Масса гистологии к Количественно нейродегенерации Drosophila

В связи с увеличением продолжительности жизни, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона стала растущая угрозу для здоровья населения в целом. По данным Национального института здравоохранения, 115 миллионов человек во всем мире, согласно прогнозам, будут затронуты слабоумия в 2050 году Несмотря на значительный прогресс был достигнут в идентификации генов и факторов риска, связанных с по крайней мере, некоторые из этих заболеваний, для многих из них, лежащие в основе молекулярные механизмы до сих пор неизвестны или не очень хорошо понял.

Простые беспозвоночные модельные организмы , как Caenorhabditis Элеганс и дрозофилы предлагают множество экспериментальных преимуществ для изучения механизмов нейродегенеративных заболеваний, в том числе за короткий жизненный цикл, большое количество потомства, а также наличие устоявшихся , а иногда и уникальных генетических и молекулярных методов ^{1 -12.} Кроме того, эти организмы поддаются несмещеннойЭкраны взаимодействия, которые могут идентифицировать факторы, способствующие этим заболеваниям их отягчающих или улучшающее воздействие на нейродегенеративных фенотипов.

Анализ таких генетических взаимодействий и оценки эффектов старения требует количественных протоколов для обнаружения нейродегенера- и измерить его тяжесть. Эта оценка может быть сделано относительно легко при измерении поведенческих аспектов в дрозофилы, такие как обучение, обонятельной отрицательные geotaxis, или быстрой фототаксиса, которые обеспечивают числовое значение производительности ^13-21. Кроме того, можно определить влияние на выживание нейронов путем подсчета нейронов. Тем не менее, это возможно только при фокусировке на конкретной группе населения, которая четко определить, как дофаминергические нейроны, которые затронуты в ПД, и даже тогда, результаты были противоречивыми ^22-24.

Протокол, описанный здесь используется метод воротник для выполнения парафиновые серийных срезов, методкоторый был первоначально разработан Гейзенберга и Böhl, которые использовали его для выделения анатомическими мутантов мозга у дрозофилы ^25. Использование метода воротниковой впоследствии был адаптирован, в том числе в криосрезах, vibratome секции и пластмассовых секций ^26-28. Здесь этот метод используется для получения последовательных секций всей головы летучей, который затем может быть использован для измерения вакуоли , которые развиваются у мух с нейродегенеративными фенотипов ^16,21,29-32. Эти измерения можно сделать в определенных областях мозга, или может покрывать весь мозг; последний подход позволяет выявить даже слабые дегенеративные фенотип, как это наблюдалось во время старения. И, наконец, при использовании воротники, до 20 мух могут быть обработаны, как один препарат, который не только занимает меньше времени, но также позволяет проводить анализ контрольных и экспериментальных мух в том же препарате, сводя к минимуму артефактов из-за небольших изменений подготовка.

1. Фиксация головы на воротники и вложении в парафиновые

Примечание: Все шаги в процессе фиксации должно быть сделано в вытяжном шкафу. Метилбензойной, а не создает опасности для здоровья, имеет весьма отчетливый запах, который может быть подавляющим, если не обрабатывается в вытяжном шкафу.

1. Перед тем как обезболивающее мух, составляют 50 мл раствора Карнуа добавлением 15 мл хлороформа и 5 мл ледяной уксусной кислоты к 30 мл 99% этанола (не смешивают хлороформ и уксусную кислоту). Налейте его в стеклянную емкость с плоским дном, такой как crystalizing блюдо, чтобы гарантировать, что воротники могут лежать и полностью покрыты раствором.
2. Обезболить мух CO ₂ или эфиром.
3. мухи темы (до 20 с большинством воротников) их шеи в воротники с помощью щипцов. Не забудьте выровнять все главы в той же ориентации, как показано на рисунке 1А, и быть нежным , чтобы гарантировать , что никаких повреждений не происходит в голове или в глаза.
4. Включите синусоидальные oculis мух (стрелки, рис 1А) в случайных позициях , так что порядок мух могут быть легко определены в секциях. Кроме того, если экспериментальные мухи имеют легкий или белый цвет глаз, нить некоторые красные глаза мух, таких, как дикого типа, между ними, чтобы гарантировать, что достаточное количество пигмента присутствует для окрашивания слайд. Запишите порядок мух на листе протокола вместе с номером воротниковой при использовании более одного воротник.
5. После того, как воротник был закончен, поместите его в приготовленный раствор Карнуа в течение 3,5 - 4 ч.
6. Дамп решение Carnoy в соответствующий канистры утилизации и начать промывок этанол. Убедитесь в том, чтобы вылить медленно, чтобы не мешать размещение воротников в контейнере.
7. Вымойте воротники в течение 30 мин в 99% этанола в два раза.
8. Промыть воротники в 100% этаноле в течение 1 ч. Обязательно изменить промывок вовремя, чтобы предотвратить overdehydration.
9. Поместите борты в метилбензоатаO / N при комнатной температуре. Уплотнение контейнера с парафином, чтобы предотвратить испарение метилбензойной кислоты.
10. Налейте methylbenozate в соответствующую одноразовой емкости в вытяжном шкафу. Добавление предварительно приготовленной смеси 1: 1 с низкой температурой плавления (56 - 57 ° C), парафин и метилбензойной кислоты. С этого момента, воротники должны храниться в термостате при 65 ° С, чтобы убедиться, что парафин не затвердеет.
11. Слить methylbenozate и парафиновой смеси в надлежащей одноразовой емкости, и заливают расплавленный чистый парафин, выдерживают при температуре 65 ° С, на ободков.
12. Изменение парафина через 30 мин и повторить это по крайней мере в 5 раз. По крайней мере, на 6 - 8 промывок должны быть выполнены.
13. После завершения промывки, поместите воротники в резиновый лоток для льда с прорезями примерно размером воротников. Залить расплавленным парафином над ними до тех пор, пока полностью покрыты и дайте ему затвердеть O / N (старайтесь избегать пузырьков воздуха).
14. Удалите парафиновые блоки содернин воротники из лотка для кубиков льда. Отделить блок парафина от воротника, используя лезвие бритвы, аккуратно разрывая воротник. Главы будут находиться в блоке парафина в то время как тела будут оставаться в воротнике. Блоки могут храниться при комнатной температуре.
15. Для очистки воротники, замочить их в deparafinization агента при 65 ° С для удаления парафина, чистая с легким промывке, и промойте в этаноле перед повторным использованием.

