Использование линейных агарозном каналов для изучения Drosophila Личиночная Ползучая Поведение

Краткое содержание

Личинка дрозофилы это мощная модель системы для изучения нейронной контроля поведения. В этой публикации описано использование линейных каналов агарозном индуцировать устойчивые приступами линейного сканирования и методов количественной оценки динамики личиночных структур при многократном ползущего поведения.

Аннотация

Дрозофилы личиночной ползать развивается как мощная модель для изучения нейронной контроля поведения сенсомоторной. Тем не менее, личиночной поведение ползать на плоских открытых поверхностях является сложным, в том числе: остановка, поворот, и извилистые. Эта сложность в репертуар движения затрудняет детальный анализ событий, происходящих в течение одного цикла ползать шага. Чтобы преодолеть это препятствие, линейные агарозы каналы были сделаны, что ограничит личиночной поведение к прямой, устойчивой, ритмичной ползания. В принципе, так как агароза каналы и личиночной тела дрозофилы являются оптически прозрачными, движение личиночных структур , помеченных генетически кодируемых флуоресцентных зондов можно наблюдать в интактном, свободно движущихся личинок. В прошлом, личинки были помещены в линейных каналов и сканирование на уровне всего организма, сегмента, и мышцы были проанализированы ^1. В дальнейшем личинки ползет в каналах могут быть использованы для визуализации кальция для мониторинга нейроNAL деятельность. Кроме того, эти методы могут быть использованы с личинками любого генотипа и с любым исследователем спроектированный канала. Таким образом, протокол представлен ниже широко применяется для исследований с использованием личинку дрозофилы в качестве модели , чтобы понять управление двигателем.

Введение

Общая цель этого метода состоит в изучении дрозофилы личиночной ползать в деталях. Эксперименты по передвижению сыграли важную роль в разработке и тестировании теории управления двигателем на ^2. Традиционно локомоция изучен у водных животных (например, пиявки, миноги, головастика) ^3. Повторяющийся характер локомоции у этих животных позволило для изучения ритмогенеза, для анализа биофизических событий вождения передвижения, а также для мониторинга нейропаттерны стрельбы, которые сопровождают локомоции.

Использование личинок Drosophila для изучения локомоции представляет собой уникальное сочетание преимуществ по сравнению с другими модельных систем: легковесных генетики, хорошо охарактеризованного развития, тело , которое является оптически прозрачным в первом и втором возрастах, и продолжающийся электронной передачи микроскопическом реконструкции всего нервной системы ^4-6. Тем не менее, дрозофилы личиночной локоДвижение на плоских открытых поверхностях является довольно сложным в том числе паузами, повороты и извилистые ползает ^7. Данная публикация представляет собой метод использовать линейные каналы агарозном для руководства дрозофилы личиночной поведение двигательную таким образом, что личинки выполняют устойчивый, прямой, ритмичное поведение сканирования.

Изучение дрозофилы личиночной поведение в агарозном каналах, а не поведения на плоских открытых поверхностях, имеет несколько преимуществ. Во-первых, это позволяет исследователям специально выбрать ползет поведение из многих движений, которые являются частью личиночной поведенческого репертуара. Во-вторых, путем регулировки ширины канала по сравнению с личиночной размером тела, ползать скорость можно регулировать. В-третьих, каналы позволяют личинка следует рассматривать с дорсальной, вентральной или боковой стороне в зависимости от того, как будет загружен и ориентирован в пределах канала личинка. Такая универсальность в личиночной ориентации позволяет любую структуру, интерес постоянно быть видны во время сканирования. В-четвертых,каналы поддаются для использования с широким разнообразием микроскопов и задач. Например, линейные каналы могут быть использованы для низкого разрешения изображения на ярко-полевых стереоскопов и / или для изображений с высоким разрешением на прядильно-диск конфокальной микроскопов ^1. В-пятых, этот метод может быть использован в комбинации с оптогенетика / thermogenetic нейрональных манипуляций в любой генетический фон. И, наконец, потому что и тело личинки (на первом и втором возрастах), а также агарозу каналы оптически прозрачны, каналы могут быть использованы при изучении динамических движений или изменения в интенсивности флуоресценции личиночных структур, помеченных генетически кодируемых флуоресцентных зондов.

Описанный метод подходит для детальных исследований кинематических первого и второго возрастной стадии дрозофилы личиночной поведения. В данной публикации анализируются динамические изменения в интенсивности флуоресценции ЦНС при лобовом личиночной ползать, чтобы продемонстрировать использование каналов и в качестве предшественника NeuRonal визуализации кальция.

