Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Разработка системы Вирус Reporter гепатита B для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации

13.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54849

⸱

1 февраля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Hepatitis and Immunology, National Center for Global Health and Medicine, 2Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc.

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем недавно разработанный вирус гепатита В (HBV) системы репортер контролировать ранние стадии жизненного цикла вируса гепатита. Эта упрощенная в пробирке системы поможет в скрининга агентов против HBV с использованием стратегии высокой пропускной способностью .

Аннотация

В настоящее время возможно создание рекомбинантных форм различных вирусов, таких как вирус иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) и вирус гепатита С (ВГС), которые несут чужеродные гены, такие как репортерный или маркерный белок, в своих геномах. Эти рекомбинантные вирусы обычно точно имитируют жизненный цикл исходного вируса в инфицированных клетках и демонстрируют ту же зависимость от диапазона хозяев. Разработка рекомбинантного вируса позволяет проводить эффективный скрининг ингибиторов и идентифицировать специфические факторы хозяина. Тем не менее, на сегодняшний день создание рекомбинантного вируса гепатита В (HBV) было затруднено из-за различных экспериментальных ограничений. Основным ограничением является компактный размер генома HBV, и достаточно строгий размер генома, не превышающий 1,3 размера генома, который должен быть упакован в вирионы. Таким образом, размер вводимого чужеродного гена должен быть меньше 0,4.н., если делеция геномной ДНК не должна производиться. Следовательно, чтобы преодолеть это ограничение по размеру, требуется делеция части ДНК HBV. В данной работе мы сообщаем о создании рекомбинантного HBV, кодирующего репортерный ген, для мониторинга ранней стадии цикла репликации HBV путем замены части ядра HBV-кодирующего участка на репортерный ген путем удаления части кодирующей HBV pol-области. Выявление рекомбинантной инфекции HBV, контролируемое по активности репортера, было высокочувствительным и менее дорогостоящим, чем обнаружение с использованием доступных в настоящее время традиционных методов оценки инфекции HBV. Эта система будет полезна для ряда приложений, включая высокопроизводительный скрининг для идентификации ингибиторов анти-HBV, факторов хозяина и чувствительных к вирусу клеток.

Введение

Хроническая инфекция с вирусом гепатита В (HBV) является одним из основных факторов риска развития хронических заболеваний печени 1. Хотя современные терапевтические стратегии основаны на нуклеотидных аналогов , которые ингибируют ВГВ функцию Pol и / или введение типа интерферона , который активирует иммунные реакции у инфицированных лиц, а также косвенно подавляя пролиферацию HBV посредством функций гена интерферона-стимулированной 2, эти процедуры не могут устранить HBV ДНК полностью 3. Кроме того, появление HBVs, устойчивых к анти-POL агентов вызывает беспокойство 4. Введение комбинированных анти-вирусных агентов, непосредственно ориентированных на различные этапы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или вирус гепатита С (HCV) жизненного цикла было показано, чтобы успешно подавлять или уничтожать вирус (ы). Подобно этой идее, развитие анти-HBV агента (агентов), которые действуют непосредственно на различных этапах HBV жизненного цикла имеет важное значение для создания будущих методов лечения HBV.