2. Секционирование и монтаж

1. Теплый нагревательную плиту до 50 ° C. Поместите держатели объекта (или монтажа металлических блоков) и бритвенных лезвий на тарелку и дайте им прогреться.
2. В зависимости от желаемой ориентации для секционирования, прикрепить парафиновый блок либо с головками в направлении стороны (для горизонтальных участков) или вверх (для фронтальных срезах) к монтажному блоку нагретую (кратко расплавления блок на стороне контакта). Удалить блок из нагревательной плиты и дайте ему остыть в течение по крайней мере 10 мильN, чтобы гарантировать, что парафин затвердевает достаточно для надлежащего уплотнения на монтажный блок. Хранить ряд головок выровненными параллельно с поверхностью блока в максимально возможной степени, чтобы предотвратить неравномерное секций.
3. Возьмите лезвие бритвы и обрежьте излишки парафина подальше от мух головок так, что лишь небольшая строка с вложенными головок остается (лезвие бритвы может быть разогрет для облегчения обрезки кромок). Убедитесь в том, чтобы не обрезать слишком много, чтобы парафин не ломается во время секционирования (больше зачистка может быть сделано во время секционирования).
4. Поместите монтажный блок в держатель объекта микротома и гарантировать, что выравнивание ряда головок в параллель, как можно ближе к кромке лопасти.
5. Подготовьте предметные стекла микроскопа, покрывая их тонким слоем (PLL) раствор L-лизин-поли и дайте им высохнуть в течение 5 мин. Покройте их с водой непосредственно перед применением.
6. Вырезать 7 мкм секций и перенесите ленту секций к каретке, плавающего на воде. <бр /> Примечание: Чтобы получить весь мозг для горизонтальных сечений, мы собираем ленту с момента, когда начинают врезаться в глаза, пока головка не была полностью разорвана (вырезка из хоботка в мозг). Более чем один слайд может понадобиться для всей головы.
7. Поместите предметное стекло на нагревательной пластине при 37 ° С и позволяют ленты расширяться в течение примерно 1 мин.
8. Удалите излишки воды (путем заливки его или используя ткань) и высушить слайды O / N.
9. Удалите парафин из слайда путем размещения слайдов в высоком вертикальном слайд-окрашивания банку, заполненную deparafinization агентом (полностью покрывающей секции). Выполните 3 стирок 30 мин - 60 мин каждый.
10. Удалить слайд из окончательной промывки. Поместите 2 капли вложения средств массовой информации на слайде и покрыть ее с большим покровным.

3. Фотографирование и анализируя разделы

1. Разрешить подготовленные слайды высохнуть в течение 1 - 2 дней. Затем, осмотрите их на флуоресцентном microscОПЕ под голубым светом.
2. Используйте меньшее увеличение, чтобы определить ориентацию мух и найти интересующую область, если сосредоточив внимание на конкретном регионе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для SWS мух (рисунок 2), находим раздел , который содержит большой спайки и сделайте снимок (обычно при 40 - кратном увеличении). При анализе весь мозг (как показано на рисунке 3), мы пролистать все разделы из головы и либо сфотографировать участок с наиболее тяжелой фенотип или всех секций , которые показывают вакуоли.
3. Для двойного слепого анализа, взять и номер изображения, не зная генотип и записать номер воротник и положение головы в строке, чтобы идентифицировать их позже.
4. После того, как изображения были взяты, анализировать их с помощью программного обеспечения визуализации.
5. Подсчитайте количество вакуолей в секции или на голове. Для измерения размера вакуоли, открыть изображения в программе и выбрать вакуоли с выбором слишкомл. Определить количество пикселей в выбранных вакуолей.
6. Для преобразования в ² мкм, сфотографируйте стадии калибровки микрометра слайда при увеличении используемого для получения фотографий. Определить количество пикселей в 100 мкм ² , чтобы вычислить коэффициент пересчета.
7. Преобразование общее количество пикселов в мкм ² путем деления числа пикселей на коэффициент пересчета , рассчитанного на предыдущей стадии.

