Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Удаление биопленки с использованием диоксида углерода Аэрозоли без продувки азотом

6.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54827

⸱

6 ноября 2016 г.

 , 
1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)

В этой статье

Краткое содержание

Биопленки на поверхностях могут быть эффективно и быстро удалены с помощью периодической струи аэрозолей углекислого газа без продувки азотом.

Аннотация

Биопленки могут вызывать серьезные проблемы во многих приложениях. Они могут не только привести к экономическим потерям, но и представлять опасность для здоровья населения. Поэтому крайне желательно удалять биопленки с поверхностей. Во многих исследованиях аэрозольной очистки отCO2 использовались азотные продувки для повышения эффективности удаления биопленки за счет уменьшения конденсации влаги, образующейся во время очистки. Тем не менее, в этом исследовании периодические струи аэрозолейCO2 без продувки азотом использовались для удаления биопленок Pseudomonas putida с полированных поверхностей из нержавеющей стали. Аэрозоли CO2 представляют собой смеси твердых и газообразныхCO2 и образуются при адиабатическом расширении газа CO2 под высоким давлением через сопло. Эти высокоскоростные аэрозоли наносились на биопленку, которая выращивалась в течение 24 часов. Эффективность удаления варьировала от 90,36% до 98,29% и оценивалась путем измерения интенсивности флуоресценции биопленки, поскольку время обработки варьировалось от 16 секунд до 88 секунд. Мы также провели эксперименты для сравнения эффективности удаления с продувкой азотом и без нее; Измеренная эффективность удаления биопленки существенно не отличалась друг от друга (t-критерий, p > 0,55). Таким образом, с помощью этой методики можно очистить различные биозагрязненные поверхности в течение одной минуты.

Введение

Биопленки — это сложные структуры бактериальных сообществ, в которых бактериальные клетки встроены в самостоятельно производимые матрицы внеклеточных полимерных веществ, удерживаются вместе и защищены от внешней среды. Биопленки могут представлять опасность для здоровья населения и приводить к экономическим потерям, поскольку они могут образовываться на различных поверхностях, включая материалы и устройства для медицинских имплантатов, оборудование для пищевой промышленности и теплообменники. Фактически, было обнаружено, что биопленки связаны с 65% всех бактериальных инфекционных заболеваний у людей, по данным Центров по контролю и профилактике заболеваний1.

Автоклавы и дезинфицирующие средства, такие как хлор, обычно используются для инактивации биопленок. Тем не менее, использование автоклава ограничено для поверхностей, которые не могут выдержать высокую температуру пара и не могут быть помещены в автоклав. Дезинфицирующие средства не подходят для поверхностей, чувствительных к химической обработке или склонных к сбору токсичных продуктов окисления2. Кроме того, биопленка должна быть не только инактивирована, но и удалена, чтобы предотвратить прикрепление новых клеток к поверхности, тем самым образуя новуюбиопленку3. Тем не менее, удалить биопленки методами, основанными на сдвиге вязкой жидкости, сложно, потому что скорость потока у поверхности почти равна нулю, а сила сдвига обычно не может преодолеть адгезионные силы микронных и субмикронных веществ. Кроме того, известно, что биопленочная матрица действует как физический и химический барьер1.

Многие физические и механические методы были разработаны для удаления биопленок с поверхностей, включая ультразвуковую вибрацию1, электрические токи4, лазерное облучение5 и распыление воды под высоким давлением6. У каждой методики есть свои плюсы и минусы. Ультразвуковая вибрация и электрический ток могут использоваться для контроля образования биопленки; Однако они требуют особой конфигурации и проводящих поверхностей, соответственно, требующих дополнительного напряжения сдвига1, 4. Лазерное облучение может быть применено как на ограниченную площадь, так и на твердые поверхности; Тем не менее, некоторые живые и мертвые клетки остаются на поверхности5. Распыление воды под высоким давлением эффективно удаляет биопленки; Однако их высокий импульс может привести к повреждению мягких оснований6.

Ранее было предложено удаление биопленки с помощью аэрозолей CO2. Он показал многообещающие результаты, с высокой эффективностью удаления в течение короткого времени7-11. Аэрозоли CO2 образуются в результате адиабатического расширения газа CO2 под высоким давлением через сопло и наносятся на поверхности, загрязненные биопленкой. В этой технике очистки используется передача импульса твердыми частицами CO2 и действие растворителя расплавленных жидкостей CO2, за которым следует аэродинамическая сила сдвига газа CO2 12. По сравнению со струями газа N2 высокого давления, аэрозольные струи CO2 при том же давлении застоя гораздо эффективнее удаляют биопленки E. coli. Более того, несмотря на то, что импульс твердогоCO2, доставляемого бактериям, значительно высок, импульс всей аэрозольной струи, приложенной к твердой поверхности, значительно ниже, чем у водяных струй. Таким образом, очистка без повреждений возможна с помощью этой аэрозольной техники CO2.