Протокол

1. Подготовка Личинки

1. За неделю до начала записи поведения, водрузил крест (минимум 25 дев и 5 мужчин). Поддерживать все кресты и потомством при 25 ° C.
   Примечание: Температура условий культивирования может быть изменен, но линия времени описано ниже будет необходимо корректировать с учетом изменений в скорости развития.
2. 5 дней до начала записи, первым делом утром, поместите крест в клетку сбора с агар / крышкой сока и прикосновением (0,5-1 мл) дрожжевой пасты в центре крышки агара / сока.
   1. Для того, чтобы сделать коллекцию клетку, совать отверстия в 6 унций. квадратный из полиэтилена Drosophila бутылки.
   2. Для того, чтобы агар / сок колпачков, смешайте 18 г агар с 600 мл воды в конической колбе. В отдельной колбе смесь 20 г сахарозы с 200 мл яблочного сока. Микроволновая печь до твердого вещества растворяются. Смешайте и размешать, позволяя смеси остыть до 60 ° С. Добавить 20 мл 10% метил-п-гидроксибензоат в 95% этаноле, и перемешивают. Добавить ~ 7мл в нижней половине 35-х 10 мм круглой чашке Петри. Разрешить агар / сок затвердеть в течение 1 часа при комнатной температуре. Хранить при температуре 4 ° С.
   3. Для того, чтобы дрожжевой пасты, добавьте в равных частях по объему сухих дрожжей и воды. Хранить при температуре 4 ° С.
3. Проверьте здоровье личиночной коллекций.
   1. Утром, 4 и 3 дня до записи, снимите крышку и положите свежий колпачок на клетку. Изменение крышки в то же время каждый день, чтобы получить коллекцию 24 ч яиц и только что вылупившихся личинку.
   2. После каждого крышка снята, осмотрите его, чтобы увидеть, сколько яиц крест укладки. Ожидать между 500-2000 яиц. Отрегулировать количество взрослых, если это необходимо.
      Примечание: Несколько яиц должны вылупились личинки и Новоиспеченный личинки будут найдены от дрожжевой пасты.
   3. Возраст каждую крышку в течение 24 часов. Пересмотреть крышку для того чтобы определить, является ли здоровые личинки.
      Примечание: Большинство яйца должны вылупились личинки, а личинки должны были залез в уеAST пасты. Признаки плохого здоровья включают большое количество невыведенного яиц, мертвые личиночной тела вдали от дрожжевой пасты и личинок со значительными темными пятнами в области живота, что указывает на иммунную реакцию. Если личинки являются нездоровыми, менять клетку, сделать свежие шапки / дрожжевую пасту, а также проверить генотип.
   4. Выбросьте старые шапки.
4. Сбор личинок для поведенческих записей.
   1. В обоих 2 и 1 день до записи, снимите крышку и заменить свежей крышкой.
   2. Добавьте каждый удаленный колпачок и держать при температуре 25 ° C. Это будет производить поэтапную серию личинок для поведенческих записей. Личинки из Новоиспеченный (0-4 ч posthatch) через второй возрастной стадии (24-48 ч posthatch) могут быть использованы в каналах. Сохраните колпачки для записи на последовательных дней.
   3. Выбросьте все заглавные буквы после 48 часов.
   4. При необходимости повторите шаги 1.4.1-1.4.3 до 5 дополнительных д. После того, что меньше получают оплодотворенные яйца.

2. Подготовка каналов

1. Подготовьте линейные PDMS канала (полидиметилсилоксана, силиконовый эластомер) литейная форма (рисунок 1А). PDMS литейных форм можно получить из лаборатории Хекшира по запросу.
   1. Очистите литейную форму с изопропилового спирта. Воздух сухой, мазок сухой с лабораторными салфетками или использовать сжатый воздух.
   2. Поместите литейную форму в 10 см чашки Петри, крышки или другого контейнера.
2. Подготовить и залить раствор агарозы.
   1. Сделайте 3% агарозном раствора в воде (3 г в 100 мл) микроволновке до полного растворения.
   2. Смесь охлаждают до 55 ° С, что позволяет пузырьки подниматься к поверхности.
   3. Налить в агарозном смесь в чашку Петри, содержащую литейную форму так, что пресс-форма только покрыта. Пусть агарозном набор, пока не затвердевает.
3. Удалить агарозном каналы из литейной формы. Обрежьте края агарозном диска с лезвием бритвы.
   1. Помещенный каналs в 10 см чашки Петри, погруженного в воду. Их можно хранить при температуре 4 ° С в течение 7 дней.

3. Загрузка личинка в канал для записи поведения

ПРИМЕЧАНИЕ: При хранении каналов при 4 ° С, позволяют каналы прийти к RT перед использованием поведенческого записи.

