Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Масса гистологии к Количественно нейродегенерации

10.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54809

⸱

15 декабря 2016 г.

 , 
1Oregon Institute of Occupational Health Sciences, Oregon Health & Sciences University

В этой статье

Краткое содержание

Drosophila широко используется в качестве модельной системы для изучения нейродегенерации. Этот протокол описывает метод, с помощью которого вырождение, как определено образованием вакуолей в головном мозге, могут быть определены количественно. Это также сводит к минимуму эффекты, связанные с экспериментальной процедуры по обработке и секционирования контрольных и экспериментальных мух в качестве одного образца.

Аннотация

Прогрессивные нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (AD) или болезнь Паркинсона (БП) создает все большую угрозу для здоровья людей во всем мире. Хотя модели млекопитающих предоставили важную информацию о механизмах, лежащих в основе патогенности, сложность систем млекопитающих вместе с их высокой стоимости ограничивают их использование. Таким образом, простой , но хорошо создана модель Drosophila-система представляет собой альтернативу для исследования молекулярных путей, которые страдают при этих заболеваниях. Помимо нарушений поведения, нейродегенеративные заболевания характеризуются гистологические фенотипы, такие как гибель нейронов и аксонопатии. Для количественной оценки дегенерацию нейронов и определить, как он влияет на генетических и экологических факторов, мы используем гистологический подход, который основан на измерении вакуоли в мозге взрослых мух. Чтобы свести к минимуму влияние систематических ошибок и непосредственно сравнивать разделы из-под контроля и ехрerimental мух в одном препарате, мы используем метод «воротник» для парафиновых срезов. Нейродегенерации затем оценивали путем измерения размера и / или количества вакуолей, которые развились в летучей мозге. Это может быть сделано путем сосредоточения внимания на конкретной области, представляющей интерес, или анализируя весь мозг путем получения серийных срезов, которые охватывают полную голову. Таким образом, этот метод позволяет измерять не только тяжелой дегенерации, но и относительно умеренные фенотипы, которые могут быть обнаружены только в нескольких секциях, как это происходит во время нормального старения.

Введение

В связи с увеличением продолжительности жизни, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона стала растущая угрозу для здоровья населения в целом. По данным Национального института здравоохранения, 115 миллионов человек во всем мире, согласно прогнозам, будут затронуты слабоумия в 2050 году Несмотря на значительный прогресс был достигнут в идентификации генов и факторов риска, связанных с по крайней мере, некоторые из этих заболеваний, для многих из них, лежащие в основе молекулярные механизмы до сих пор неизвестны или не очень хорошо понял.

Простые беспозвоночные модельные организмы , как Caenorhabditis Элеганс и дрозофилы предлагают множество экспериментальных преимуществ для изучения механизмов нейродегенеративных заболеваний, в том числе за короткий жизненный цикл, большое количество потомства, а также наличие устоявшихся , а иногда и уникальных генетических и молекулярных методов 1 -12. Кроме того, эти организмы поддаются несмещеннойЭкраны взаимодействия, которые могут идентифицировать факторы, способствующие этим заболеваниям их отягчающих или улучшающее воздействие на нейродегенеративных фенотипов.

Анализ таких генетических взаимодействий и оценки эффектов старения требует количественных протоколов для обнаружения нейродегенера- и измерить его тяжесть. Эта оценка может быть сделано относительно легко при измерении поведенческих аспектов в дрозофилы, такие как обучение, обонятельной отрицательные geotaxis, или быстрой фототаксиса, которые обеспечивают числовое значение производительности 13-21. Кроме того, можно определить влияние на выживание нейронов путем подсчета нейронов. Тем не менее, это возможно только при фокусировке на конкретной группе населения, которая четко определить, как дофаминергические нейроны, которые затронуты в ПД, и даже тогда, результаты были противоречивыми 22-24.