В этом протоколе периодические струи аэрозолей CO2 без продувки азотом использовались для удаления биопленок Pseudomonas putida с полированной поверхности нержавеющей стали. На самом деле, во многих исследованиях аэрозолейCO2 для повышения эффективности удаления за счет уменьшения конденсации влаги, образующейся во время очистки, использовались азотные продувки, хотятакже применялся нагрев с помощью нагревательной плиты или инфракрасных ламп и использование сухих боксов. Образование поверхностной биопленки и оптимизированные процедуры очистки описаны ниже. Эффективность удаления оценивали путем измерения интенсивности флуоресценции биопленки на поверхности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка поверхности для биопленки

  1. Вырезать 1 мм толщиной 304 пластины из нержавеющей стали в щепу (10 × 10 мм 2) с механическим резаком.
  2. Выполнение ультразвуковой очистки щепы в ацетоне, метаноле, и деионизированную (ДИ) воды последовательно в течение 10 минут каждый. Используйте растворитель резистентных контейнер, изготовленный из веществ, таких как стекло, для удаления органических загрязнений.
  3. Ополосните чипы с проточной DI воды в течение 3-5 сек.
  4. Сухие чипы с использованием N 2 поток газа в течение 3-5 сек.

2. Подготовка бактериальной культуры

  1. Возьмите P. putida KT2440 (любезно предоставленный проф Sung Kuk Ли, UNIST, Южная Корея) запаса , хранящегося в -80 ° C морозильнике.
  2. Разморозить при комнатной температуре, после 1 мин, а верхний слой замороженного исходного раствора превращается в слякоть. Погружают петлю в расплавленном слое исходного раствора.
  3. Используйте эту петлю, чтобы полоса бактерий на Лурия в-Bertani (LB) пластины, содержащей 1,5% агара.
  4. Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 30 ° C, чтобы расти колонии бактерий.
  5. Выберите одну колонию из планшета с использованием свежей петли.
  6. Инокулируйте 10 мл LB бульона в конической трубе 50 мл с помощью петли, содержащей единственную бактериальную колонию.
  7. Инкубируйте бульон в качалке инкубаторе в течение 16 часов при температуре 30 ° C и 160 оборотов в минуту.

3. биопленки на поверхности

  1. Встреча каждого из готовых чипов с помощью пинцета и окунуть в 70% этаноле в 5 раз в течение 1-2 сек каждый, чтобы стерилизовать поверхность каждого чипа. Убедитесь в том, что чипы удерживаются с помощью пинцета во время погружения.
  2. Dip каждый чип в автоклавного DI воде и в LB бульоне последовательно, 5 раз в течение 1-2 сек каждый, чтобы удалить остатки этанола.
  3. Поместите эти фишки в 6-луночные культуральные планшеты с 2-х микросхемах и 5 мл LB бульона на лунку.
  4. не Развести бактериальной культуры до концентрации в бульоне LB достигает8 × 10 8 клеток / мл (оптическая плотность при 600 нм: ~ 0,8).
  5. Инокулируйте каждую лунку 50 мкл разведенного бактериальной культуры.
  6. Инкубируйте пластин при 30 ° С без встряхивания в течение 24 ч для образования биопленки.

Очистка 4. CO 2 Аэрозоль

  1. Dip биопленка сформированных чипов в 10 мМ буфере ацетата аммония (летучие) в 5 раз, чтобы удалить слабо связаны и планктонных бактерий.
  2. Сушат эти чипы в шкафу биологической безопасности, где воздух проходит мягко.
  3. Сразу после высыхания, поместите чип на место погрузки, который находится в 20 мм от CO 2 сопла вдоль оси струи. Наклон оси струи под углом 40 °.
  4. Установите Застой давление СО 2 и N 2 газа до 5,3 МПа и 0,7 МПа соответственно, с помощью регуляторов давления газа.
  5. Нанесите аэрозольную струю на центральную часть чипа. Белые аэрозоли , включая твердый CO 2 должнобыть видимым. Поворот "на" электромагнитный клапан для СО 2 в течение 5 секунд, а затем включите его "выключено" в течение 3 сек (цикл: 8 сек) периодически используя вручную управляемый выключатель. Если продувку азотом необходимо использовать, включите электромагнитный клапан для непрерывной подачи N 2.
  6. Лечить чипы с СО 2 аэрозолями для 16, 40 и 88 сек и без азота чисток. Сохранил чипы без лечения в качестве отрицательного контроля.