1. Используйте чистую лезвие , чтобы отрезать один канал из тех , полученного на стадии 2 (фиг.2А).
2. Используйте пару щипцов , чтобы поместить канал канавками стороной вверх на покровного стекла (рис 2B). Размер и толщина покровного стекла зависит от конкретного объема, используемого для формирования изображения.
3. Используйте тонкий пинцет , чтобы выбрать личинку из агаровой колпачком / сок , полученного на стадии 1 и поместить в разрезанной канал (рис 2С).
   1. Не сжимайте личинку. Возьмите его осторожно кончиком зуба щипцами. Кроме того, можно манипулировать личинку с кистью с кончику.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно, поскольку личинки очень сеномsitive на ощупь. Если они не будут обращаться с осторожностью, ноцицептивных реакций может доминировать над их поведением в течение первых нескольких секунд эксперимента.
   2. Вымойте личинки кратко погружая их в воде.
   3. После размещения личинку на канал вырезать, используйте кончик зуба щипцов, чтобы мягко дразнить личинку в канал рощи.
      Примечание: Для большинства применений ширина личинкой и ширина канала должна соответствовать. Средняя ширина личинок на разных стадиях развития следующим образом : 0 ч posthatch - 140 мкм, 24 ч posthatch - 180 мкм, 48 ч posthatch - 320 мкм, 72 ч posthatch - 500 мкм, 96 ч posthatch - 750 мкм ^8. Каналы приходят в следующей ширины: 100, 150, 200, 250 и 300 мкм, и все каналы 150 мкм в глубину.
   4. Используйте кончик зубец пинцетом или кисточкой, чтобы отрегулировать положение личинкой внутри канала. Он может быть ориентирован в любом направлении: вентральныйвверх, вентральный вниз, вентральный в одну сторону, в зависимости от того, какая структура должна быть отображена.
4. Использование щипцов, аккуратно переверните канал над таким образом, что личинка теперь на покровного стекла. Поместите одну или две капли воды на концах канала таким образом , чтобы он заполнил водой (рис 2D).
   1. Аккуратно поднимите стороны канала, чтобы удалить пузырьки воздуха.
   2. Отрегулируйте ориентацию личинку. Чтобы сделать это, мягко подталкивать канал, но не покровного стекла свернуть личинку. Если это не меняет ориентацию, снять крышку стекла и отрегулировать положение личиночной. Личинка готов быть отображены.
   3. Изображение канал / покровное на инвертированный микроскоп. Если изображения на прямой микроскоп, просто инвертировать канал / покровное.

4. Мера Характеристика интереса к поведенческому записи

1. Для структуры интереса (например, хвост, ЦНС), измерить функцию интереса (например ,, Интенсивность флуоресценции, местоположение) в течение долгого времени.
   Примечание: Структуры, такие как голова и хвост может быть вручную примеч. Например, головка может быть идентифицирован как содержащий темные Н-образные крючки во рту, а хвост может быть идентифицирован как содержащий апостериорных закупорки трахеи spiricles. Эта статья сосредотачивается на нервной цепочки. Используйте нейронную GAL4 линии Elav-GAL4 управлять UAS-MYR-GFP трансген (Elav> GFP) ^9,10 для флуоресцентно этикетке на центральную нервную систему (ЦНС). ЦНС содержит два передних долей мозга , прикрепленные к нервному шнура, который простирается до задней (рисунок 3).
2. Мера интенсивности пикселей нервного шнура (F _(NC)) в каждый момент времени (т). Ниже описан ручной аннотационный подход, но этот шаг может быть автоматизирован.
   1. На Фиджи (или аналогичное программное обеспечение) в меню "Анализ" использовать "набор измерений ..." диалоговое окно, чтобы сообщить среднее значение серого и SLICе положение.
   2. Вручную нарисовать прямоугольник в центре нервного шнура в первом кадре из фильма (рисунок 3). Этот шаг также может быть автоматизировано с помощью сегментации изображений и регистрации алгоритмов.
   3. Используйте команду "Измерить" в меню "Анализировать", чтобы сообщить среднюю интенсивность пикселя в штучной упаковке интересующей области. Это создает окно "Результаты".
   4. В следующем кадре, вручную переместить окно без изменения размера с помощью клавиш со стрелками. Снова используйте команду "Измерить". Обновленные результаты будут показаны в окне "Результаты". Повторите этот шаг для каждого интересующего кадра.
   5. Сохранить "результаты", используя 'Сохранить как ...' команду из меню Файл. Результаты будут экспортированы как файл .xls.

