Method Article

Оптимизация количественного микро-анализ нейтрализации

DOI:

10.3791/54897

⸱

December 14th, 2016

 ,  , 
1Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование описывает формирования изображения на основе микро-нейтрализации анализа для анализа антигенные взаимосвязи между вирусами. Протокол использует планшетный сканер и имеет четыре шага, включая титрование, титрование количественному, обезвреживанию и нейтрализации количественному. Анализ хорошо работает с текущей циркулирующие вирусы гриппа A (H1N1) pdm09, A (H3N2) и вирусы B.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ микронейтрализации (MN) является стандартным методом измерения инфекционности вируса гриппа и ингибирования репликации вируса. В этом исследовании мы представляем протокол анализа MN на основе визуализации для количественной оценки истинных антигенных отношений между вирусами. В отличие от типичных анализов на уменьшение бляшек, которые основаны на видимых бляшках, этот анализ количественно оценивает всю популяцию инфицированных клеток в каждой лунке. Протокол сопоставляет тип или подтип вируса с выбором клеточных линий для достижения максимальной инфекционности, что повышает контрастность образца во время визуализации и обработки изображений. Введение количественного титрования определяет количество входных вирусов нейтрализации и позволяет сравнивать результаты различных экспериментов. Конфигурация визуализации с планшетным сканером и бесплатным загружаемым программным обеспечением обеспечивает высокую производительность, экономичность, удобство использования и простоту развертывания в большинстве лабораторий. Наше исследование показывает, что улучшенный анализ MN хорошо работает с циркулирующими вирусами гриппа A(H1N1)pdm09, A(H3N2) и B, не подвергаясь значительному влиянию аминокислотных замен в нейраминидазе (NA) вирусов A(H3N2). Это особенно полезно для характеристики вирусов, которые либо дорастают до низкого титра HA и/или подвергаются абортивной инфекции, приводящей к неспособности образовывать бляшки в культивируемых клетках.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микро-нейтрализации (MN) Анализы используются в вирусологии для количественного определения нейтрализующих антител и противовирусной активности. В качестве альтернативы ингибирования гемагглютинации (HI) анализы, анализы MN может преодолеть без антигенных эффектов под влиянием изменения сродства рецептора-связывания в вирусов гриппа, которые могут осложнить интерпретацию результатов HI 1,2,3. До недавнего времени большинство MN анализы были основаны на цитопатического эффекта (CPE) или иммуноферментного анализа (ELISA) 4,5. Были разработаны MN анализы , основанные на фокус и бляшки сокращения в 1990 году 6,7,8. Зубной налет Анализы сокращения полагаются на подсчете видимых бляшек для количественной оценки инфекционности. Тем не менее, визуальный подсчет только покрывают большие бляшки, которые разрешимы человеческим глазом, хотя большинство бляшек маленькие и невидимые для многих современных циркулирующих вирусов. Это неполный охват может вызвать значительное изменение среди экзаменаторов и между экспериментами, что приводит к Incomparable результаты. Также невозможно использовать метод, когда некоторые вирусы показывают неудачную инфекции одиночных клеток или очень маленьких бляшек.

Плохое разрешение подсчета может быть улучшена за счет введения протокола формирования изображения на основе. С развитием технологий, оптической микроскопии и высокой пропускной способностью читатели хорошо пластины могут обеспечить точные средства для подсчета инфицированных клеток 9. Под транс-освещенная микроскопом, инфицированные клетки с тэгом определенными маркерами могут быть визуализированы с помощью их поглощения или флуоресценции в отличие от субклеточном разрешения. Образец может быть проанализирован на экране компьютера.

К сожалению, в связи с ограничением в поле зрения, более ста плиточные изображения должны покрывать одну скважину. Анализируя пластину с 96 лунок потребует обработки изображений и обработки около десяти тысяч изображений. Такой трудоемкий процесс занимает много времени и дорого, а разрешение получили в родахл ненужной для рутинной характеризации вирусных инфекций. Лаборатории с ограниченным бюджетом могут обнаружить, что подход построен вокруг планшетного сканера обеспечивает рентабельное, высокую пропускную способность альтернативу.