С помощью описанных результатов методов в серийных срезов , окрашенных пигментом глаз 33 , которая охватывала всю голову мухи. Часть этого показан на рисунке 1В, где участки от индивидуальной головки показаны сверху вниз. Секции из разных мух рассматриваются слева направо в этом примере. Для облегчения ориентации и идентификации мух, безглазым муха (синусоидальный oculis) вставляется в качестве маркера в положении 3 (стрелка, рис 1B).

Для количественной оценки нейродегенерации, измерять образование вакуолей, которые могут быть обнаружены в этих секциях. Вакуоли определяются как круглые, темные пятна , которые находятся в пределах зеленого флуоресцентного нейропиля (размерные стрелки на рисунке 2 и 3) или кора головного мозга и которые видны по крайней мере 2 последовательных участков мозга мухи. Количественная нейродегенера- поизмерительные вакуоли могут быть либо сделано путем сосредоточения внимания на конкретном регионе мозга или анализируя весь мозг. Ограничение анализа к конкретной области мозга полезно в тех случаях , когда мутация влияет только на определенную область, как и обонятельных долей в futsch 'ОЛК мутанта 34, но он также может быть использован , когда есть тяжелая дегенерация во всех или многих области мозга. Примером последнего является швейцарский сыр (SWS) мутант (рисунок 2), где все измерения вакуоли было бы слишком много времени. Поэтому мы взяли только одно изображение и, чтобы гарантировать , что измерения всегда делается на том же уровне, мы взяли все изображения на уровне великого спайки (дс, рис 2А), которое содержится только в одном или двух секций. В то время как мы не обнаружили вакуоли образование в 1 мух 1-дневных SWS "(данные не показан), с потерей функции аллель 35, некоторые вакуоли были обнаружены я1 мух N 7-дневных SWS '(наконечники стрел, Рисунок 2А). Старение мух до 14 г (рис 2В) и 21 г (рис 2С) дополнительно увеличил этот фенотип, показывая его прогрессивный характер. Подсчет количества вакуолей в deutocerebral нейропиля (Dn) с использованием описанного способа подтвердили значительное увеличение числа вакуолей с возрастом. Кроме того , суммарная площадь охватывается вакуолей была значительно увеличена со старением (рис 2D).

Однако, не все мутанты обнаруживают такой тяжелый фенотип как РКС, а также в тех случаях, различия в перерождения трудно определить , когда фокусировка на небольшом участке. Точно так же, вырождение , которое происходит в процессе старения достаточно мягкая (рис 3A - C) и , следовательно, мы проанализировали весь мозг при количественной оценке этот фенотип. Определение суммы всех вакуолей в мозге выявленозначительное увеличение с возрастом, и это было также случай , когда измерения суммарная площадь этих вакуолей (рис 3D).

Рисунок 1. Парафин Серийные срезы. А) С помощью метода петелька, экспериментальных и контрольных мух могут быть обработаны в качестве одного образца путем закручиванием их на один воротник. Безглазое синус oculis мухи вставляются для ориентирования (стрелки). Б) Схематическое изображение ориентации Мухи головок в воротнике. C) На этом снимке, секции из разных головок муха ориентированы слева направо , на слайде. Сверху вниз на слайде, последовательные секции из той же головы мухи можно увидеть. В этом случае синусоидальной oculis Муха был вставлен в положении три (стрелка). Срезы окрашивали с помощью флуоресцентного пигмента глаз, который омывает над секции после резки. Шкала бар A = 5 мм и С = 0,5 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Прогрессивное нейродегенерации в швейцарском сырной мутанта. Парафин головной секции с 7-дня- (А), 14-день- (В) и 21-дня- (C) старый SWS '1 летает. Стрелки указывают на вакуолей, которые развились со старением. Дегенерация связанная с возрастом количественно путем подсчета количества вакуолей и измеряя их общую площадь (D). СЭМ и число анализируемых мух указывается. Шкала бар = 25 мкм. *** Р <0,001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. нейродегенерации происходит с возрастом. Парафин головной секции с 10-дня- (А), 30-день- (B) и 60-дня- (С) старых мух дикого типа. Стрелки указывают на вакуолей, которые развились в возрасте от мух. Дегенерация связанная с возрастом количественно путем подсчета количества вакуолей и измеряя их общую площадь (D). СЭМ и число анализируемых мух указывается. Шкала бар = 25 мкм. *** Р <0,001. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. </ А>

Авторы не имеют ничего раскрывать.