Индуцибельные LAP-меченый Стабильные клеточные линии для исследования белка функции, пространственно-временной локализации и белковое взаимодействие сетей

Чтобы исследовать клеточную функцию неохарактеризованного белка, важно определить его пространственно-временную субклеточную локализацию in vivo и его взаимодействующих белковых партнеров. Традиционно для облегчения локализации белка и изучения взаимодействия белков использовались одиночные и тандемные эпитопные метки, слитые с N- или C-концом интересующего белка. Например, технология тандемной аффинной очистки (TAP) позволила выделить нативные белковые комплексы, даже те, которые находятся в малом количестве, как в дрожжевых^{линиях,} так и в клеточных линиях млекопитающих. Технология локализации и аффинной очистки (LAP) является более поздней разработкой, которая модифицирует процедуру TAP для включения компонента локализации путем введения зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве одной из эпитопных меток³. Этот подход дал исследователям более глубокое понимание субклеточной локализации белка в живых клетках, а также сохранил возможность выполнять комплексную очистку TAP для картирования сетей белок-белковых взаимодействий.

Однако существует множество проблем, связанных с использованием технологий TAP/LAP, которые препятствуют их широкому использованию в клетках млекопитающих. Например, продолжительность времени, необходимого для генерации стабильной клеточной линии, экспрессирующей интересующий интерес белок, меченный TAP/LAP; который, как правило, основан на клонировании интересующего гена в вирусный вектор и выборе стабильных интегрантов с одной клеткой с желаемым уровнем экспрессии. Кроме того, многие клеточные пути чувствительны к сверхэкспрессии конститутивных белков (даже при низких уровнях) и могут останавливать клетки или вызывать их гибель с течением времени, что делает невозможным создание стабильной клеточной линии TAP/LAP. Эти и другие ограничения не позволили методологиям LAP/TAP стать высокопроизводительными системами для локализации белков и выяснения белковых комплексов. Таким образом, существует значительный интерес к разработке индуцируемой высокопроизводительной системы LAP-мечения для клеток млекопитающих, которая использует преимущества современных инноваций в технологиях клонирования и клеточных линий.

Здесь мы представляем протокол генерации стабильных клеточных линий с индуцируемыми LAP-метками белками с Doxycycline/Tetracycline (Dox/Tet), представляющий интерес, который применяет достижения как в клонировании, так и в технологиях клеточных линий млекопитающих. Такой подход упрощает сбор данных о субклеточной локализации белка, меченном LAP, очистке белкового комплекса и идентификации взаимодействующих белков⁴. Несмотря на^{то, что} аффинная протеомика использует широкий спектр методов для выяснения белковых комплексов5, наш подход полезен для ускорения идентификации этих комплексов и их нативных сетей взаимодействия, а также поддается высокопроизводительному мечению белков, которое необходимо для исследования сложных биологических путей, содержащих множество белковых компонентов. Ключом к этому подходу являются достижения в стратегиях клонирования, которые обеспечивают высокую точность и ускоренное клонирование целевых генов в массив векторов для экспрессии генов in vitro, в различных организмах, таких как бактерии и бакуловирусы, а также^{в клетках} млекопитающих. Кроме того, коллаборация ORFeome клонировала тысячи проверенных последовательностей открытых рамок считывания в векторах, которые включают в себя эти достижения в клонировании, доступные научному сообществу^8-11. В нашей системе вектор LAP-тегирования pGLAP1 позволяет одновременно клонировать большое количество клонов, что способствует высокопроизводительному LAP-мечению. Эта ускоренная процедура клонирования сочетается с оптимизированным подходом к созданию клеточных линий с генами, помеченными LAP, которые представляют интерес, вставленными в один заранее определенный геномный локус. При этом используются клеточные линии, которые содержат в своем геноме один сайт узнаваемой мишени (FRT), который является местом интеграции генов, помеченных LAP. Эти клеточные линии также экспрессируют тетрациклиновый репрессор (TetR), который связывается с операторами Tet (TetO₂) перед генами, помеченными LAP, и подавляет их экспрессию в отсутствие Dox/Tet. Это позволяет индуцировать Dox/Tet экспрессию белка, меченного LAP, в любой момент времени. Способность индуцировать экспрессию белка, меченного LAP, имеет решающее значение, поскольку многие клеточные пути чувствительны к уровням критических белков, регулирующих этот путь, и могут останавливать рост клеток или вызывать гибель клеток, когда эти белки конститутивно сверхэкспрессируются, даже на низких уровнях, что^{делает невозможным} генерацию неиндуцируемых стабильных клеточных линий, меченных LAP.