Протокол, описанный здесь используется метод воротник для выполнения парафиновые серийных срезов, методкоторый был первоначально разработан Гейзенберга и Böhl, которые использовали его для выделения анатомическими мутантов мозга у дрозофилы 25. Использование метода воротниковой впоследствии был адаптирован, в том числе в криосрезах, vibratome секции и пластмассовых секций 26-28. Здесь этот метод используется для получения последовательных секций всей головы летучей, который затем может быть использован для измерения вакуоли , которые развиваются у мух с нейродегенеративными фенотипов 16,21,29-32. Эти измерения можно сделать в определенных областях мозга, или может покрывать весь мозг; последний подход позволяет выявить даже слабые дегенеративные фенотип, как это наблюдалось во время старения. И, наконец, при использовании воротники, до 20 мух могут быть обработаны, как один препарат, который не только занимает меньше времени, но также позволяет проводить анализ контрольных и экспериментальных мух в том же препарате, сводя к минимуму артефактов из-за небольших изменений подготовка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Фиксация головы на воротники и вложении в парафиновые

Примечание: Все шаги в процессе фиксации должно быть сделано в вытяжном шкафу. Метилбензойной, а не создает опасности для здоровья, имеет весьма отчетливый запах, который может быть подавляющим, если не обрабатывается в вытяжном шкафу.

  1. Перед тем как обезболивающее мух, составляют 50 мл раствора Карнуа добавлением 15 мл хлороформа и 5 мл ледяной уксусной кислоты к 30 мл 99% этанола (не смешивают хлороформ и уксусную кислоту). Налейте его в стеклянную емкость с плоским дном, такой как crystalizing блюдо, чтобы гарантировать, что воротники могут лежать и полностью покрыты раствором.
  2. Обезболить мух CO 2 или эфиром.
  3. мухи темы (до 20 с большинством воротников) их шеи в воротники с помощью щипцов. Не забудьте выровнять все главы в той же ориентации, как показано на рисунке 1А, и быть нежным , чтобы гарантировать , что никаких повреждений не происходит в голове или в глаза.
  4. Включите синусоидальные oculis мух (стрелки, рис 1А) в случайных позициях , так что порядок мух могут быть легко определены в секциях. Кроме того, если экспериментальные мухи имеют легкий или белый цвет глаз, нить некоторые красные глаза мух, таких, как дикого типа, между ними, чтобы гарантировать, что достаточное количество пигмента присутствует для окрашивания слайд. Запишите порядок мух на листе протокола вместе с номером воротниковой при использовании более одного воротник.
  5. После того, как воротник был закончен, поместите его в приготовленный раствор Карнуа в течение 3,5 - 4 ч.
  6. Дамп решение Carnoy в соответствующий канистры утилизации и начать промывок этанол. Убедитесь в том, чтобы вылить медленно, чтобы не мешать размещение воротников в контейнере.
  7. Вымойте воротники в течение 30 мин в 99% этанола в два раза.
  8. Промыть воротники в 100% этаноле в течение 1 ч. Обязательно изменить промывок вовремя, чтобы предотвратить overdehydration.
  9. Поместите борты в метилбензоатаO / N при комнатной температуре. Уплотнение контейнера с парафином, чтобы предотвратить испарение метилбензойной кислоты.
  10. Налейте methylbenozate в соответствующую одноразовой емкости в вытяжном шкафу. Добавление предварительно приготовленной смеси 1: 1 с низкой температурой плавления (56 - 57 ° C), парафин и метилбензойной кислоты. С этого момента, воротники должны храниться в термостате при 65 ° С, чтобы убедиться, что парафин не затвердеет.
  11. Слить methylbenozate и парафиновой смеси в надлежащей одноразовой емкости, и заливают расплавленный чистый парафин, выдерживают при температуре 65 ° С, на ободков.
  12. Изменение парафина через 30 мин и повторить это по крайней мере в 5 раз. По крайней мере, на 6 - 8 промывок должны быть выполнены.
  13. После завершения промывки, поместите воротники в резиновый лоток для льда с прорезями примерно размером воротников. Залить расплавленным парафином над ними до тех пор, пока полностью покрыты и дайте ему затвердеть O / N (старайтесь избегать пузырьков воздуха).
  14. Удалите парафиновые блоки содернин воротники из лотка для кубиков льда. Отделить блок парафина от воротника, используя лезвие бритвы, аккуратно разрывая воротник. Главы будут находиться в блоке парафина в то время как тела будут оставаться в воротнике. Блоки могут храниться при комнатной температуре.
  15. Для очистки воротники, замочить их в deparafinization агента при 65 ° С для удаления парафина, чистая с легким промывке, и промойте в этаноле перед повторным использованием.

