Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Увеличение времени восстановления и снижение LPS администрации по изучению Нерв стимуляции блуждающего механизмов в ограниченной Воспалительные Ответы

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54890

⸱

29 марта 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Unit of Rheumatology, Center for Molecular Medicine (CMM), Karolinska Institute, Karolinska University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Стимуляция блуждающего нерва доказала свою высокую эффективность для уменьшения периферического воспаления. В данной работе мы представляем модифицированный протокол стимуляции блуждающего нерва, который позволяет проводить дальнейшие исследования холинергических противовоспалительных механизмов при ограниченных воспалительных реакциях.

Аннотация

Воспаление — это местная реакция на инфекцию и повреждение тканей, опосредованная активированными макрофагами, моноцитами и другими иммунными клетками, которые высвобождают цитокины и другие медиаторы воспаления. В течение долгого времени гуморальные и клеточные механизмы изучались на предмет их роли в регулировании иммунного ответа, но последние достижения в области иммунологии и нейробиологии также раскрыли специфические нейронные механизмы с интересным терапевтическим потенциалом. Так называемый холинергический противовоспалительный путь (НГП) был описан для контроля врожденных иммунных реакций и воспаления очень мощным образом. В начале 2000-х годов Трейси и ее коллеги разработали методику, которая стимулирует блуждающий нерв и имитирует эффект этого пути. Методология основана на электрической стимуляции блуждающего нерва при низком напряжении и частоте, чтобы избежать любых побочных эффектов гиперстимуляции, таких как нарушение регуляции вариабельности сердечного ритма. В настоящее время доступны электрические устройства для стимуляции, что упрощает настройку методики в лаборатории. Целью данного исследования было изучение потенциального участия простагландинов в ВП. К сожалению, основываясь на более ранних попытках, мы не смогли использовать оригинальный протокол, так как индуцированная воспалительная реакция была либо слишком высокой, либо не подходила для свойств ферментативного метаболизма. Различные настройки оригинального протокола операции остались в основном неизменными, но условия, касающиеся индукции воспаления и момента перед жертвоприношением, были улучшены в соответствии с нашими целями (т.е. для исследования участия CAP в более ограниченных воспалительных реакциях).

Модифицированная версия оригинального протокола, представленная здесь, включает более длительный временной диапазон между стимуляцией блуждающего нерва и анализом, что связано с более низкой индукцией воспалительных реакций. Кроме того, при снижении уровня липополисахаридов (ЛПС) для инъекций, мы также столкнулись с новыми наблюдениями относительно механистических свойств селезенки.

Введение

Врожденный иммунитет обеспечивает немедленную первую линию защиты против инфекций и заболеваний в широком диапазоне организмов. Она не только инициирует первичный иммунный ответ, чтобы устранить угрозу, но оно также играет ключевую роль в активации и обучение адаптивного иммунитета, который выполняет вторичные иммунные ответы в патоген-специфическим образом. Воспаление оркестровщик- множеством цитокинов и хемокинов, которые, в свою очередь, имеют возможность привлекать другие иммунные клетки к очагу инфекции и вызвать кардинальные признаки воспаления, такие как покраснение, отек, боль, потеря функции и лихорадка , Продолжительность и интенсивность воспаления зависят от нескольких факторов, но разрешение воспаления и восстановление гомеостаза является важным шагом, чтобы избежать возникновения хронических воспалительных заболеваний. Последние достижения в области неврологии и иммунологии разгадали конкретные механизмы нейронные с огромным терапевтическим потенциалом для контроля Влиянammation как в центральной нервной системе и на периферии. Одним из таких механизмов является холинергический противовоспалительный путь (САР), также известный как воспалительный рефлекс, который приводится в действие вегетативной нервной системы 4, 5.

В настоящее время считается, что воспалительные медиаторы активировать сенсорные нервы и посылают сигналы относительно состояния воспаления в центральной нервной системе. Рефлекс ответ затем активируется через эфферентный блуждающий нерв. Обширное исследование на анатомических деталях CAP выявило парасимпатическую-симпатическую модель , состоящую из двух нервов, блуждающий нерв и селезеночной нерв, соответственно 6. В CAP, активированный холинергический эфферентный блуждающий нерв заканчивается в глютеновом-брыжеечных ганглии, что приводит к активации адренергического селезеночного нерва с помощью механизма, еще предстоит исследовать. Селезеночный нерв, таким образом, активируется, как известен, внутренниеVate в непосредственной близости от иммунных клеток в белой пульпе, краевой зоне и красной пульпе селезенки, основные и обязательного орган CAP 7, 8. Норэпинефрина (NE) из селезеночных нервных окончаний связывается с соответствующими β 2 адренергических рецепторов , экспрессируемых на селезеночных Т - лимфоцитов. Это вызывает холина ацетил трансферазы (ХАТ) -опосредованного ацетилхолин (АХ) релиз, который , в свою очередь , активирует А7 никотиновые рецепторы ацетилхолина (α7nACh) на макрофагах, тем самым ограничивая продукцию цитокинов и воспаление 2. Следовательно, теперь ясно, что нервная система способна регулировать воспаление в периферических тканях и восстановления местного иммунного гомеостаза.