Примечание: обзор генерации индуцируемых LAP-меченый линии клеток стабильным для любого интересующего белка иллюстрируется на рисунке 1 и обзор LAP-меченого экспрессии белка, очистки и подготовки к массовым протеомики анализа показан на рисунке 3.

1. Клонирование открытой рамки считывания (ORF) гена интереса в LAP-тегов Вектор

1. Клонирование ORF гена интереса к челночной Vector.
   1. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации ORF интереса с соответствующими attB1 и attB2 сайтов в пределах праймеров для любого N-концевого слияния или С-концевого слияния. Приведены в таблице 1 для последовательностей праймеров и таблице 2 для условий ПЦР.
   2. Гель очищают продуктов ПЦР путем разделения их на 1% -ном агарозном геле. Акцизный усиленную группу, которая является правильный размер из геля и извлечь его из куска геля с использованием ДНК гнабор для выделения эль в соответствии с инструкциями изготовителя.
   3. Выдержите очищенный attB , содержащий продукты ПЦР с ATTP , содержащим челночный вектор и рекомбиназы , что позволяет ПЦР - продукты рекомбинация в вектор в соответствии с инструкциями производителя (см M aterials таблицу).
      Примечание: Пустые челночные векторы и LAP-мечения векторы содержат ген ПЗС- B и должны быть размножены в ПЗС- В устойчивых бактериальных клеток (см Материалы таблицу). Однако ген БДКК объединяется, когда к ней ORF вставляется в эти векторы, следовательно , используют стандартные клетки DH5 & alpha ; E.coli , при распространении векторов с клонированными ORF , .
   4. Transform DH5 & alpha ; клетках E.coli с 1 мкл продукта реакции и пластинчатые трансформированных клеток на Лурии бульона (LB) агар пластины с 50 мг / мл канамицина ^13.
   5. Выберите колонии, устойчивые к канамицину.
   6. Grow выбранные колонии в LB меняДиа с 50 мг / мл канамицина, чтобы ДНК мини-Prep и подтвердить интеграцию гена путем секвенирования ДНК с использованием праймеров для секвенирования , перечисленных в таблице 3.
2. Перенос интересующего гена из челнока Вектор в LAP-тега Vector.
   1. Выдержите челночный вектор, содержащий последовательность подтверждали интересующего гена ORF с LAP-тегов вектора (pGLAP1 для N-концевого слитого) и рекомбиназы, который опосредует передачу представляющего интерес гена из челночного вектора в вектор LAP-тегов в соответствии с инструкции изготовителя (см Материалы).
      Примечание: Серия LAP / TAP векторов , которые могут быть использованы на основе желаемой промотора, эпитоп-метку, и N или С-концевого мечения можно найти в таблице 4.
   2. Transform DH5 & alpha ; клетках E.coli с 1 мкл продукта реакции и пластинчатые трансформированных клеток на чашку с агаром LB с 100 мг / мл ампициллина , ^13.
   3. Выберите стойкую Colo ампициллинпаний.
   4. Grow выбранные колонии в LB среде с 100 мг / мл ампициллина, сделать ДНК мини-Prep, и подтвердить интеграцию гена путем секвенирования ДНК с использованием праймеров , перечисленных секвенирования в таблице 5.

2. Генерация индуцируемого стабильной клеточной линии, которая выражает LAP-меченый ген, представляющий интерес

1. Выберите линию клеток лучше всего подходит для проекта, представляющего интерес. В качестве альтернативы, создать линию клеток хозяина из любой существующей линии клеток, которые конститутивно экспрессирует тетр и содержит сайт FRT, который позволяет Поясной-меченый ген, представляющий интерес быть стабильно интегрирована в геном (см Материалы).
   Примечание: Этот протокол использует клеточной линии HEK293, содержащий тетр и сайт FRT, выращиваемый в -Tet DMEM / F12 СМИ [сделано с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), лишенной тетрациклин (-Tet)] ⁴ ,
2. Определить минимальную концентрацию гигромицина требуется, чтобы убить линию клеток-хозяев в пределах от 1 до 2 пикс после того наркотиков. Концентрация может варьироваться от линий клеток-хозяев, при этом большинство в диапазоне от 100 мкг / мл и 800 мкг / мл.
   Примечание: HEK293 клетки , выращенные в -Tet DMEM / F12 среде с 100 мкг / мл гигромицину , при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ умирают в течение 1-2 недель.
3. Со-трансфекцию вектора, выражающий флиппазы рекомбиназой (посредничает интеграцию LAP-меченого интересующего гена в сайт FRT внутри генома клетки) с вектором LAP-меченый в клетки HEK293 с использованием реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями изготовителя , Используйте соотношение 4: 1 рекомбинантному вектора к вектору LAP ^14.
   Примечание: Оптимальное соотношение зависит от линии клетки-хозяина и способ трансфекции, и может потребоваться титрование. Соотношение 4: 1 хорошо подходит для большинства клеточных линий. Включите мнимо трансформированных пластину в качестве отрицательного контроля.
4. Однажды после трансфекции, замените / F12 СМИ -Tet DMEM со свежей средой.
5. Через два дня после transfectiна, расщепленных клеток до 25% слияния. Разрешить клетки ~ 5 ч, чтобы прикрепить к нему, а затем добавить к гигромицину-содержащий -Tet DMEM / F12 носитель в концентрации заданного в шаге 2.2. Для НЕК293 используют 100 мкг / мл к гигромицину.
   Примечание: FRT содержащий клеточной линии HEK293 также содержит тетр, связанный с сопротивлением бластицидин, поэтому 5 мкг / мл бластицидин используется во время стабильного процесса отбора клеточной линии, чтобы выбрать для тетр и свести к минимуму вытекающей выражение.
6. Заменить гигромицину содержащих -Tet DMEM / F12 СМИ по мере необходимости, пока отдельные очаги клеток появляются, которые напоминают непрозрачных пятен на прозрачной пластине.
7. Добавьте 20 мкл трипсина в верхней части каждой ячейки очагов и пипеткой вверх и вниз в 2 раза с 200 мкл пипетки наконечник. Место клеток в 24-луночного планшета и расширить клетки путем непрерывного роста в гигромицину содержащих -Tet DMEM / F12 СМИ.
8. Клетки сетчатые для индуцируемой экспрессии белка LAP-меченый по фиксированной клеток или живых клеток флуоресцентной микроскопии и / илиВестерн - блоттинга для GFP тега внутри тега ^LAP-15.

3. Очистка LAP-меченый белковых комплексов

Примечание: Следующая LAP-меченого очистки белков детали протокола рекомендации по условиям и объемам используемых для типичной очистки белков LAP-меченый на основе предыдущего опыта. Тем не менее, следует проявлять осторожность, чтобы гарантировать, что эмпирическое оптимизация проводится для любого белкового комплекса и уровня экспрессии белка, представляющие интерес для обеспечения наилучших результатов.

1. Рост клеток и клеток урожая.
   1. Разверните проверенную LAP-меченый клеточной линией для TAP изоляции белковых комплексов, путем непрерывного пассирования все НЕК293 в более крупные пластин и / или роллер - флаконах в -Tet DMEM / F12 среде при температуре 37 ° С и 5% CO _2.
   2. Для индуцибельная клеточных линий Tet / Dox, индуцируют в течение 10-15 ч при концентрации 0,2 мкг / мл Tet / Dox, когда клетки достигают ~ 70% слияния, до того harvestinг клеток.
      Примечание: Концентрация и время индукции должен быть определен для каждого белка, титрование 0,1-1 мкг / мл Tet / Dox в течение 10-15 ч, рекомендуется.
   3. Урожай клеток путем перемешивания или трипсином и гранул клеток при 875 мкг в течение 5-10 мин.
2. Связывание анти-GFP антитела к Бисер Белок А
   1. С помощью 40 мкг антитела для иммунопреципитации из лизатов, приготовленной из 0,5 мл клеточного осадка с, гематокрита (PCV).
      Примечание: Количество антитела, необходимое будет зависеть от обилия LAP-меченый белок, наряду с другими факторами, и потребует оптимизации. Титрование 10-40 мкг рекомендуется.
   2. Равновесие 160 мкл объем уплотненного (PV) бусинки Белок A в PBST (PBS + 0,1% твин-20) в 1,5 мл трубки. Промыть 3 раза с 1 мл PBST.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все смывает в настоящем документе, осуществляют центрифугирование бусинки при 5000 мкг в течение 10 сек.
   3. Ресуспендируют бисером в 500 мкл PBST и добавляют 80 мкг сродства-purified кроличьей анти-GFP антитела в каждую пробирку 160 мкл бус. Перемешивайте в течение 1 ч при комнатной температуре (RT).
   4. Вымойте бисером 2 раза с 1 мл PBST. Затем мыть бусин в 2 раза с 1 мл 0,2 М бората натрия, рН 9 (20 мл 0,2 М бората натрия + 15 мл 0,2 М борной кислоты). После последней промывки, добавляют 900 мкл 0,2 М бората натрия, рН 9, чтобы довести до конечного объема 1 мл.
   5. Добавьте 100 мкл 220 мМ диметилпимелимидата (DMP) до конечной концентрации 20 мМ. Поворот пробирки осторожно при комнатной температуре в течение 30 мин. Для получения 220 мМ DMP, ресуспендирования содержимое одного флакона 50 мг в 877 мкл 0,2 М бората натрия, рН 9 и добавляют непосредственно к суспензионной.
   6. После инкубации с ДМП, мыть бусин 1 раз с 1 мл 0.2 М этаноламина, 0,2 М NaCl, рН 8,5, чтобы инактивировать остаточный сшивающий агент. Ресуспендируют бисером в 1 мл того же буфера и вращаются в течение 1 ч при комнатной температуре. Пелле шарики и ресуспендируют бусины в 500 мкл 0,2 М этаноламина, 0,2 М NaCl с рН 8,5. Бусинки стабильны в течение Северал месяцев при температуре 4 ° С.
3. Подготовка буфера для лизиса клеток и комплексной очистки
   1. Подготовьте LAPX буферов (где X является искомой концентрации соли [мМ KCl] буфера LAP; 300 мм для лизиса клеток, 200 мм для большинства бортов моек, и 100 мм для мытья шариков до начала элюирование белков) путем рН раствора 7,4 содержащий 50 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES), Х мМ КСl, 1 мМ этиленгликоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (EGTA), 1 мМ MgCl _2, и 10% глицерина.
      Примечание: Компоненты этого буфера используются для аппроксимации среды в живых клетках. HEPES используется в качестве буфера в рН ярости 7.2-8.2. KCl, соль, используемая для поддержания ионной силы буфера. EGTA является хелатирующий агент, который связывает ионы кальция, чтобы уменьшить уровень кальция по сравнению с магнием. Глицерин и MgCl ₂ используются для улучшения стабильности белков.
   2. Подготовьте LAPX ^N буфер добавлением 0,05% нонил phenoxypolyethoxylethanol в буфер LAPX.
