патологических аспектов различных патогенов в ЦНС. В мышиной модели ВИЧ-инфекции, в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь настой микрохирургии было доказано быть очень успешным в доставке экзогенных веществ различных биологических особенностей в ЦНС, предотвращая нежелательное распространение по всему телу 1, 12. Срыв гематоэнцефалического барьера является патологическим характеристика нескольких ЦНС-связанных заболеваний; Поэтому оценка взаимосвязи экзогенных веществ с гематоэнцефалического барьера имеет большое значение и интерес.

Эта ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить доктора Лей Чена (Медицинская школа Икана в Маунт-Синай, штат Нью-Йорк), который первым начал использовать эту модель в нашей лаборатории, и доктора Гретхен Вольф (Немецкий центр исследования рака, Гейдельберг, Германия) за распространение этой техники в нашей лаборатории. Частично поддерживается HL126559, DA039576, MH098891, MH63022, MH072567, DA027569 и NSC 2015/17/B/NZ7/02985.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Инструмент для анестезииVetequip901806
Хирургические ножницыFine Science Tool14558-09
Хирургические щипцы с прямым наконечникомFine Science Tool00108-11
Хирургические щипцы с угловым наконечникомFine Science Tool00109-11
Пружинные ножницыFine Science Tool15000-08
Нейлоновый шовный материалBraintree ScientificSUT-S 104
Капиллярная трубка (микроренатан 0,010" x 0,005" на фут) Braintree ScientificMRE01050
Закрывающий шовVWR95057-036
Изофлуранпирамал
2,3,5-трифенилтетразолия хлоридFisherScientific50-121-8005

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).
  2. Frisella, W. A., et al. Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII. Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).
  3. Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
  4. Wu, G., et al. Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates. Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).
  5. Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).
  6. Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain. J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).
  7. Pardridge, W. M. Drug and gene delivery to the brain: the vascular route. Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).
  8. Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells. Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).
  9. Huang, R. Q., et al. Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer. FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).
  10. Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain. Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).
  11. Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).
  12. Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels. Biol Trace Elem Res. , (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи