Модифицированный MicroSecure Витрификация: Безопасный, простой и очень эффективная процедура криоконсервации для человека бластоцисты

Summary

MicroSecure Vitrification была разработана как некоммерческая, асептическая система закрытого витрификации, которая соответствует передовым производственным и тканевым практикам FDA. В связи с изъятием гидрофобных засоренных соломинок для эмбрионов из промышленности, процедура витрификации была изменена, чтобы включить внутреннее уплотнение перед стандартной внутренней хлопчатобумажной пробкой.

Abstract

Клинический эмбрион витрификация эволюционировали с развитием уникальных витрификационные устройств в 21 - ^м веке , и с неправильным представлением , что ультра-быстрое охлаждение в «открытой» системы (т.е. прямой LN ₂ контакта) была необходимость оптимизации успеха витрификации. Догма окружающих важность скорости охлаждения привели к небезопасной практики , подлежащих техническому изменению и созданию витрификационные устройств , которые игнорировали важные факторы контроля качества (например, простота использования, воспроизводимости, надежности, безопасности , маркировки и безопасности хранения). Понимание контроля качества недостатки других устройств, разрешенных для разработки безопасной, надежной, повторяемые, и надежный метод мкСм-ВТФ по минимизации внутри- и меж-техник вариации. Не менее важно, что в сочетании наличие двух существующих FDA-совместимых устройств: 1) 0,3 мл Иономерный смолы эмбриона солому с интернализованной, двойного цвета, защищенные от несанкционированного вмешательства рмаркировка крыши с повторяемой уплотнением сварного шва потенциала; и 2) сокращен, широко используемый, 300 мкм ID стерильными flexipettes для непосредственной загрузки эмбриона (ов) для того, чтобы создать высоко эффективного глобального устройства витрификации. Как и другие асептические, закрытые витрификационные системы (например, с высокой степенью безопасности Витрификация (HSV), Rapid-я и VitriSafe) эффективно используется в репродуктивной медицине, microSecure Витрификация (мкСм-ВТФ) доказала , что она может добиться высокой выживаемости после потепления и беременность результаты с его вниманием к простоте, а также снижение технических вариаций. Хотя эмбрион соломы 0,3 мл, содержащий внутренний гидрофобный пробку коммерчески заменен стандартным сперме соломы, обладающей хлопковое поливинилпирролидон (PVP) пробки, она сохраняет свою Иономерный композицию смолы, чтобы обеспечить герметизацию шва. Тем не менее, ватные пробки могут фитиль из содержания жидкости эмбриона flexipettes при контакте. Модифицированный метод мкСм-VTF был адаптирован для включения дополнительного внутреннего сварного швауплотнение перед штекером на стороне загрузки устройства. Добавил технический шаг к процедуре мкСм-VTF не повлияло на его успешное применение, так как высокие показатели выживаемости (> 95%), а также показатели беременности продолжаются и сегодня.

Introduction

Витрификация является единственным наиболее эффектных вспомогательных репродуктивных технологий в промышленности экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) , так как развитие интрацитоплазматической инъекции спермы. Сегодня бластоцисты замораживают без потери жизнеспособности эмбрионов , которые были связаны с традиционными методами медленного замораживания ^1. С надежным выживания эмбриона после потепления, бесплодие промышленность превращается предпочтительного использования криоконсервированных циклов переноса эмбриона, которые дают аналогичные или более высокие исходы беременности, чем традиционные свежие переноса эмбриона. В связи с бластоцисты биопсии и предимплантационной генетического скрининга (PGS), витрификация стала жизненно важным клиническим инструментом для оптимизации результатов здоровых живых родов с помощью эуплоидных одного переноса эмбрионов ^{2, 3.}

Мышиный эмбрион витрификация был разработан в середине 1980-х годов ^{4, 5} и приспособленный для животных сельского хозяйства к 1990 году ^6. Исходя из того, что витрификационные растворы образуют метастабильное glasseous состояние, свободное от повреждения образование кристаллов льда, оказалось более эффективно сохранить полную клеточную целостность эмбрионов. Интересно отметить , что многообещающая принятие витрификации в человеческой эмбриологии не начинал реализовываться до 21 - ^го века. Ранние издания , пропагандирующие использование витрификации совпало с развитием уникальных "открытых" системных устройств ^{7, 8, 9.} Тем не менее, принятие витрификации в клиническую практику был медленным, как это произошло в тот момент, когда улучшение медленного замораживания бластоцисты также происходит. Успешное обычное замораживание медленно скорость, в дополнение к витрификации, были приведены в соответствие с улучшением систем культивирования эмбрионов, а также с состав вошлоион бластоцель сворачивания подходов, что позволило повысить как общую выживаемость трофэктодерме и, впоследствии, имплантация ^10.