      Примечание: нонил phenoxypolyethoxylethanol является мягкое моющее средство, что растворяет белки, но сохраняет белок-белковых взаимодействий, таким образом, используется более высокая концентрация в процессе экстракции и затем опускается во время связывания и промывки.
4. Получение клеточных лизатов
   1. Ресуспендируют в 500 мкл PCV в 2,5 мл LAP300 с 0,5 мМ дитиотреитола (DTT) и ингибиторы протеазы. Добавить 90 мкл 10% нонил phenoxypolyethoxylethanol (0,3%) и окончательным перемешайте инверсии.
   2. Место на льду в течение 10 мин. Центрифуга при 21000 х г в течение 10 мин. Собрать эту низкую скорость супернатант (LSS). Возьмите пробу 10 мкл для анализа LSS геля.
   3. Передача LSS в TLA100.3 трубки и спина при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С. Соберите эту высокую скорость супернатанта (HSS), в трубе и место на льду. Возьмите пробу 10 мкл HSS для анализа в геле.
      Примечание: Избегайте брать верхний слой наиболее липидный апd нижней ячейки мусора слой. Липидный слой должен быть удален путем вакуумной аспирации до сбора ССА.
5. Первый Affinity Capture: Связывание с бисером Anti-GFP
   1. Предварительно элюирования антитела в сочетании бусин (используют 160 мкл шариков на 0,5 мл клеточного осадка (PCV)) путем промывки их 3 раза 1 мл буфера для элюции [3,5 М MgCl ₂ 20 мМ Трис, рН 7,4] , чтобы избавиться от отцеплен антитела и уменьшить фон. Сделайте быстро. Не оставляйте шарики в высокой концентрации соли в течение длительного времени.
   2. Вымойте бисер 3 раза 1 мл LAP200 ^N. Смешайте HSS экстракт с бусами антителами в течение 1 ч при температуре 4 ° С. Центрифуга при 21000 х г в течение 10 мин. Возьмите пробу 10 мкл супернатанта (то есть поток , проходящий через (FT)) для анализа в геле.
   3. Промыть бусин 3 раза с помощью 1 мл LAP200 ^N с 0,5 мМ ДТТ ингибиторов и протеаз. Вымойте бисером 2 раза (5 мин каждая) с 1 мл LAP200 ^N с 0,5 мМ DTT ингибиторов и протеазы. Промыть быстро 2 тредакторы IME с 1 мл LAP200 ^N с 0,5 мМ DTT и без каких - либо ингибиторов протеазы перед добавлением вируса табака травление (ТРВ) протеазы.
6. ТРВ Расщепление
   1. Разбавляют 10 мкг TEV протеазы в 1 мл LAP200 ^N и вращать трубки при 4 ° С в течение ночи.
      Примечание: Этот шаг может быть оптимизирована для любого LAP-меченый белок должен быть завершен в течение нескольких часов, регулируя концентрацию TEV протеазы, который может помочь сохранению LAP-меченого белковых комплексов.
   2. Гранул шарики и передачи супернатант в свежую пробирку. Промыть шарики дважды 160 мкл LAP200 ^N с 0,5 мМ DTT и ингибиторы протеазы (тройной концентрации) , чтобы удалить остатки белка. Возьмите пробу 10 мкл супернатанта для анализа в геле.
7. Второй Affinity Capture: Связывание с S белка агарозном
   1. Промыть 1 тюбик 80 мкл S белка агарозном суспензии (40 мкл упакована смола) 3 раза с помощью 1 мл LAP200 ^N.
      Примечание: S ProtEin связывание с S-тега будет воссоздавать активную РНКазы и альтернативный второй эпитоп тег следует рассматривать для РНК-содержащие белковые комплексы.
   2. Добавить ТРВ элюируют супернатант S белка агарозном бусин и рок в течение 3 ч при температуре 4 ° С. Пелле шарики и промыть 3 раза с 1 мл LAP200 ^N с 0,5 мМ DTT ингибиторов и протеазы. Вымойте бисером 2 раза с 1 мл LAP100.
8. Белок Элюирование
   1. Элюции белки от S белок агарозы путем добавления 50 мкл 4х буфера Лэммли образца и нагревают при 97 ° С в течение 10 мин.
      Примечание: Белки также могут быть элюировали из бисера с буфера для элюции (3,5 М MgCl ₂ 20 мМ Трис, рН 7,4).