В общем, создание простой в пробирке системы культуры целевого вируса способствует развитию антивирусных агентов. Тем не менее, есть по крайней мере два препятствия для развития в пробирке систем культивирования для скрининга агентов против HBV. Первым из них является отсутствие удобной системы культивирования клеток в пробирке для HBV - инфекции / пролиферации. В отличие от других вирусов, таких как ВИЧ и ВГС, которые распространяются в установленных клеточных линий, что трудно культивировать HBV в пробирке из - за ограничений , в том числе экспериментальных узком диапазоне хозяина. Использование специфических систем клеточных культур , таких , как клеточной линии гепатомы человека HepaRG, который восприимчив к инфекции HBV, 5, 6, 7, были разработаны для преодоления этих проблем. Кроме того, PXB клетки, выделенные из урокиназы-тире активатор плазминогена трансгенный / SCID мышей , привитых первичных человеческих гепатоцитов (ФН), как было показано, быть восприимчивы к инфекции ВГВ и репликации 8. Однако уровни репликации HBV в HepaRG зависят от состояния клеточной дифференцировки после культуры, что может привести к несогласованным и невоспроизводимые результаты уровней инфекции / репликации HBV. PXB обычно используется для экспериментов инфекции HBV, но ограничивается его доступностью. Тетрациклин индуцибельная HBV линии экспрессии в клетках, HepAD38, также широко используется для изучения репликации HBV, но эта система позволяет только оценку после транскрипции , а не на этапе входа HBV - инфекции 9. В последнее время идентификация натрия таурохолат cotransporting полипептида (НПБТ) в качестве функционального рецептора для ВГВ позволило разработать системы 10 культуры переменная HBV. Действительно, выражение НПБТ в нечувствительных гепатокарциномы клетках, таких как HuH7 иHepG2 позволяет инфекции ВГВ 10 и , таким образом, выбор чувствительных клеточных линий HBV была расширена, решение многих экспериментальных ограничений. Вторая проблема заключается в отсутствии простой тест-системы для оценки HBV-инфекции и репликации. Оценка HBV-инфекции обычно проводится путем анализа ДНК HBV, РНК и белков. Тем не менее, количественное определение этих вирусных маркеров отнимает много времени, часто дорого и не всегда просто. Таким образом, разработка простой системы анализа, например, с использованием ген-репортер, возможно, преодолеть проблемы, связанные с системами ВГВ анализа.

Тем не менее, так как размер генома , которые могут быть упакованы в HBV капсида ограничено - менее 3,7 кб 11 - размер гена - репортера должен быть как можно короче. Кроме того, наличие нескольких цис-элементов, рассеянных по всему геному, которые необходимы для репликации вируса, ограничивает позиции, доступные для в высказанное гена-репортера в геном. Несколько сообщений пытались ввести чужеродные гены, в том числе ВИЧ-1 Tat, зеленый флуоресцентный белок, и DsRed, в геноме HBV 11, 12, 13. Тем не менее, эти рекомбинантные HBVs не являются полезными для скрининга HBV-инфекции / репликации, или для высокопроизводительного скрининга факторов, влияющих на HBV-инфекции / репликации. Это происходит главным образом из-за низкой производительности рекомбинантных вирусов и пониженной интенсивности экспрессии репортерного гена, вызванного неэффективного производства вируса.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы сконструировали репортер HBV с высоким выходом продукции вируса. Этот вирус очень чувствителен для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации HBV, от входа в транскрипции. Для достижения этой цели, NanoLuc (NL) был выбран в качестве гена-маркера, потому что это небольшой (171 аминокислот) инженерии люминесцентный репортеркласс = "Xref"> 14. Кроме того, NL примерно 150 раз ярче, чем светлячков или Renilla люциферазы, и реакция люминесцентный является АТФ-независимым, предполагая, что частота ложных хит будет низкой для высокопроизводительного скрининга. Эффективность производства рекомбинантного HBV составляет примерно 1/5 от родительского HBV, и похожи на уровни, представленных за предыдущие HBV рекомбинантных вирусов; Тем не менее, яркость NL преодолевает проблемы производительности вируса, поэтому он может быть использован для массового скрининга анти-HBV агентов.

Скрининг агентов против HBV с использованием первичных гепатоцитов, HepaRG, HepAD38 и НПБТ трансдуцированных гепатоцитов может быть полезным для скрининга агентов против HBV традиционным способом (ами). Тем не менее, система, описанная здесь, имеет различные преимущества, такие как простое управление, высокую чувствительность и низкая стоимость для скрининга. Эти преимущества являются подходящими для высокой пропускной способности анализов с целью разработки и выявления новых HBV агентов в терапевтических целях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Получение рекомбинантного HBV Кодирование Reporter белка