2. Секционирование и монтаж

  1. Теплый нагревательную плиту до 50 ° C. Поместите держатели объекта (или монтажа металлических блоков) и бритвенных лезвий на тарелку и дайте им прогреться.
  2. В зависимости от желаемой ориентации для секционирования, прикрепить парафиновый блок либо с головками в направлении стороны (для горизонтальных участков) или вверх (для фронтальных срезах) к монтажному блоку нагретую (кратко расплавления блок на стороне контакта). Удалить блок из нагревательной плиты и дайте ему остыть в течение по крайней мере 10 мильN, чтобы гарантировать, что парафин затвердевает достаточно для надлежащего уплотнения на монтажный блок. Хранить ряд головок выровненными параллельно с поверхностью блока в максимально возможной степени, чтобы предотвратить неравномерное секций.
  3. Возьмите лезвие бритвы и обрежьте излишки парафина подальше от мух головок так, что лишь небольшая строка с вложенными головок остается (лезвие бритвы может быть разогрет для облегчения обрезки кромок). Убедитесь в том, чтобы не обрезать слишком много, чтобы парафин не ломается во время секционирования (больше зачистка может быть сделано во время секционирования).
  4. Поместите монтажный блок в держатель объекта микротома и гарантировать, что выравнивание ряда головок в параллель, как можно ближе к кромке лопасти.
  5. Подготовьте предметные стекла микроскопа, покрывая их тонким слоем (PLL) раствор L-лизин-поли и дайте им высохнуть в течение 5 мин. Покройте их с водой непосредственно перед применением.
  6. Вырезать 7 мкм секций и перенесите ленту секций к каретке, плавающего на воде. <бр /> Примечание: Чтобы получить весь мозг для горизонтальных сечений, мы собираем ленту с момента, когда начинают врезаться в глаза, пока головка не была полностью разорвана (вырезка из хоботка в мозг). Более чем один слайд может понадобиться для всей головы.
  7. Поместите предметное стекло на нагревательной пластине при 37 ° С и позволяют ленты расширяться в течение примерно 1 мин.
  8. Удалите излишки воды (путем заливки его или используя ткань) и высушить слайды O / N.
  9. Удалите парафин из слайда путем размещения слайдов в высоком вертикальном слайд-окрашивания банку, заполненную deparafinization агентом (полностью покрывающей секции). Выполните 3 стирок 30 мин - 60 мин каждый.
  10. Удалить слайд из окончательной промывки. Поместите 2 капли вложения средств массовой информации на слайде и покрыть ее с большим покровным.