4. Выявление белков, взаимодействующих с помощью масс-спектрометрического анализа

1. Проверить качество очистки путем анализа собранных образцов электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), окрашивание серебром геля (см 16 см Рисунок 4.
2. Для того, чтобы определить стехиометрические и субстехиометрические видов со-очистительные, принять окончательное образец элюции и отделить его с помощью SDS-PAGE. Пятно гель с масс-спектрометрии совместимы белка пятна. Акцизный самые известные группы и пространство между ними из геля и обрабатывать их для анализа методом масс - спектрометрии отдельно ^16.
   Примечание: Существуют многочисленные подходы для разделения конечных элюатов очистки и подготовки их для масс - спектрометрии ^5. Например, LAP-очищенные комплексы могут быть элюировали из S-белка с помощью бус с высоким содержанием соли (3,5 М MgCl ₂₎ и все население белка скопом можно анализировать с помощью масс - спектрометрии ^17. В качестве альтернативы, конечные элюатов могут быть разделены на 1 мм с помощью SDS-PAGE и один 1 мм полоса может быть электроннойxcised и проанализированы. Это очищает сложную смесь любых гранул или частиц, которые будут мешать анализу.

Для того, чтобы подчеркнуть полезность этой системы, открытой рамки считывания (ORF) , связывающего белка тау микротрубочек клонировали в челночный вектор путем амплификации Tau ORF с использованием праймеров , содержащих attB1 и attB2 участки (таблица 1) , и инкубацию продуктов ПЦР с помощью челночный вектор и рекомбиназа, который опосредует вставки ПЦР-продуктов в челночный вектор. Продукты реакции использовали для трансформации DH5 & alpha ; бактерии 13 и плазмидной ДНК из колоний , устойчивых к канамицину был секвенирован , чтобы обеспечить вставку тау. Последовательность подтверждено шатл-тау вектор был затем использован для передачи Tau ORF в вектор pGLAP1, который плавленого Tau в рамке с LAP (EGFP-ТРВ-S-белка) тегов, путем инкубирования челночный вектор-тау с вектором pGLAP1 и рекомбиназа, который опосредует передачу ORF из челночного вектора до pGLAP1. Продукты реакции использовали для трансформации DH5 & alpha; бактерии13 и плазмидной ДНК из колоний , устойчивых к ампициллину , секвенировали , чтобы гарантировать , что слитый LAP-тау был в кадре. Последовательность подтверждено pGLAP1-LAP-Tau затем котрансфицируют с вектором, выражающего флиппазы рекомбинации фермента в клетках НЕК293, содержащий мишень одного распознавания флиппазы (FRT) сайта в их геном, который является местом интеграции для LAP-меченый генов 14. Эта клеточная линия также выразил тетр, который связывается с операторами Tet перед Поясной-меченый генов и заглушает их экспрессию в отсутствие Tet / Dox. Стабильные интегранты были выбраны с -Tet DMEM / F12 среде с 100 мкг / мл гигромицина в течение 5 дней. Отдельные гигромицину, фокусы устойчивые клеточные собирали путем добавления 20 мкл трипсина на верхней и пипетированием вверх и вниз 2 раза. Клетки были помещены в 24-луночный планшет и расширена за счет непрерывного роста в -Tet DMEM / F12 средах.