  1. Получение клеток HepG2
    1. Готовят среду для культивирования клеток (среда Игла в модификации Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 100 ед / мл заменимые аминокислоты).
    2. Пластина 4 х 10 6 клеток HepG2 в 10-сантиметровом коллагеном покрытием блюдо в 10 мл культуральной среды , за день до трансфекции. Инкубируйте клетки HepG2 при 37 ° C в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе.
      Примечание: Когда примерно 4 х 10 6 HepG2 клетки высевают в 10 см коллагеном покрытием чашку для препарата в 10 мл культуральной среды, они будут 70-90% сплошности на следующий день.
  2. трансфекция
    1. Трансфекции клеток HepG2 5 мкг pUC1.2HBV дельта эпсилон 15 и 5 мкг pUC1.2HBV / NL 15 , используя трансфекциюреагента в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. На следующий день, удалить культуральной среды и добавляют 10 мл свежей культуральной среды.
    3. Через неделю после трансфекции, передачи культуральной среды, содержащей рекомбинантный вирус гепатита В в 50 мл трубки и перейти к этапу 1.3.1. Добавляют 10 мл свежей культуральной среды в чашке, содержащей трансфектированных клеток.
      Примечание: Получение рекомбинантного HBV сохраняется в течение 4-х недель. Носитель культуры, содержащей рекомбинантный вирус гепатита может храниться при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.
  3. Очистка рекомбинантных HBV
    1. Удалить остатков клеток от культуральной среды, содержащей рекомбинантный вирус гепатита центрифугированием (2300 х г в течение 5 мин).
    2. Пропускают супернатанта через мембранный фильтр 0,45 мкм.
    3. Добавить равный объем 26% PEG / 1,5 М NaCl (полиэтиленгликоль 6000: 130 г, NaCl, 49 г, 1 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0 и 5 мл 1 М HEPES рН 7,6 в 500 мл) в культуральной среде содержащий рекомбинантныйHBV и аккуратно перемешать. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
    4. Центрифуга при 2300 мкг в течение 20 мин при 4 ° С.
    5. Жидкость над осадком сливают и растворяют осадок в 0,5 мл ТНЭ (10 мМ Трис, 50 ​​мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА).
    6. Удалите мусор с помощью центрифугирования при 2300 мкг в течение 5 мин.
    7. Нагрузка 0,5 мл ТНЭ, содержащей рекомбинантный вирус гепатита на 0,8 мл 20% сахарозы в TNE.
    8. Центрифуга при 100000 × г в течение 3 ч при 15 ° С.
    9. Откажитесь, как большая часть надосадочной жидкости, как это возможно, и сохранить осадок. Ресуспендируют его в 1 мл бессывороточной среды DMEM на 40 мл культуральной среды, начиная.
    10. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
    11. Смесь фильтруют через фильтр 0,45 мкм. Приготовьте 0,5 мл аликвоты и хранят при -80 ° С.
      Примечание: Если наблюдается загрязнение репортер белка исходного образца вируса, очистить вирус с помощью градиента плотности ультрацентрифугированием 5-30% сахарозы в TNE при 100000 х г в течение 2 ч, или CsCl, плотность, уравновешенную центрифугирование сюдам 1,1-1,6 г / мл при 150000 мкг в течение 50 часов.

2. Заражение HBV рекомбинантного

  1. Культура клеток HepG2 , стабильно экспрессирующие НПБТ (HepG2 / НПБТ) 15, которые восприимчивы к инфекции ВГВ в среде DMEM , дополненной 10% FBS, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 250 мкг / мл G-418 и 100 Ед / мл заменимые аминокислоты при температуре 37 ° C в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе.
  2. За один день до инфицирования, пластины приблизительно 5 х 10 4 HepG2 / НПБТ клетки 14 в пластине с покрытием 96-луночных коллагена в 0,1 мл культуральной среды.
  3. Оттепель рекомбинантный HBV в C водяной бане при 37 ° до тех пор, пока маленький кусочек оставшегося во флаконе льда.
  4. Готовят среду для инфекции путем объединения следующих: по 10 мкл 40% PEG8000 в 1x фосфатном буферном солевом растворе (PBS), 2 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), 10 мкл рекомбинантного HBV и 78 мкл свежей культуральной средына лунку 96-луночного планшета.
  5. Добавьте 100 мкл раствора рекомбинантного HBV в одну лунку 96-луночного планшета.
  6. Через день после заражения, промойте инфицированные клетки 3 раза с 300 мкл PBS на лунку, чтобы удалить белок загрязняющий репортер из вирусной фракции.
  7. Инкубируйте инфицированных клеток в 200 мкл культуральной среды, содержащей 2% ДМСО в течение одной недели или менее.