Как видно из названия пути предполагает, система АЧ имеет решающее значение для функционирования этого нейро-иммунных регулировочного пути. Интересно отметить, что механизмы, участвующие в активацииПСП, кажется, отличаются по периферии и в центральной нервной системе. В то время как значение никотиновых рецепторов (α7nAChR) в селезенке было показано ранее , 9, мускариновые рецепторы (mAChR) являются обязательными для центральной активации пути 10, 11. Совсем недавно, периферическое введение центрально-действующих М1 мускаринового агониста значительно подавленные сыворотки и опухоль селезенки фактор некроза α (TNF & alpha ; ) в течение летальной мышиной эндотоксемии, действие , которое требуется интактный блуждающий нерв и селезеночной нерв сигнализации 12. Мы также показали , что в последнее время мыши , лишенные простагландина Е 2 (PGE 2) не были способны реагировать на блуждающего нерва и не вниз регулировать LPS-индуцированное высвобождение цитокинов в сыворотке крови и селезенки 3. Таким образом, CAP также может регулироваться, кроме основного АХ pathw системау.

Блуждающий нерв был назван так потому , что его блуждающий конечно в организме, иннервирующих основные органы , включая печень, легкие, селезенку, почки и кишечник 13. Учитывая эту большую иннервацию и очень мощного иммунодепрессивное действие блуждающего нерва, терапевтический потенциал CAP может охватывать широкий спектр воспалительных состояний. Блуждающий нерв может быть электрический (или механически) активируется, с контролем над напряжением и частотой, и наоборот к обычному лечению, с никаких наркотиков не было добавлены к телу. Испытания в настоящее время проводятся в ревматических больных, например, чтобы проверить клиническую значимость ВНС при лечении хронического воспаления 14. В целом, нейро-иммунной связи и регуляция воспаления в настоящее время под следствием, что обеспечит возможную альтернативную обработку к обычной терапии. Поэтому анализ блуждающего нерва stimulatioп эффект в различных иннервируемых органах, но и характеристика потенциального терапевтического действия в животных моделей хронического воспаления, несомненно, даст понимание и надеется на новые потенциальных терапевтических целях.

Оригинальная методика , разработанная Tracey и его коллегами-не может быть перенесена на поле нашего исследования из - за перевозбуждения воспалительного ответа (летальной дозой LPS) и слишком короткий интервал времени между активацией CAP и считыванием. В данной работе, мы представим изменения, сделанные к первоначальному протоколу, сравнить две различные методологии на уровнях цитокин, а также выделить новое и противоположное наблюдение на целевом органе (селезенка).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию животных, утвержденных местного комитет по этике при Каролинском институте, Стокгольм. Комитет по этике местным следует директиве Европейского союза по уходу за животными.

Примечание: Основные изменения от первоначального протокола является время восстановления после операции (6 ч по сравнению с 1 ч) , а уровень LPS инъекции (2 мг / кг по сравнению с 15 мг / кг). В противном случае, различные параметры, относящиеся к самой операции не были изменены.

1. Подготовка Материал для стимуляции

  1. Включите компьютер и систему сбора данных , связанную с стимулирующим электродом (фиг.1А).
  2. Введите подтверждени программу.
  3. Подготовка исходного раствора LPS в концентрации 5 мг / мл в PBS, 1x аликвоты его, и хранить его при температуре -20 ° C. В день эксперимента, оттаивать аликвоты и подготовить ADEQuate образец LPS (0,5 мг / мл) для того, чтобы впрыскивать около 100 мкл в организм животного, в зависимости от веса.

2. Подготовка животных для производства анестезиологии

  1. Используйте C57BL / 6. Поддерживать их под климат-контролем условиях с 12-ч цикле свет / темнота, кормить их стандартный корм для грызунов, и дать им воды вволю.
  2. Выполните операцию на мышах, которые весят около 25 г в день эксперимента.
    Примечание: Когда воспалительные реакции индуцируется, это особенно важно проводить регулярные осмотры и наблюдения клинических реакций у животных. Преждевременная эвтаназия путем ингаляции СО 2 необходимо , если условие животного не соответствует этическим критериям.
  3. Установите обезболивающую машину.
    1. Убедитесь, что трубка правильно подключен и не поврежден каким-либо образом. Убедитесь в том, что хорошо вентилируемом помещении работает должным образом. Подключите ключ фильтр к изофлурановой бутылке и заполнить VAPORizer с достаточным количеством изофлурана.
    2. Откройте подачу газа (воздух и кислород) и убедитесь в том, что бутылки содержат достаточное количество газа для эксперимента. Трехходовой разъем затем может отправить изофлуран поток в индукционной камере или маски.
  4. Поверните разъем трехходовой к индукции камеры. Выберите одну мышь из домашней клетки и вставить животное в камеру. Настройка регулятора потока до 1,0 л / мин кислорода и 1,0 л / мин воздуха. Регулировка концентрации изофлурана до 4 - 5%.
  5. Когда желаемый уровень анестезии достигается, когда желаемый уровень анестезии достигается, брить хирургическую область и переместить животное из камеры к маске. Поверните разъем трехходовой к потоку маски. Настройка регулятора потока до 0,25 л / мин кислорода и 0,25 л / мин воздуха.
    1. Регулировка концентрации изофлурана до 1,5 - 2,5%. Проверьте уровень анестезии рефлекторного контроля и частоты дыхания до начала хирургического procedurе.
  6. Закрепить ножки мыши к рабочему столу с помощью клейкой ленты. Убедитесь, что нос животного до сих пор бережно расположен в маске.

3. Хирургия и стимуляция блуждающего нерва

  1. Лечить хирургическую область с 70% -ным этанолом.
  2. Используя скальпель, осторожно надрезать кожу на уровне шеи (разрез около 1 до 1,5 см).
    Примечание: В протоколе, процедура операции заканчивается здесь ложнооперированными животных. Действительно, было показано, что только касаясь нерва с металлическим инструментом уже стимулирует его в какой-то степени. Поэтому, чтобы получить более точный контроль хирургии животных при использовании небольшого количества LPS, остановить операцию на этом этапе.
  3. С помощью микроскопа (12.5x объективном), изолировать левый блуждающий нерв от сонной артерии с помощью рассекает щипцов. Сначала найдите кивательной мышцы путем удаления кожи и жировых отложений, а затем убрать его втого, чтобы положить пинцетом за оба нерва и артерии.
    Примечание: Следующий шаг очень сложно, так как нервы и артерии тесно привязаны друг к другу. Таким образом, очень легко разрезать судно и убить животное. Тем не менее, очень осторожно поместив щипцы между нервом и артерией, они в конечном счете по отдельности, а можно изолировать нерв.
  4. Поместите электрод (Фигура 1В) под блуждающим нервом. Игольчатый электрод достаточно длинный, так что даже если нерв слегка перемещается во время стимуляции, он всегда будет находиться в контакте с электродом.
  5. Выполните внутрибрюшинного (IP) инъекцию LPS (2 мг / кг) с помощью шприца (для считывания на уровни цитокинов, то есть, чтобы измерить вниз для регулирования эффекта).
  6. Подождите, за 5 мин до начала стимуляции.
  7. Стимулирует блуждающий нерв в течение 5 мин при 5 В и 1 Гц, нажав на кнопку запуска в программе Acknowledge.
  8. реперемещать электрод и сшивать рану животного с хирургической шовной нитью.
  9. Спрей Нет Sting барьерной пленки (NSBF) на рану с целью улучшения заживления и защиты от инфекций.

4. Восстановление животных

  1. После операции перемещения животных обратно в клетку для пробуждения и восстановления. Под инфракрасного света для того, чтобы поддерживать температуру тела, убедитесь, чтобы контролировать животное до полного сознания не было восстановила.
  2. Пусть животное восстановить в своей клетке в течение 6 ч до умерщвления для анализа.
    Примечание: Влияние блуждающего нерва происходит очень быстро , и также было показано, что длительный (до 48 часов), таким образом, время восстановления может быть установлено экспериментатором в соответствии с потребностями исследования.

5. Жертвоприношение для дальнейшего анализа

  1. Поместите животное в клетку , связанную с устройством управления СО 2.
  2. Установите устройство на 5-min цикл СО 2 ингаляции.
  3. Когда эвтаназии будет сделано, собирают органы , представляющие интерес , и заморозить их непосредственно на сухом льду для дальнейшего анализа (например, измерение уровней цитокинов в селезенке экстрактов с помощью мыши TH1 / TH2 9-Plex анализ) 3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Уровень ФНО и интерлейкина-1 (IL-1) после того, как увеличение промежутка времени после хирургии и снижения дозы LPS

Как было показано ранее, используя оригинальный протокол, ВНС снизились уровни TNF & alpha; (169,3 ± 24,9 пг / мг в ложной операции против 39,7 ± 10,8 пг / мг в ВНС, р <0,001) и IL-1 (360,0 ± 40,21 пг / мг в SHAM по сравнению с 191,7 ± 27,2 пг / мг в ВНС, р <0,01) в селезенке после внутрибрюшинного введен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

С момента своего открытия в начале 2000-х годов, механизмы ПСП были тщательно изучены. Теперь у нас есть хорошее представление о пути, и в частности, орган - мишень, селезенку, где СВ, память Т - клетки, ACH и макрофаги работают как очень эффективная команда , чтобы подавлять воспалительные медиаторы 2. Мы также недавно были опубликованы данные о значении функциональной системы простагландинов у мышей, в частности, PGE 2, который, очевидно , является обязательным компонентом для освобо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Исследование было поддержано Шведским исследовательским советом, Шведской ассоциацией ревматизма, Фондами Каролинского института, Советом Стокгольмского графства, Фондом Валленберга и Фондом 80 лет GV. Авторы также хотели бы поблагодарить Ханну Окотт за корректуру рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КомпьютерToshiba-Любойкомпьютер фактически совместим
с системой сбора данных MP-150Biopac SystemsMP150WSW
Acknowledge программным обеспечениемBiopac Systems
Mice C57Bl/6Charles River
Anesthetic MachineSimtec Engineering
Медицинский кислородный баллонAGA107563
Медицинский баллон для воздуха AGA108639
Ветфлуран (1,000 мг/г)Вирбак137317
ЛПСSigma-AldrichL2630
Физиологический растворMerck Millipore1024060080
PBS 10xSigma-AldrichP5493Разведенный в 10 раз для использованной концентрации
Шприц (1 мл)BD Plastipak303172
Иглы 23 GKD-FINE0,6 x 30 мм (синие)
Микрорассекающие щипцы (изогнутые)Sigma-AldrichF4142
Ножницы для пресеченияSigma-AldrichZ265969
Хирургический шов 4-0EthiconG667G
Аппарат для эвтаназииEuthanex SmartboxEA-32000
Cavilon No Sting Barrier Film3M Health Care3346N
TH1/TH2 9-Plex анализ, сверхчувствительный наборMesoScale DiscoveryK15013C-1
Стимулирующее электродное устройствоBiopac SystemsSTIMSOC
Aesculap Isis бритваAgnthosGT420
R70Диета для грызунов из Lantmannen, Стокгольм, Швеция
900284

Ссылки

  1. Nathan, C. Points of control in inflammation. Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).
  2. Rosas Ballina, M., et al. Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit. Science. 334 (6052), 98-101 (2011).
  3. Le Maître, E., et al. Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).
  4. Borovikova, L. V., et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).
  5. Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity. Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).
  6. Pavlov, V. A., Tracey, K. J. Neural circuitry and immunity. Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).
  7. Huston, J. M., et al. Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis. J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).
  8. Rosas-Ballina, M., et al. Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).
  9. Wang, H., et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation. Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).
  10. Pavlov, V. A., et al. Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).
  11. Pavlov, V. A., et al. Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).
  12. Rosas-Ballina, M., et al. Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation. Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).
  13. Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L. Psychoneuroimmunology. Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. 55, Academic. San Diego. 55-112 (2001).
  14. Andersson, U., Tracey, K. J. A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation. Cerebrum. 2012, 3(2012).
  15. Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function. J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).
  16. Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis. Blood. , (2016).
  17. Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. The vagal innervation of the gut and immune homeostasis. Gut. 62, 1214-1222 (2013).
  18. Pereira, M. R., Leite, P. E. The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex. J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).
  19. Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. 9 (8), e104530(2014).
  20. Huston, J. M., et al. Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis. Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).
  21. Yuan, H., Silberstein, S. D. Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II. Headache. 56 (2), 259-266 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

1
Увеличение времени восстановления и снижение LPS администрации по изучению Нерв стимуляции блуждающего механизмов в ограниченной Воспалительные Ответы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.