5. Проанализировать Измерения

1. Нормализовать каждое п значение _(NC) до значения между 0 и 1 (г _(т) </ EM>).
   1. В таблице (или другой программы), откройте файл Results.xls. Этот файл будет иметь два столбца, представляющие номер кадра и средней интенсивности флуоресценции.
   2. Создайте новый столбец и использовать формулу Z _(T) = F _{(NC [т])} -MIN _{(F [NC])} / макс _{(F [NC])} -MIN _{(F [NC])} для генерации нормализованное значение флуоресценции что соответствует каждой временной точке.
2. Определить период шага для каждого шага в записи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цикл шага является единицей повторяющихся всего движения тела для прямой (и наоборот) ползет. По соглашению переднего начинается большого шага (и заканчивается) с движением вперед хвоста, головы и других внутренних органов , таких как кишечник или ЦНС ^1.
   1. Вручную проверьте поведенческую запись и записать время начала грудного вскармливания (I) каждого шага (I _{(Страйда цикл [N])).}
      Примечание: В приведенном ниже примере, движение впередЦНС , как инициирование шага цикла был использован (рисунок 3).
   2. Для каждого шага вычислить период: Д т _{(Stride цикл) =} I _{(Stride цикл [п + 1])} -i _{(Stride цикл [п]).}
3. Подсчитайте процент большого шага цикла , затраченное на каждый момент времени записи.
   1. Сделайте дополнительный столбец в файле электронной таблицы , представляющей время , прошедшее с начала цикла с шага (с). Установите время с момента начала шага до нуля в начале каждого шага (с _{(Stride цикл [п])} = 0). Отрегулируйте время после начала соответственно.
   2. Сделайте дополнительный столбец в файле электронной таблицы , представляющий процент шага цикла истечет (% цикл шага) Разделите скорректированные раза шага период и умножить на 100 , чтобы преобразовать в процентах от шага цикла истекшее:.% Шага цикла = (с _{(Stride цикл [п] ))} / (Δ T ₍Stride цикл) * 100).

6. Генерация полярных координат участки для Представляют Динамика структур интересов над Crawl цикла

1. В среде MATLAB, используйте диалог "Импорт данных", на вкладке Главная, чтобы импортировать обновленный Results.xls.
2. Создайте новый массив "Тета" , содержащий процента значения шага цикла (цикл% шага). ( "Тета = Var1" , где Var1 представляет цикл% шага).
3. Создайте новый массив "Rho" содержат нормированные значения флуоресценции (Z _(T)). ( "Rho = Переменная2" , где Переменная2 представляет Z _(T)).
4. Используйте команду 'polarplot', чтобы сделать полярных координат участков с циклом процентов шага как угол и флуоресценции, как радиус ( "polarplot (Theta, Rho)").

Результаты

В данной статье описан способ для направления дрозофилы личиночной поведения с использованием агарозы каналов и для измерения динамики личиночных структур по циклу ползания. Личинки в линейных каналах выполняют непрерывные приступы ритмичного ползания (рисунок 3). Так как и личинки и каналы являются оптически прозрачными, каналы могут быть использованы с личинками экспрессирующих флуоресцентные зонды, выраженные в любой интересующей структуры. Мы записали личино...

Обсуждение

Микрожидком устройство было построено , чтобы сделать линейные агарозном каналы , которые могут вместить личинок дрозофилы (Рисунок 1). Когда личинки дрозофилы помещены в этих линейных агарозных каналов их поведенческая репертуар ограничен ползет, что позволяет для детального наблюдения динамики личиночных структур в течение цикла сканирования.

Успешная запись происходит , когда личинка выполнить ряд ритмических шагов (рисунок 3). Если этог...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
6 унций квадратная бутылка дрозофилы	Scimart	DR-103
агар	сигма	A1296
сахароза	сигма	S9378
яблочный сок			не из концентрата
Tegosept	Fisher	T2300	метил--гидроксибензоат
35 x 10 мм круглая чашка Петри	Фишер	351008
пекарские дрожжи
PDMS форма для литья	FlowJem		можно запросить у авторов
Изопропиловый спирт	Fisher	A417-1
лабораторные салфетки	Fisher	06-666-11
консервированный воздух	Fisher	18-431
10 см чашка Петри	BioPioneer	GS82-1473-001
agarose	Fisher	50-444-176
лезвие бритвы	Fisher	12-640
щипцы	FST	11241-40
22 x 40 cover glass, #1.5	Fisher	50-365-605
Fiji (версия 1.51d)	NIH		fiji.sc
Excel 2016	Microsoft		www.microsoftstore.com
MATLAB R2016	Математические работы		www.mathworks.com