Для того, чтобы проверить, что клетки резистентной к гигромицинуs были способны выражать LAP-тау, HEK293 LAP-Tau клетки индуцируют 0,1 мкг / мл Dox в течение 15 ч и белковые экстракты получают из неиндуцированной и DOX-индуцированных клеток. Эти экстракты разделяли с помощью SDS-PAGE, переносили на PVDF-мембрану и иммуноблоттинг для GFP и тубулина в качестве контроля нагрузки. Как видно на рисунке 4A, LAP-тау (визуализировали с помощью анти-GFP антител) была выражена только в присутствии Dox. Для того, чтобы подтвердить , что LAP-тау был должным образом локализованы в митотических микротрубочек веретена в митозе, как это было ранее показано на эндогенный Tau 18, клетки НЕК293 LAP-тау индуцировали с помощью 0,1 мкг / мл Dox в течение 15 часов и клетки фиксировали 4% параформальдегидную совместно окрашивали ДНК (Hoechst 33342) и микротрубочек (анти-тубулина антителами). Последовательно, LAP-тау был локализован в митотического веретена во время метафазы митоза (рис 4В). Для того, чтобы убедиться, что LAP-Тау и ее взаимодействующих белков может быть очищен с этим SYSTEM, НЕК293 LAP-Tau-клетки культивируют в роллер-флаконах до ~ 70% сплошности, индуцированный с 0,1 мкг / мл Dox в течение 15 часов, собирали путем перемешивания, лизируют с буфером LAP300, и LAP-тау был очищен с использованием вышеуказанного протокола. Элюаты от очистки LAP-тау были решены с помощью SDS-PAGE и гель окрашивали серебра. Рисунок 4C показывает очистку LAP-тау, отмеченные звездочкой является LAP-тау и несколько других групп свидетельствуют о Tau взаимодействующих белков можно увидеть.

Рисунок 1: Обзор поколения LAP-меченый Индуцибельные Стабильные клеточные линии для любого интересующего белка. Открытая рамка считывания (ORF), из представляющих интерес генов амплифицируют с attB1 и attB2 сайтов, фланкирующих 5'- и 3'-конец последовательности, соответственно (последовательности праймеров приведены в Таблица 1) и клонировали в шаттл вектор. Последовательность проверяли челночные векторы с интересующим геном, затем используются для передачи интересующего гена в вектор pGLAP1. Последовательность проверяли pGLAP1 вектор с интересующего гена затем котрансфицируют с вектором, содержащим флиппазы рекомбиназу в желаемую клеточную линию, которая содержит цель одного распознавания флиппазы (FRT) сайта в их геном, который является местом интеграции для LAP -tagged генов. Эти клеточные линии также выражают Tet репрессор (тетр) , который связывается с операторами Tet (Teto 2) вверх по течению от LAP-меченый генов и заглушает их экспрессию в отсутствие Tet / Dox. Поясной-меченый интерес ген затем рекомбинируют в сайт FRT и стабильные интегранты выбираются с использованием гигромицина. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg "/>
Рисунок 2: Обзор приложений для LAP-меченый стабильных клеточных линий. LAP-меченый индуцируемые стабильные клеточные линии, которые индуцируют экспрессию Поясной-меченый белок, представляющий интерес путем Dox добавления и может быть синхронизирована на разных стадиях клеточного цикла или могут быть стимулированы с химическими веществами или лигандами, чтобы активировать любой желаемой пути передачи сигнала. Субклеточном локализации LAP-меченого белка, представляющего интерес можно анализировать с помощью живой клетки или визуализации фиксированной ячейки. LAP-меченных белков также может быть тандем аффинно очищенные и взаимодействующими белки могут быть идентифицированы с помощью жидкостной хроматографии тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS). И, наконец, Cytoscape может быть использован для создания сети белок-белковое взаимодействие белка приманки. Dox указывает доксициклина, IP указывает иммунопреципитации, EGFP указывает на усиленный зеленый флуоресцентный белок, Тев указывает сайт расщепления TEV протеазы, а S обозначает S-тег.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Обзор LAP-меченый экспрессии белка, очистки и подготовки к масс - спектрометрии. Протокол состоит из 9 этапов: 1) рост и индукции экспрессии белка LAP-меченый, 2) сбор клеток и лизис, 3) подготовка лизатов, 4) связывание лизатов с анти-GFP бусин, 5) TEV протеазы расщепление GFP-тег, 6) связывание лизатов с S-белковых шариков, 7) вымывание белка приманки и взаимодействующих белков и 8-9) подготовки образцов для масс-спектрометрии на основе протеомных анализов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Проверка экспрессии LAP-тау. (A) Вестерн - блот (ВБ) Анализ образцов белка из неиндуцированной и Dox индуцированных клеток LAP-тау НЕК293 зондировали с анти-GFP и анти-тубулина антител для обнаружения LAP-меченый тау - белка и контроль Tubulin нагрузки, соответственно. Обратите внимание, что LAP-тау выражается только тогда, когда клетки индуцировали Dox. Клетки (B) митоза , выражающие LAP-Tau фиксировали и окрашивали совместно для ДНК (Hoechst 33342) и тубулина (ванна) с анти-тубулина антителами и субклеточном локализации LAP-тау анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Обратите внимание, что LAP-тау локализуется в митотического веретена и шпинделя полюсов во время митоза. (C) Серебро окрашивали гель очистки LAP-тау. MW обозначает молекулярную массу, CL показывает освобоженные лизатов и Е INDICATES окончательные элюатов. Образцы прогоняли на 4-20% SDS-PAGE, и гель окрашивали серебро, чтобы визуализировать очищенные протеины. Обратите внимание, что полоса, соответствующая LAP-тау отмечен звездочкой и ряда других полос, соответствующих совместно очистки белков можно увидеть. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