3. Фотографирование и анализируя разделы

  1. Разрешить подготовленные слайды высохнуть в течение 1 - 2 дней. Затем, осмотрите их на флуоресцентном microscОПЕ под голубым светом.
  2. Используйте меньшее увеличение, чтобы определить ориентацию мух и найти интересующую область, если сосредоточив внимание на конкретном регионе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для SWS мух (рисунок 2), находим раздел , который содержит большой спайки и сделайте снимок (обычно при 40 - кратном увеличении). При анализе весь мозг (как показано на рисунке 3), мы пролистать все разделы из головы и либо сфотографировать участок с наиболее тяжелой фенотип или всех секций , которые показывают вакуоли.
  3. Для двойного слепого анализа, взять и номер изображения, не зная генотип и записать номер воротник и положение головы в строке, чтобы идентифицировать их позже.
  4. После того, как изображения были взяты, анализировать их с помощью программного обеспечения визуализации.
  5. Подсчитайте количество вакуолей в секции или на голове. Для измерения размера вакуоли, открыть изображения в программе и выбрать вакуоли с выбором слишкомл. Определить количество пикселей в выбранных вакуолей.
  6. Для преобразования в 2 мкм, сфотографируйте стадии калибровки микрометра слайда при увеличении используемого для получения фотографий. Определить количество пикселей в 100 мкм 2 , чтобы вычислить коэффициент пересчета.
  7. Преобразование общее количество пикселов в мкм 2 путем деления числа пикселей на коэффициент пересчета , рассчитанного на предыдущей стадии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С помощью описанных результатов методов в серийных срезов , окрашенных пигментом глаз 33 , которая охватывала всю голову мухи. Часть этого показан на рисунке 1В, где участки от индивидуальной головки показаны сверху вниз. Секции из разных мух рассматриваются слева направо в этом примере. Для облегчения ориентации и идентификации мух, безглазым муха (синусоидальный oculis) вставляется в качестве маркера в положении 3 (стрелка, рис 1B)....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный способ обеспечивает средство для количественной оценки нейродегенерации в мозге дрозофилы. В то время как другие методы, такие как подсчет определенного типа клеток, может быть использован для идентификации нейродегенерации, преимущество этого способа состоит в том, что он может быть применен в более общем смысле. Подсчет клеток требует, чтобы эти клетки могут быть надежно идентифицированы с использованием либо специфических антител или экспрессию клеточного специфического маркера, который не всегда д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами D.K. от Фонда медицинских исследований штата Орегон и от NIH/NINDS (NS047663). E.S. была поддержана грантом на обучение от NIH (T32AG023477).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента/оборудованияНомер вкаталоге компании Ошейник
Genesee ScientificTS 48-100Мы используем изготовленные на заказ ошейники, изготовленные из цельного куска металла, а не из слоев, как у Genesee. Описание о том, как сделать ошейники, можно найти на http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html 
Резиновый лоток для кубиков льда для встраиванияБытовой магазинРазмер может быть изготовлен по размеру путем вклеивания дополнительных стенок;
Кристаллизационная чашкаFisher Scientific company08-762-3
EtherFisher Scientific CompanyE138-1
EthanolDecon Laboratories Inc.2701
CholoroformFisher Scientific CompanyC298-500
Ледяная уксусная кислотаFisher Scientific CompanyA38-212
МетилбензоатFisher Scientific CompanyM205-500Отчетливый запах - Использование в вытяжном шкафу!
Парафин с низкой температурой плавленияFisher Scientific CompanyT565Обязательно сохраняйте экстра расплавленный при температуре 65 градусов; C водяная баня
МикротомLeicaBiosystems Reichert Jung 2040 Микроскоп Autocut
Предметное стеклоFisher Scientific Company12-550D
Крышка микроскопа СтеклоFisher Scientific Company12-545-M
SafeClearFisher Scientific Company314-629Три разных контейнера для стирки
Вертикальная банка для окрашивания с ОбложкаTed Pella Inc. 432-1
Permount Fisher ScientificCompany SP15-500
Раствор поли-L-лизина (PLL)Sigma Life ScienceP8290-500

Ссылки

  1. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279(2014).
  2. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
  3. Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
  4. Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65(2015).
  5. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
  6. Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
  7. Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
  8. Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
  9. Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
  10. Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
  11. Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
  12. Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
  13. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. , (2011).
  14. Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. , e50339(2013).
  15. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. , (2015).
  16. Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703(2008).
  17. Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
  18. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
  19. Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
  20. Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model. PLoS Genet. 11, e1005025(2015).
  21. Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356(2015).
  22. Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
  23. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
  24. Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
  25. Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143(1979).
  26. Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
  27. Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
  28. Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
  29. Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
  30. Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
  31. Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440(2012).
  32. Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
  33. Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
  34. Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
  35. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
  36. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
  37. Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944(2016).
  38. Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
  39. Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
  40. Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Мозг Drosophilaколичественная оценка нейродегенерацииизмерение вакуолейметод с использованием кольцапарафиновое секционированиегистологический анализфлуоресцентная микроскопиясерийные срезывозрастная дегенерациягенетические факторы
Масса гистологии к Количественно нейродегенерации
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.