5. Анализ эффективности для удаления

  1. Приготовьте 1 мкМ зеленая флуоресценция нуклеиновой кислоты пятно (длина волны возбуждения / испускания: 480/500 нм) в деионизированной воде для окрашивания бактериальных клеток на контроле и аэрозольных обработанных чипов.
  2. Поместите фишки в красящим раствором.
  3. Инкубируйте чипы в инкубаторе без света при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
  4. После инкубации осторожно прополоскать стружку с проточной водой DI для удаления избытка флуоресцентного красителя.
  5. Сушат чипы Wiго N 2 потока газа.
  6. Возьмите флюоресценции микроскопические изображения 5 случайных полей зрения (321 × 240 мкм 2) для каждого чипа с помощью эпифлуоресцентной микроскопа, 40X объектив, и камера CCD.
  7. Получить интенсивности флуоресценции для каждого изображения, используя программное обеспечение для обработки изображений, такие как ImageJ. В ImageJ, используйте функцию "Вычитание фона" в меню "Process" и выберите "интегральной плотности" в окне "Установка измерений" в меню "Analyze". Выполните "измерения" в меню "Анализ", чтобы получить интенсивность флуоресценции.
  8. Рассчитать эффективность удаления биопленки в соответствии со следующей формулой: 100% × (I чипсов контрольных - I обработанных чипсов) / (I чипсов управления), где I является вычисленной интенсивности флуоресценции.
  9. Получить среднее эффективность удаления и стандартные отклонения. Использование вНаименее 4 фишки для каждого случая.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

CO 2 аэрозолей были использованы для удаления P. putida биопленки из SUS304 поверхностей (рисунок 1). Большая часть поверхности были покрыты биопленки после 24 часов роста. Большая часть биопленки была удалена с помощью СО 2 аэрозолей (рисунок 2). Как и следовало ожидать, на рисунке 3 показано увеличение эффективности удаления биопленки как время обработки аэрозольный СО 2 увеличивается. За время лечения 88 сек, эффективность уд...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ранее мы проводили исследования по оптимизации давления газаCO2 , угла наклона струи и расстояния до твердой поверхности при аэрозольной очистке CO2 7. В отличие от наших предыдущих исследований, в настоящем исследовании азотная продувка не была включена в аэрозоль (Рисунок 1). Более того, в этом протоколе использовалась нержавеющая сталь 304, так как она является одной из самых распространенных нержавеющих сталей и широко используется в пищевой промышленности. Полированн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемой Министерством науки, ИКТ и будущего планирования (# 2015R1A2A2A01006446).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
304 нержавеющая стальSteelni
(Южная Корея)		Полированные и нарезанные кубиками
Ультразвуковой очистительBranson
(США)		5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)Becton, Dickinson and Company
(США)		244620500 г
AgarBecton, Dickinson and Company
(США)		214010500 г
6-луночный планшетдля культуры SPL Life Sciences
(Южная Корея)		32006
Буфер ацетата аммонияSigma-Aldrich
(США		)66740410 мМ
Двойная газовая установкаApplied Surface Technologies
(США)		K6-10DGОдна форсунка для CO2 газ
и 8 форсунок для N2 газ
SYTO9Thermo Fissher Scientific<бр/> (США)Возбуждение инвитрогена: 480 нм<бр/> Излучение: 500 нм
Эпифлуоресцентный микроскоп Nikon (Япония)Объектив Eclipse 80i
40XNikon
(Япония)		Plan FluorNA: камера
с ПЗС-матрицей 0.75 Фотометрика<бр/> (США)Cool SNAP HQ2Монохромный

Ссылки

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
  2. Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
  3. Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
  4. Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
  5. Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
  6. Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
  7. Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
  8. Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
  9. Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
  10. Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
  11. Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766(2015).
  12. Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Pseudomonas putidaповерхности из нержавеющей сталифлуоресцентная микроскопиявремя воздействия аэрозоляэффективность удалениятрехфазная очисткабиозагрязненные поверхности
Удаление биопленки с использованием диоксида углерода Аэрозоли без продувки азотом
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.