3. Анализ

  1. Через неделю после заражения, промойте инфицированные клетки 3 раза PBS.
  2. Добавьте 50 мкл буфера для лизиса в инфицированных клетках.
  3. Rock Культуральный планшет в течение 5 мин, а затем центрифугировать при 2000 х г в течение 5 мин.
  4. Добавьте 50 мкл субстрата репортера в фотометр пластину.
  5. Добавьте 20 мкл лизата клеток в люминометра пластину, содержащую репортерный подложку. Смешайте встряхиванием кратко.
  6. Поместите пластину в фотометр и начать чтение 15.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показана схема генома ВГВ, переписана РНК, вирусные белки и их кодирующей области на геном. Ген-репортер и его местоположение в геноме указаны также. На рисунке 2 показан репортер плазмиды и вспомогательной плазмиды ВГВ , содержащей ген - репортер. Репортер pUC1.2HBV / NL был построен путем удаления нуклеотидные положения 223-811 от сайта инициации транскрипции мРНК preCore из pUC1.2HBV 16 , а затем вставить ген - реп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

HBV геном имеет четыре основных открытых рамок считывания (ORF , ) , включая ядро, полимеразы, поверхностных и X ORF , (рисунок 1). Транскрипция из этих четырех HBV ORF , жестко регулируется четырьмя промоутеров: при регистрации precore / ядро промотора , содержащие энхансер II, S1 промотор, S2 промотор и X промотор , содержащий энхансер I 18. 3,5 кб и 3,4 кб мРНК транслируются в PreCore и ядро ​​белков, соответственно. Большой обволакивают белок (L) получают из крупнейших субген...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Исследовательской программой по гепатиту от Японского агентства медицинских исследований и разработок (AMED) и грантами на научные исследования от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий (MEXT) Японии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Nano-Glo Luciferase AssayRegentPromega N1110
Пенициллин-стрептомицин смешанный растворNacalai tesque09367-34 
MEM Раствор заменимых аминокислотThermo Fisher Scientific11140050
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM I Сниженная сыворотка MediumThermo Fisher Scientific31985070
100 мм/покрытая коллагеном чашкаIwaki4020-010
Липофектамин 3000 Реагент для трансфекцииThermo Научный L3000001 Фишера;
Полиэтиленгликоль (ПЭГ) 6000 Sigma-Aldrich81255
Полиэтиленгликоль (ПЭГ) 8000 Sigma-Aldrich89510
NaClNacalai tesque31319-45 
0,5 моль/л раствор ЭДТАNacalai tesque06894-14
Tris-HClNacalai tesque35434-21
Millex-HP, 0,45 μ m, полиэтэфирсульфон, фильтрMerck MilliporeSLHP033RS
диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD2650
Коллагеновое покрытие 96-луночная пластинаCorningNO3585
Пассивный лизис 5x БуферPromegaE1941
GloMax 96 Микропланшетный люминометрPromegaE6501
СахарозаNacalai tesque30403-55
ЛюминометрGreiner bio-one655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22--Артикул 15
pUC1.2HBV дельта эпсилон--Артикул
15 pUC1.2HBV/NL--Артикул 15
50 мл тюбикViolamo1-3500-02
Anti-Myc антителоSigma-AldrichC3956
HBIGЯпонская организация по производствукрови-ИФН
-&бета;Mochida Pharmaceutical14987224005413
гепаринсигма-олдричH3393

Ссылки

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306(2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. , Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42 (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Конструирование рекомбинантного HBVмониторинг цикла репликации HBVскрининг агентов против HBVинфицирование клеток HepG2 NTCPметод осаждения ПЭГцентрифугирование в градиенте сахарозыдетекция репортерного генаидентификация ингибиторов HBVанализ факторов хозяина
Разработка системы Вирус Reporter гепатита B для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.