Иммуноокрашивание Biocytin заполненных и переработанным секций для нейрохимических маркеров

Bogumila Swietek; Akshay Gupta; Archana Proddutur; Vijayalakshmi Santhakumar

doi:10.3791/54880

Методическая статья

Иммуноокрашивание Biocytin заполненных и переработанным секций для нейрохимических маркеров

22.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54880

⸱

31 декабря 2016 г.

Bogumila Swietek¹ , Akshay Gupta² , Archana Proddutur² , Vijayalakshmi Santhakumar²

¹Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, ²Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой метод морфологического восстановления нейронов исправленных во время электрофизиологических записей с использованием наполнения biocytin и последующего иммуногистохимического постобработки. Покажем, что толстые секции biocytin заполненные которые окрашивали и покрывали могут быть restained со вторым первичных дней антител или месяцев спустя.

Аннотация

Электрофизиологические записи клеток с использованием метода патч зажим позволили для идентификации различных типов нейронов, основанных на образцах стрельбы. Включение biocytin / neurobiotin в записи электрода позволяет ретроспективном восстановление морфологических деталей, которые необходимы для определения ветвления дендритов и регионы, ориентированные на аксонов записанных нейронов. Однако, учитывая наличие морфологически сходных нейронов с различными нейрохимических идентичностей и функции, иммуногистохимическое окрашивание для белков клеточного типа конкретных важно, чтобы окончательно определить нейроны. Для поддержания подключения к сети, срезы головного мозга для физиологических записей готовят при толщине 300 мкм или больше. Тем не менее, эта толщина часто мешает иммуногистохимического постобработку из-за проблем с проникновением антител, что требует резекции ткани. Резекции срезов является сложным искусством, часто Ресултин в потере ткани и морфологии клеток, из которых электрофизиологические данные были получены, рендеринг данных непригодным для использования. Поскольку восстановление морфологии ограничит потери данных и руководство в выборе нейрональных маркеров, мы приняли стратегию восстановления морфологии клеток первого, а затем вторичным иммунным окрашиванием. Введем практический подход к biocytin наполнения во время физиологических записей и последующего серийного иммунным окрашиванием для восстановления морфологии, с последующим restaining участков для определения нейрохимических идентичности. Мы сообщаем, что участки, которые были заполнены с biocytin нелетучие с параформальдегидом (ПФА), окрашивали и покрывали могут быть удалены и restained со второй первичной дней антитела позже. Это restaining включает в себя удаление покровного, промывка секций в буферном растворе, и инкубацию первичных и вторичных антител выявить нейрохимических идентичность. Метод является предпочтительным для устранения ДАТпотери из-за невозможности восстановления морфологии и сужения нейрохимические маркеры для тестирования на основе морфологии.

Введение

Мозг известен разнообразием в структурных и функциональных характеристик отдельных его элементов нейрональных. Понимание роли различных типов нейронов в функции мозга и патологии требует определения характеристик и однозначной идентификации нейронов. Конструктивно, морфологические признаки, определяемые сомато-дендритной месте определить потенциальные входы, которые получает данный нейрон, в то время как модель аксонов разветвление выявляет потенциальные постсинаптические цели. Структурное разнообразие нейронов была оценена со времен семенных гистологических исследований Рамона Кахаль в ^1. Появление методов записи одноклеточных показало, что структурно раз....