В последнее десятилетие, витрификация технология быстро вытеснила традиционные методы замораживания. В значительной степени это было связано с развитием специализированных устройств витрификационные. Некоторые из этих устройств имеют инвалидность общую безопасность, эффективность и эффективность клинической витрификации путем введения присущие недостатки конструкции к устройствам , используемым в IVF промышленности ^11. Действительно, нюансы различных устройств вносят существенные технические различия между программами, обычно называемых "технических подписей" ^12. Таким образом, научные журналы, как журнал визуализированных экспериментов (Jove), могут служить ценным ресурсом для демонстрации технических деталей, которые помогут снизить вариации исхода. Еще одна постоянная проблема в том, что Sекоторые эмбриологи продолжают дезинформировали, даже сегодня, на основе требований о том , что "ультра-быстрое охлаждение эмбрионов или ооцитов в« открытой системе витрификационным '(то есть, прямой эмбрион контакт с жидким азотом (LN ₂₎₎ является необходимым условием для оптимизации процент успеха ". Очевидно, что эта вера является неточной, основанная на проверенном успехе асептических закрытые системы ^{13, 14, 15.}

На основе принципов криобиологические витрифицирующегося, эффективность витрификации является более значительной степени зависит от темпов потепления , чем на скорости охлаждения ^{16, 17, 18.} В общем случае, зависит от устройства, используемого витрификации, скорость потепления должна превышать скорость охлаждения, чтобы обеспечить высокие показатели выживаемости. Высокие темпы потепления свести к минимуму возможность любого нарастания льда (т.е. Кекрystallization ядросодержащих примесей в крио-растворах) во время фазы расстекловывания потепления. Конечно, стабильность раствора витрификационным (т.е. тип и концентрацию криопротекторов используемых) , могут иметь Поразительным эффект, но это рассматривается в качестве отдельной публикации ^11. Учитывая проблемы охлаждения потепления скорости, MicroSecure витрификации (мкСм-VTF) был разработан в 2008 году в качестве недорогого, некоммерческого, FDA-совместимый метод, который оптимизировал контроля качества аспекты витрификации. Он был уникален тем, что он предложил НСД-доказательство, интернализированную, двойной цветной маркировки. Кроме того, путем загрузки и хранения эмбрионов непосредственно в стерильной flexipette , используемой для пипеткой (т.е. без пипеткой на вторичной поверхности устройства) и с помощью Иономерный-смолы соломинки , которая полностью сварной уплотнение с использованием автоматизированного герметиком, техническое изменение было фактически устранено.

При оценке грompleteness витрифицирующегося устройств для возможного использования, существует несколько факторов контроля качества , которые должны быть приняты во внимание, в том числе: 1) обозначая потенциальные -Может этикетки быть надежно привязаны? Являются ли они устойчивости к внешним воздействиям? Они предлагают двухцветными идентификационный потенциал? Требует ли это вторичный ярлык, и может этикетка легко снимается для целей учета (т.е. пациента проверка) после потепления? 2) Техническая простота -Может эмбрионы быть легко загружены в / на устройство своевременно и просто идентифицировать и проследить пост-потепление? 3) Процедурный простота / Повторяемость -Does метод витрификации предложение простоту и надежность , что позволяет легко для воспроизводимости, что сводит к минимуму различия между техниками (внутренних) и программ (внешние)? 4) LN ₂ емкость запоминающего устройства -Can устройства легко и безопасно обработаны и идентифицированы? Является ли их STOбушевать потенциальное пространство эффективно? Имеет ли устройство обеспечить безопасность и безопасность от физического повреждения или возможных загрязнителей в качестве асептической замкнутой системы? 5) потенциал восстановления / живучести -Это дизайн устройства склонны к потенциальным проблемам гарантированного восстановления эмбрионов, и они будут надежно остекловывать и поддерживать полную клеточную целостность после новоселье? Последнее качество конкретных озабоченность, скорость восстановления, на самом деле было неожиданно сведено к минимуму в опубликованных отчетах; это делается как правило , скрывается неблагоприятный исход (т.е. потерянная эмбриона или яйцо) в типично хорошие показатели выживаемости. Любое устройство, склонным к несовместимым восстановления (<99%) серьезно испорчено и представляет собой процессуальную ответственность.

Наш асептический, закрытый метод мкСм-VTF был стратегически разработан для учета каждой меры контроля качества. Тем не менее, после 5 лет высшего клинического успеха и проверки ^14, процедура была тO быть изменен. Исходные 0,3 мл эмбрион соломки (обладающих гидрофобной штекером) были удалены из IVF промышленности и заменен на 0,3-мл семенной жидкости соломы , обладающей стандартный хлопок / PVP пробки (т.е. перемаркированные в качестве семенной жидкости / эмбрионов соломы). Это процедурное документе излагаются конкретные шаги и стратегии, необходимые для безопасного, просто и эффективно осуществлять мкСм-VTF. Кроме того, мы не выделили модификации (ы), необходимые для надежного учета ограничений поставок, до тех пор, как альтернативный идеальный контейнер соломы вновь вводится обратно в клинической лаборатории.

Protocol

Разработка процедуры мкСм-ВТФ была проведена в рамках утвержден Совет Обзор Институциональный (IRB) исследования в 2008-2009 годах (Aspire IRB, Санти, Калифорния) на человека ооцитов и эмбрионов криоконсервации. Процедура с тех пор была обычно применяется для клинического лечения больных бесплодием, подписавшего формы информированного согласия.

1. Соображения по контролю качества

1. Используйте различные цвета (например, ручки, наклейки, или идентификации (ID) стержни или втулки) , чтобы отличить пациентов , если криоконсервировать более одной группы эмбрионов в день.
2. Используйте различные блюда и пипетки для каждого пациента. Минимизировать объем среды передаваемого при перемещении бластоцист от одного решения к другому.
3. Криоконсервируют один бластоцисты за соломинку или устройства. Поддержание асептических / стерильной техники и соблюдать все меры предосторожности.
4. Подтвердить Реферальную Форму врачей »и подписали согласие пациента до initiatinг процедуры. Проверьте расположение эмбриона пациентов (ы) в инвентарь.
5. Используйте "Освобождение от ответственности и согласия для транспорта", если бластоцисты должны быть переведены на другой объект. Убедитесь в том, что все подписи засвидетельствованы на месте или удостоверена нотариально.
6. Подтвердите надлежащие меры контроля качества для среды и белковые добавки, в зависимости от обстоятельств, в том числе биопроб, определения эндотоксинов и истечения срока действия / верификации номер партии и отслеживания.
7. Установление критических пределов (т.е. низкий уровень беспокойства) для клинического мониторинга результатов криоконсервации и оценки, такие как темпы восстановления: <95%, уровень выживаемости: <80%, а также клинических показателей беременности с использованием однослойные эуплоидных бластоцисты: <50%.

2. Процедура криоконсервации

1. подготовка
   1. Заполните соответствующие документы, в том числе ввод данных в рабочие листы и базы данных криоконсервации и журнал инвентаризации(Ов).
   2. Подготовить свежие решения криоконсервации или использовать коммерческий источник (Придерживаясь рекомендованной заводом-изготовителем для хранения и сроком годности условий).
   3. Подготовка соломы.
      1. Откройте маркировки сторону индивидуализированных стерильных пакетов. Отделить заправочной сопло найденное на традиционном 0,3 мл эмбрионов соломы, держа его от упаковки и частично подъема и потянув за соломинку из; это будет подвергать конец этикетки к условиям окружающей среды в то время как солома лежит асептических внутри пластикового пакета.
         1. (Модификация) Для 0,3-мл спермы / эмбрионов соломкой, вставьте вилку вниз на 0,5 см. Нанесите внутреннюю прокладку перед хлопковое PVP пробки за счет использования основного столешница импульсного уплотнителя.
         2. Установите солому на поверхность тефлоновой электрода, только в передней части штекера. Выжмите ручку, чтобы активировать тепло. Отпустите ручку, когда появится красный свет. Для того, чтобы обеспечить полную герметизацию сварного шва, нагревают при температуре, которая достаточно flatteнс противоположные поверхности, а затем перевернуть его на 180 ° и запечатать противоположной поверхности ¹⁹ по мере необходимости.
   4. Использование cryomarker, маркировать каждую соломенную / устройство и cryogoblet с именем пациента, уникальный идентификационный номер (например, SSN, DOB, или пациента идентификационный номер), а также дату замораживания. Кроме того, включать уникальный номер на каждом соломенной / устройства (например, 1, 2, 3 и т.д.).
      1. Закрепите этикетку (желательно цветной) на цветном-взвешенный ID стержня должен быть вставлен и запечатаны в эмбрион соломы 0,3 мл. возвращения соломы с его индивидуальной стерильной упаковке до использования.
         Примечание: Если только 30-мм Цвет-взвешенный ID стержни доступны, то дополнительное введение двух шариковых подшипников необходимо, по соседству с каждой стороны ID стержня.
   5. Обозначьте каждую трость с уникальным идентификационным номером вписанного. Определить LN ₂ хранения номер танка и ряд канистру , где образец (ы) каждого пациента может быть улицаORed в долгосрочной перспективе.
   6. Подготовить свежие крио блюда (100 мм), маркируя нижнюю поверхность с именем пациента, ID решения и эмбриона / удержание капель ID (рисунок 1А). В частности, созданы 4 ряда капель: изотонический HEPES-забуференной среде (вверху), V1 (уравновешивающий раствор (ES)), V2 (промежуточное решение (IS)), V3 (витрификации решение (VS); внизу). Написать эмбриона ID на верхней правой стороне с мечеными колоннами.
      Примечание: Серия 25- до 50-мкл промывочного капли (п = 3) используется для того , чтобы каждый отдельный окончательный 10- до 15-мкл / холдинг капельного типа раствора (т.е., V1, V2, V3 или) чист и неразбавленным. Используя этот подход, до пяти отдельных эмбрионов может с помощью остекловано с использованием одного блюда. Держите каждое блюдо покрыта, когда он не используется, чтобы избежать каких-либо комнатной температуры испарения / обезвоживания капель.
   7. Готовят стерильные flexipettes резанием 3 см от их базового конца (именуемые "VTF советы"). Вставьте их на отдельныеПипетки (установлена в 3 мкл) и установите пипеток-ВТФ советы вертикально в пенопласт трубы стойки (рис 1B).
2. Выбор Эмбрион
   1. Подтверждение пациента / идентификации образца.
   2. С помощью инвертированного микроскопа (200 - 400X увеличение), класс и классифицировать бластоцист в соответствии с системой ²⁰ классификации Гарднера, с использованием числовой классификации 1 до 6 для рано вылупившихся бластоцист, соответственно, и А, В, или сорт С назначен к внутренней клеточной массы (ICM) и трофэктодерме (TE).
      Примечание: В рамках подготовки к бластоцисты биопсии и euploidy анализа, пеллюцида предварительно вылупились методом лазерной абляции на 3 -й день , чтобы способствовать скорейшему грыжа ТЕ и , следовательно , требует модифицированной классификации классификации ^2. Короче говоря, класс 3 полная бластоцисты выставляется до 10% TE грыжей, 4 класс расширен бластоцисты 10 - 50% вылупились, и 5-го класса инкубационные бластоцисты имеют> 50% TE extrusioн (фиг.2А-С).
      Примечание: Мы предпочитаем криоконсервируют класса 3 или более высокие бластоцисты качества ≥BB в день 5 или 6. Тем не менее, остеклованные бластоцисты более низкого качества (С) и после уплотнению эмбрионов на ранних стадиях ( в том числе и поздней морулы до класса 1 или 2 бластоцисты ), безусловно, может выжить потепление полностью нетронутыми и дают жизнеспособных эмбрионов, способных достигать живорожденных.
   3. Свертывание бластоцель каждого бластоцисты до начала процесса cryodilution путем micropuncturing с трофэктодерме стык или путем проведения лазерного импульса абляция trophectodermal элемента ²¹ при использовании витрификационные растворы с низким молярность (<6,5 М или 40% об / об).
      Примечание: Необходимость свернуть бластоцисты не зависит от устройства. В нашем раннем развитии мкСм-VTF (2008), мы первоначально использовали этиленгликоль (ЭГ) / успешно растворах ДМСО с ооцитов (1 из 1 доношенной беременности), но неоптимальной (<80%)выживание / развитие бластоцисты мыши ¹⁶ испытывали другие ^21. Поскольку высокие молярные глицерина на основе растворов (более 7,9 м) используются в нашей нынешней системе ВТФ (с 2009 года), физическое разрушение бластоцель является ненужным. Однако избирательное штриховкой вылупившихся бластоцист рекомендуется в целом.
3. Cryodilution и Бластоциста Загрузка
   1. Удалите культуры блюдо пациента из инкубатора и подтвердить идентификацию пациента / образец с другим человеком (то есть, засвидетельствовано вторичного источника) перед удалением эмбриона (ов) , чтобы быть витрифицированном.
   2. Подтвердите развитие бластоцисты за шагом 2.2.2, обновить данные листа крио, и под стереомикроскопии, пипетка бластоцисты (s) из культуры блюдо в изотоническом удерживающей капелькой крио блюдо.
   3. Перемещение каждого бластоцисты на отдельные капли с использованием удерживающих застеклова- flexipette (т.е. ПТФ TIP).
   4. Перемещение каждогобластоцисты в раствор V1 (ES).
      1. Предварительного заполнения поля flexipette раствором V1 (3 мкл) и поместите половину содержимого на эмбрион.
      2. Аспирируйте эмбриона и перейти к первому из трех V1 промывки капель (указанные в пункте 2.1.6), пипеткой эмбриона 2 - 3 раза по всему периметру, а также очистить содержимое пипетки в капле (избегая образования пузырьков) или снаружи на блюдо поверхность.
   5. Заполните кончик VTF со следующей капли V1 помыть и повторить стремление эмбриона (ов). Повторите третий раз и переместите бластоцисты (ы) для отдельной капли выдержки V1. Стадии разбавления / мытья должна занять от 30 до 45 сек. Предварительная нагрузка каждый ПТФ наконечник со следующим раствором (например, V2), вставьте пипетку в стойку, и используйте следующую пипетку ( в соответствии с настройкой на этапе 2.1.7) (Рисунок 1В).
      Примечание: Поскольку общее время экспозиции в непромышленной диметилсульфоксиде (ДМСО) , содержащей V1 и V2 решений 5 мин каждый, то пипеткой из Indiviдвойные бластоцисты должны быть равномерно в шахматном порядке в пределах этого интервала, считая, что последний шаг V3 потребуется, по крайней мере, 1 мин на бластоцисты для выполнения. Например, если есть 4 бластоцисты в витрификационным группе, пипеткой бластоцисты # 1-2-3-4 с интервалом 75-х годов.
      Примечание: Инновационная Крио Enterprises (ICE) протокол разведения , описанный выше, явно отличается от большинства других процедур коммерческого витрификационные, которые обычно включают ДМСО-растворы , содержащие. Эти протоколы достичь тех же скачкообразные разведений путем постепенного, но менее контролируемое слияние промывочного раствора (т.е. изотонической среде), ES и VS.
   6. Повторите шаги 2.3.4 и 2.3.5 с использованием V2 (IS) решения.
   7. Повторите шаги решения 2.3.4 и 2.3.5 с помощью V3 (VS).
   8. При размещении каждого бластоцисты в V3 проведение капельке, очистить остаточный раствор и пузырьки с кончика VTF (за пределами капельке), а затем полностью заполнить наконечник с чистой V3 вокруг зародыша. Expэль примерно одну треть от объема (1 мкл) и пипетку бластоцисты (ы) и оставшийся V3 полностью в наконечник VTF.
   9. Извлеките наконечник VTF из пипетки, протереть наконечник сухой остаточной V3 на внешней поверхности с помощью стерильной марлевой подушечки, и вставьте наконечник конца сначала в открытый конец предварительно меченных соломы. «Сухой наконечник" имеет решающее значение для предотвращения возможного присоединения внутренней соломы.
   10. Обратить соломы (этикетка концом вниз), обратите внимание на кончик на внутренней пробкой или уплотнением, и надежно запечатать открытый конец с 1 см воздушного пространства. Предпочтительно использовать автоматическое устройство запечатывания (например, Syms I) , чтобы устранить технические изменения.
       Примечание: Преимущество использования соломинки, которые состоят из иономерному пластика смолы (например, HSV или мкСм-VTF) является то , что с помощью любого правильно ПРИВОДОМ термосваривающих устройство создает надежную "Welding" уплотнение, как отмечено на этапе 2.1.3.1.
   11. После того, как запечатанный, погрузить закрытую солому прямо в LN ₂ в из неESS стальной сосуд Дьюара и поместить солому (ы) в открытом кубке, прикрепленной к трости пациента для хранения.
       Примечание: Поскольку мкСм-VTF соломки используют 40-мм утяжеленные ID пруты , чтобы компенсировать плавучесть заполненных воздухом соломы, использование перевернутых бокалов или пустых криопробирок для покрытия образца (ов) не требуется , если перевозка не участвует.
4. Потепление и крио-решение Элюирование / Разбавление
   1. Подтвердить Реферальную форму врачей " в отношении остеклованных день переноса эмбрионов, запланированное время и детали эмбриона (число оттаивать / передача, специальный номер эмбриона , если PGS испытания и т.д.).
   2. Подготовить свежие решения потепления (1,0 М сахарозы основной раствор) и / или использовать коммерческий источник (рекомендуется 1 неделю-1 месяц срока годности при хранении раз в использовании, 4 ° C хранения).
      1. Алиготе 17,1 г сахарозы в 50 мл стерильные колбы при первоначальной открытия (например, еженедельно источника питания) в связи с риском накопления эндотоксина в ГРА сахарозыNules при повторном воздействии окружающей среды.
      2. Смешать предварительно взвешенное гранулированный сахарозы в раствор (1,0 М маточного = 3,42 г / 10 мл HEPES забуференного маточных жидкости человека [Н-HTF]) и нагревают раствор до 37 ° С, чтобы повысить растворимость гранул. Несколько раз переверните контейнер, чтобы ускорить и завершить окончательное смешивание.
         Примечание: фильтрация (фильтр 0,22 мкм) выполняется с использованием положительных единиц фильтрации под давлением рекомендуется для вязких растворов (> 0,5 М сахарозы) или больших объемах. насосы высокого давления для рук достаточно и недорогой, в то время как электрический насос шумит, вызывает вибрации, и просто не требуется.
   3. Теплый (37 ° C), один 10-мл пробирку каждого из 1,0 М раствора сахарозы и Н-HTF среды на пациента мкСм-VTF использования в теплую погоду ванны.
   4. Подготовить свежие блюда размораживать (6-луночный планшет) путем маркировки поверхности крышки с именем пациента и идентификаторы решений.
      Примечание: В данном случае мы использовали: (1) Мытье T1 (200 мкм; L без масла накладкой, (2) Т1 (100 мкл) с 1 мл масла, (3) Т2 (100 мкл) с маслом, (4) Т3 (100 мкл) с маслом, (5) Т4 (100 мкл) с маслом, и (6) T5 / 200 мкл изотонические HEPES-забуференной среде с 10% человеческого сывороточного альбумина (HSA) или 20% сыворотки замены без копчиковой накладкой. Нанесите универсальный раствор сахарозы понижающий протокол-Т1 = 1,0 М, Т2 = 0,5 М, Т3 = 0,25 М, и Т4 = 0,125 М-если лед или другой коммерческий источник не доступен, как это было предложено для медленно замороженных эмбрионов ²² , Кроме того, обратите внимание, что начальное мытье Т1 и конечные T5 equilibrations могут быть выполнены в 30-мм чашках Петри и блюдо 4-хорошо используется для этапов 2-5 выше, с участием масляный слой.
   5. Оттепель эмбриона (ов) только одного пациента одновременно.
      1. Проверьте Реферальную Форму врачей »и подтвердить цикл до прогрева указанное число (например, 1 или 2 бластоцисты); оценки выживаемости / вероятной жизнеспособности путем наблюдения осмотические изменения (т.е. SHRinkage и регидратация) и интактные мембраны, и, если под вопросом, обратитесь к врачу и / или пациента перед разогревом другой бластоцисты.
   6. Подтвердите идентификацию пациента / образец с сотрудником (т.е., свидетельствует вторичного источника).
   7. Поместите трость пациента в сосуд Дьюара , заполненного LN ₂ и изолируют идентифицировать солому прогреть.
   8. Доведите 6-луночного разведение блюдо в центре сцены стереомикроскопа. Размещение блюдо 60-мм чашки в одну сторону (то есть, в зависимости от левой или правой предпочтения техник), добавьте подогретое сахарозы (1,0 М) и Н-HTF решения для создания потепления 0,5 М сахарозы ванна (непокрытый).
      Примечание: VTF советы подогреваются только в 0,5 М растворов сахарозы в качестве защитной меры контроля качества, чтобы гарантировать сохранение жизнеспособности эмбрионов в редких случаях, когда эмбрион выталкивается при быстром нагревании ^22.
   9. Держите верхнее уплотнение соломенную над уровнем жидкостидля подтверждения личности, а затем захватите и закрепите солому ниже внутренней пробки , используя ножницы Майо (кончик ПТФ еще должен быть погружен в LN _2).
      1. Постукиванием ножницы на сосуд Дьюара (пару раз), чтобы снять наконечник VTF от внутренней боковой стенки соломы в качестве меры предосторожности QC; если ПТФ наконечник единомышленником, постукивание гарантирует, что основание наконечника падает до запечатанного конца противоположной меченого конца, обеспечивая тем самым воздушное пространство вблизи конца пробки.
   10. Поднимите соломинку с ножницами в атмосферный воздух в горизонтальном положении (рядом или под поверхностью стереоскоп) и понять немеченого конец (ярлык с правой стороны). Разрежьте соломы на внутренней пробки или уплотнения и поднимите ее над грея ванны блюдо. Налейте кончик VTF в теплую ванну сахарозы под углом 60 ° до тех пор, пока она полностью экструдированный и быстро прогрет (> 6000 ° С / мин); основание flexipette будет лежать выше тарелки боковой стенки.
       1. Разрешить VTF тир для свободного падения в ванну. Аккуратно нажмите на верхнюю поверхность соломенной если кончик не сразу появляются. Если он появляется только часть пути, помочь в экструзии, взявшись за вал flexipette с ножницами или тонким пинцетом.
   11. Через 5 - 10 секунд, возьмите пипетку базу и вставить в одноразовое устройство пипетирования; отверстие в колбе действует для сброса давления при введении. Закройте отверстие колбы с указательным пальцем и осторожно сожмите, чтобы освободить остеклованных бластоцисты в стирке T1 (# 1) во время просмотра с помощью стереомикроскопии. После подтверждения очистки раствора и пузырьков остаточного V3 (VS) с положительным давлением, эвакуируют содержимое в центр, не использовался Отклон хорошо. Пуск 5-мин таймер.
       Примечание: Все сахарозы стадиях растворения проводят при комнатной температуре (21 ± 2 ° C).
   12. Удалить VTF наконечник и поместите его на пипетку. Продолжить путем перемещения эмбриона в T1 # 2 в масле в течение оставшегося времени (примерно 3 - 4 мин). <ол>
   13. Если второй бластоцисты требуется для передачи, немедленно согреть вторую соломинку и VTF наконечник (повторив шаги 2.4.9 - 2.4.11) от пациента до начала стадии 2.4.12. Переместить обе бластоцисты вместе в течение минимального элюирования в T1 (1,0 М раствором сахарозы), по меньшей мере, 3 мин.
5. Предварительно заполнить flexipette со следующим раствором, а затем перейти и разбавьте бластоцисты (ы) в T2, T3, T4 и с интервалом в 3-х мин. Если пеллюцида не ранее лазера абляции (т.е., заштрихованы), сделать это в T4. Поместите блюдо на сцену инвертированного микроскопа и изображения эмбриона на мониторе компьютера. Совместите опоясывающий в пределах обозначенного красным кружком и активировать 2 или 3 импульсов лазерного диода (начало на краю перивителлинового пространства и перемещаются наружу) , чтобы создать отверстие ^{2, 19.}
6. Равновесие бластоцисты в Т5 (то есть, изотонический среда) в течение 5 мин на теплую поверхность (37 ° C).
7. Оценка первоначальной выживаемости эмбрионов, основанный на преобладающем присутствии интактных клеточных мембран с даже, полупрозрачный цитоплазм лишенные пикнотическими потемнения. Поместите эмбрион (ы) в культуре в течение 2 - 6 часов до переноса эмбриона, в какое время, развитие эмбриона / выживаемость должна быть повторно оценена и документирована.
   Примечание: Если более 1 жизнеспособным бластоцисты существует в момент передачи и пациент предпочитает действовать только с 1 бластоцисты, дополнительный бластоцисты может затем быть успешно повторно остекловано (rVTF), повторяя шаги 2.3.3 - 2.3.11. У нас есть несколько подтвержденных живорожденных следующих отдельных rVTF событий.
   Примечание: rVTF экспериментально выполняется до 5 раз без существенного влияния на выживание / жизнеспособность анеуплоидии человека бластоцисты витрифицированы в метастабильном глицерина на основе раствора.

Results

1,341 глазурованных бластоцисты подогревали в период с 2012 по июнь 2014 г. и 1341 эмбрионов выздоровел (100%), в то время как 1316 выжили (98,1%). Бластоцисты испытал биопсии, над выживанием 99,5%. При передаче преимущественно одного, генетически испытанный, эуплоидных остеклованные эмбрионов, мы смогли достичь некоторых из самых высоких показателей имплантации и живых уровень рождаемости в США, независимо от возраста (рисунок 3) ^20, согласно последним национальным статистическим данным , о которых сообщили в Центре по контролю за заболеваниями и общества вспомогательных репродуктивных технологий (Таблицы 1 и 2). Оценка популяции пациентов хороший прогноз (менее 35 лет) для одних криоконсервированных циклов (таблица 1), наша лаборатория превзошла средний национальный показатель для обеих ставок имплантации (т.е. эффективность эмбриона для установления беременности) и в конечном итоге жить уровень рождаемости более чем на 30%. Кроме того, первоначальная проверка / проверка наших модифицированных соломкой хранения в середине 2014 года с использованием 70-исследовательских, соглашался вновь стеклокерамики анеуплоидных бластоцисты привели к 100% восстановления и выживаемости 100%.

Рисунок 1. Настройка MicroSecure VTF. ПТФ блюдо (A) собран с 3 - мя различными рядами витрификационные решений, которые используют 3 капли мыть перед размещением в различных, пронумерованных капель холдинга. Кроме того, отдельные пипеток с укороченными наконечниками VTF (т.е. 300-мкм ID flexipettes) обеспечены и организованы в стойку пенополистирол трубки (B), которые могут быть повернуты для упорядоченного использования. Обратите внимание, что представитель одноразового использования микропипетка лампы пипеткой сборка покоится на пенопластовой стойке. Arget = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Модифицированная БЛАСТОЦИСТНОЙ Система классификации. Наша модифицированная система бластоцисты классификации Гарднера объясняет индуцированной грыжа клеток TE для облегчения бластоцисты биопсии. Модификация считает преждевременной штриховкой полных бластоцист (A: 3 класс = менее 10% грыжа) и расширенных бластоцист (B: 4 - й степени = до 50% грыжа), в то время как вылупления бластоцисты (С) имеет более чем 50% грыжа ^16. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

54871fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Сравнительный Беременность исходы. За нарастающим интервалом 1,5 года, данные беременности были сопоставлены с целью оценки влияния переноса стеклокерамики нагретую эуплоидных бластоцисты (п = 172 циклов / 144 передачи) по сравнению с не PGS циклов (n = 160 циклов / 153 передачи) с участием преимущественно свежие передает ^18. Для наших экспериментальных целей, эти данные ясно показывают, что биопсию бластоцисты стеклокерамики в соответствии с процедурой мкСм-VTF сохраняют свою жизнеспособность. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Источник данных	# Циклы	Среднее значение # эмбрионов, переданных	Имплантация тарифы (%)	Текущие тарифы рождения (%)
NB Lab *	144	1.2	74,00%	74,50%
Среднее по стране	20423	1.7	39,60%	44,10%
* Данные были усреднены основаны на исполнении 2014 Orange County Изобилия, Южной Калифорнии Fertility Center и Южной Калифорнии Центр клиник репродуктивной медицины с использованием текущего Овация плодородности лаборатории (NB Lab), которая основана процедуру microSecure витрификации в 2008 году.

Таблица 1. CDC 2014 вспомогательных репродуктивных статистики. Замороженные данные перенос эмбрионов беременности женщин в возрасте до 35 лет от трех отчетов врачей клиники с помощью нашей лаборатории NB по сравнению с в среднем по стране более чем 450 клиник отчетности США 2013 года.

РЛО средние национальные показатели
Клиника - Государственное	женщины	женщины	женщины	женщины
	<35 YRS	35-37 YRS	38-40 YRS	41-42 YRS
SCCRM-CA *	63,1%	58,3%	40,6%	32,3%
CCRM-CO *	64,7%	61,5%	40,4%	32,2%
РМА-NJ *	63,2%	59,7%	34,6%	18,7%
Среднее по стране	48,6%	38,3%	24,3%	12,3%
SCCRM-Южной Калифорнии Центр репродуктивной медицины; CCRM-Колорадо центр репродуктивной медицины; и РМА-Reproductive Медицина Associates
* Эти ведущие клиники все в основном реализованы остеклованные циклы переноса эмбрионов, в сочетании с предимплантационной генетического тестирования, в их стандартной практике ухода за пациентами с целью оптимизации живого успеха при рождении каждого эмбриона пересаженной.

Таблица 2. Совокупные показатели 2014 живорождения, как сообщает Общество вспомогательных репродуктивных технологий (РЛО), для клиники SCCRM с использованием нашего Овация Fertility Lab в городе Ньюпорт - Бич, Калифорния, контрастируют с несколькими другими уважаемыми программами, а также с РЛО национальные средние.

Discussion

На сегодняшний день существует высокая ожидание достижения полной выживаемости бластоцисты (> 95%) и достижение успеха имплантации, аналогичную свежих эмбрионов. Некоторые группы предполагают, что живые рождаемости витрифицированных циклов переноса эмбрионов, возможно, даже выше, чем свежие бластоцисты, когда неповрежденными криоконсервации эмбрионов пересаживают в здоровую, не-гормонально-стимулированной матки. Наши данные четко показывают, что стеклование эффективно и надежно сохраняет жизнеспособность свежего эмбриона. Кроме того, мы показали , что наша асептическая, закрытый метод, называемый MicroSecure витрификации (мкСм-ПТФ), можно достичь оптимального результата , сравнимой или большей , чем коммерческие стандарты (т.е. открытые системы устройств) , используемых в промышленности IVF.

Вариация связан с технической воспроизводимости и надежности между отдельными лицами с использованием множества витрификационные устройств / методов. В свою очередь, это привело к inconsistencies между программами, применяющих витрификации. Поэтому не удивительно, что устройство фамильярность является важным фактором в отношении лабораторного профессионализма и успешных результатов. Именно эта концепция «технической подписи» ¹¹ , что объясняет , почему воспроизводимости между программами может быть проблематичным. Мало того, что развитие более десятка коммерческих устройств осложненный это явление, оно создало проблемы контроля качества. К счастью, закрытые системы стекловании как мкСм-VTF, Rapid-I, и VitriSafe, теперь оказывается столь же эффективным для открытых систем устройств ^{12, 13, 14.}

MicroSecure ВТФ является новым, асептики витрификация разработана с технической простотой, надежностью и крио-безопасности в виду. Комбинируя использование двух ранее утвержденных, FDA-совместимых устройств, это некоммерческий система витрификация шIth явное преимущество иметь установленную низкую стоимость, в отличие от специализированных устройств. Кроме того, его уникальный неумелого и усвоены Двухцветные систему маркировки, а также многочисленные другие преимущества контроля качества, сделали мкСм-VTF привлекательным глобальным параметром ^11. В качестве некоммерческого устройства ВТФ, однако его широкое применение промышленности развивается медленно. Только через продолжение публикации своей безопасности, безопасности и клинической эффективности получат мкСм-ВТФ растущее использование.

В августе 2014 года, столкнувшись с невозможностью приобрести оригинальную 0,3 мл эмбриональной соломы, изготовленного с внутренним, без затекания гидрофобного пробки, мы смогли достоверно изменить метод мкСм-VTF. Короче говоря, новые 0,3 мл спермы / эмбрионов соломки с их ватно-PVP пробками были эффективно адаптированы. Это просто достигается за счет создания внутреннего уплотнения перед ватным тампоном, таким образом предотвращая контакт и жидкость впитывания соткрытого состава ПТФ наконечник (т.е. flexipette , содержащий эмбрион или яйца). Кроме того, если 40-мм ID стержни не доступны, вопрос, связанный с плавучестью легких 30-мм стержней может быть противовесом с помощью двух шарикоподшипниках.

Эти дополнительные шаги сделаны метод немного менее простой, но все же весьма эффективно. Сегодня, экономика и эффективность становятся все более важные проблемы, так как биопсию бластоцисты, как правило, остекловано индивидуально, пока их статус не euploidy подтвержден на докладе генетики. Бластоцисты с подтвержденным нежизнеспособных анеуплоидии статусом, как правило, выбрасываются, с согласия пациента, в течение нескольких недель. Таким образом, большинство (> 50%) VTF устройств отбрасываются после кратковременного хранения, в результате чего эскалацию ежегодные затраты при использовании коммерческих устройств. В целом, мкСм-ВТФ является весьма эффективным, надежным и повторяемым процедура криоконсервации человеческих бластоцист. Превосходное качество-контроль дизайн securelу метки и безопасно хранит / эмбрионов ооциты, устраняя сбой восстановления и оптимизации выживаемости после потепления и жизнеспособность, что оправдывает использование системы в качестве универсального подхода к эмбриональной витрификации.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Алюминиевая трость	IVM	XC055
Шарикоподшипники, 3/32"	VXB.com	KIT15977	нержавеющая сталь
CBS сперма/эмбриональная соломинка, 0,3 мл	CryoBioSystems	25292	индивидуальный стерильный
цвет, ID стержни, 30 мм	CryoBioSystems	019021-26	взвешенные
пробирки для культуры, 15 мл	Falcon	352099	конический
Пробирки для культивирования, 10 мл	Falcon	352057	Snap-cap
Cryosleeves	Nalgene	5016-001
Filter, 250 мл	Fisher Sci.	09-740-2A	0.22 μ m
Колбы, Tissue Culture 50 мл	Falcon	353014
Flexipettes, 300 μ m ID	Cook Med.	K-FPIP-1300-10BS-5	Стерильный, 20/упаковка
щипцов, большой	Miltex	6-30TC
, Осколок - тонкий	Miltex	17-305
Кубок	IVM	PA003
Термосварщик, SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110 В или 220 В с адаптером
Hepes-buffered media	Life Global или	LGGH-100; 100  мл, или	хранить при 2 - 8 ° и дрм; C
	Irvine Scientific	H-HTF; 90126; 100 мл	с несущественными этикетками AA
, Cryo	GA International	CL-23T1	различных цветов
Резервуар для жидкого азота, 40  L	MVE или Тейлор Уортон различные		хранилища жидкости
LN2; Фляга Дьюара, 0.5  L	Hampton Research	HR4-695	Нержавеющая сталь
6-луночные чашки Кастера	Biogenics	015/020	пластиковая посуда по футляру
Лампочка-пипетка, микроколпачок	Drummond	Fisher#13681451	Отверстие на вершине луковицы
Чашки Петри, 35 мм	Сокол	351006
чашки Петри, 58 мм	Чашки Петри	150288
100 мм	Наконечники для	Falcon 351029
, ART long	Fisher Sci.	02-707-80	10 - 100 μ
L Pipet Aid	Drummond или Falcon	различные	перезаряжаемые
пипетки, стриппер	Cooper хирургические	MXL3-STR
, серологические 1  mL	Falcon	357521
пипетки, серологические 2  mL	Falcon	357507
пипетки, серологические 5  mL	Falcon	357543
пипетки, серологические 10  mL	Falcon	357551
Ножницы, хирургический Майонез	Miltex	5-SC-16
Стереомикроскоп	Nikon, Olympus, Leica	различные
стерильные марлевые салфетки, 4" x 4"	Kendall Healthcare	6939
Синтетическая сыворотка	Life Global, или	LGPS-20; 20 мл, или	хранятся при 2 - 8 º C
	Irvine Scientific	SS-99193; 12 x 10 мл	купить лот с низким содержанием эндотоксина
Sucrose	Sigma Chemical Co.	#S9378	Аликвота на 50  колбы мл, 1 год; <чел./> 17,1 г/колба + Medium до 50 мл; <чел/> делает 1М раствор; <чел./> Фильтр с 0,22 & микро; m блок
Таймер	Nalgene	5016-001
Решение для размораживания	Innovative Cryo Enterprises	BL-TS (≤ 1,0 м сахароза)	T1, T2, T3, T4; tored at 2 - 8 º C для ≤ Через 1 месяц после открытия
Vitrification Solution*,**	Innovative Cryo Enterprises	BL-VS (≥ 7,9 М [глицерин/ЭГ])	V1, V2, V3; хранится при 2 - 8 &ордм; C для ≤ через 1 месяц после вскрытия
* Непроникающие криопротекторные добавки могут включать: сахарозу, фиколл и гиалуронат натрия
** Другими коммерческими препаратами обычно являются этиленгликоль (EG)/диметилсульфоксид (DMSO; 30% v/v; 4,8 M), но могут быть EG/пропиленгликоль (32% v/v; 5,2 M). Смешанные растворы обычно используются для снижения криотоксичности раствора с высоким содержанием моляров. Коммерческие решения обычно включают решения ES и VS. Рецептура коммерческого препарата, как правило, является собственностью.