N-концевой слитый
Вперед	5'- GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (> 18gsn) -3 '
Задний ход	5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - (> 18gsn) -3 '
C-концевой слитый
Вперед	5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (> 18gsn) -3 '
Задний ход	5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (> 18gsn) -3 '

Таблица 1: прямого и обратного праймеров для амплификации ORF , или интереса для вставки в Shuttle Vector. Участки attB выделены жирным шрифтом, GSN означает, что более чем 18 генов специфические нуклеотиды добавляются к грунтовке.

шаг	температура	Время
Первоначальная денатурация	94 ° C	2 мин
Циклы ПЦР-амплификации (35)	денатурировать	94 ° C	30 сек
отжигать	55 ° C (в зависимости от праймера Tm)	30 сек
простираться	72 ° C	1 мин / кб
Держать	4 ° C	на неопределенное время

Таблица 2: условия ПЦР для амплификации ORF , представляющих интерес.

Вектор	Форвард Секвенирование Primer	Обратный секвенирования Primer
Трансфер Вектор	5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 '	5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 '

Таблица 3: в прямом и обратном праймеры для секвенирования для Shuttle Vector.

Я БЫ	Состав	родительский	Промоутер	Bac Res	Мам Res	Tet рег?
pGLAP1	N-термин EGFP-ТРВ-S пептид	pcDNA5 / FRT / TO	ЦМВ	ампер	Hyg	да
pGLAP2	N-термин Flag-ТРВ-S пептид	pcDNA5 / FRT / TO	ЦМВ	ампер	Hyg	да
pGLAP3	N-термин EGFP-ТРВ-S пептид; C перспективе V5	pEF5 / FRT-V5	EF1a	ампер	Hyg	Нет
pGLAP4	N-термин Flag-ТРВ-S пептид; ; C перспективе V5	pEF5 / FRT-V5	EF1a		Hyg	Нет
pGLAP5	C-S Термин пептид-PreProt x2-EGFP	pEF5 / FRT-V5	EF1a	ампер	Hyg	Нет

Таблица 4: Список доступных LAP / TAP векторов с переменными промоутеры, эпитоп-теги и Dox индуцируемой экспрессии Возможности для N или С-концевого белка Tagging. Векторы являются коммерчески доступными. Bac Res указывает маркер устойчивости к бактериальным, Мам Res указывает маркер устойчивости клеток млекопитающих, Tet рег? указывает, является ли выражение Tet / Dox регулируемую.

Вектор	Форвард Секвенирование Primer	Обратный секвенирования Primer
pGLAP1	5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 '	5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 '
pGLAP2	5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 '	5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 '
pGLAP3	5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 '	5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 '
pGLAP4	5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 '	5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 '
pGLAP5	5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 '	5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 '

Таблица 5: в прямом и обратном праймеры для секвенирования для pGLAP векторов.

Авторам нечего раскрывать.