В этой статье мы опишем улучшенный MN анализ уменьшения образования зубного налета, который подходит для антигенной характеристики большого количества вирусов и для количественного измерения противовирусной активности и нейтрализации антител. Анализ имеет несколько преимуществ: во-первых, она представляет собой анализ изображений на основе, который способен измерять вирусные инфекции на клеточном уровне, независимо от размера бляшки. Подсчет общего зараженную популяцию клеток (ПМС) в скважине значительно повышает чувствительность обнаружения, что позволяет охарактеризовать вирусы с низкой инфекционности. Во-вторых, более точное количественное титрование вводится до нейтрализации с целью определения количества вируса ввода. Вирус количественный ввод значительно снижает Variaция между различными экспериментами и делает результаты более сопоставимы между лабораториями. В-третьих, нейтрализующие титры антител можно определить непосредственно путем анализа изображений, что делает быстро и количественно оценивать удобно. Наконец, протокол обеспечивает рентабельную и высокой пропускной способностью вариант с требуемой разрешающей способности и точности. Количественное основан на планшете сканера и свободного программного обеспечения для обработки данных. Вся установка имеет небольшой размер и может быть развернуто в большинстве лабораторий.

Протокол, представленные в этой статье, состоит из четырех основных этапов, в том числе титрования вируса, титрование количественному, нейтрализации вируса и нейтрализации количественному. Вирус титрование представляет собой препарат эксперимент, который определяет количество входных вирусов, которые будут использоваться в нейтрализации. Во время титрования, ряд вирусных концентраций, применяются к монослоев клеток в 96-луночный планшет. Инфицированные клетки затем количественному в разделе 2. Вирусный diluции, который производит 20% -85% ПМС, в свою очередь применяется в качестве входных вирусов к соответствующей нейтрализации в Раздел 3. Титры протокола нейтрализации количественно, используя раздел 4. Эксперименты, которые следовали вышеуказанные протоколы представлены в представительных результатов. Анализ был тщательно протестирован в течение последних двух лет с большинства современных вирусов гриппа, циркулирующих, таких как A (H1N1) pdm09, A (H3N2) и вирусы B. Результаты определения характеристик вируса гриппа были включены в доклады для консультативного совещания ВОЗ, которая дала рекомендации в отношении вакцин против гриппа для использования в Южном полушарии в 2016 году и в северном полушарии в 2016-2017 гг.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень биологической безопасности (BSL) для следующего протокола BSL 2 для сезонных вирусов гриппа и BSL 3+ для потенциальных вирусов пандемического гриппа. Титрование вирусов требуется заранее нейтрализации эксперимента решать вирусную концентрацию вирусного контроля (ВК).

1. Вирус титрование

Примечание: В зависимости от количества вирусов и количества повторов, а плита может быть установлена со следующими гибкостям: (1) Вирусный разбавление может быть расположены вдоль либо строк или столбцов (рисунок 1). Каждый вирус должен занимать отдельную строку / столбец. (2) Вирусный приращение разбавления является гибким, но она должна начинаться с самой высокой концентрации вируса в верхнем левом углу. (3) Там нет ограничений на количество дублей.

ПРИМЕЧАНИЕ: Madin Darby почки собаки (MDCK) и MDCK-SIAT1 (SIAT) клетки были любезно предоставлены Dr. M. Матросович, Марбург, Гермногие 10. SIAT клетки MDCK клетки, стабильно трансфицированные человеческим CMP-N-acetylneuraminate: бета-галактозид α-2,6-сиалилтрансферазы ген для усиления экспрессии сиаловой кислоты (SA) α2-6Gal завершающиеся олигосахариды.

  1. Аликвотные достаточное количество клеток MDCK или клеток MDCK-SIAT 8 в 96-луночные планшеты (200 мкл / лунку). Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 2 -х или 3 -х дней , чтобы достичь слияния. Размножать клетки в DMEM, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка (FCS) и антибиотиков (100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина). Инкубируйте клетки Siat при температуре 37 ° С с 5% СО 2 и 1 мг / мл сульфата G418.
    Примечание: Коэффициент разбавления зависит от опыта и клеточной линии. Клеточный монослой должен быть конфлюэнтны (т.е. отсутствие клеточной стенки или видимый контур для MDCK клеток и плотно упакованной макет для клеток MDCK-SIAT1) в момент инокуляции вируса. Примеры разведений на основесубкультура сливных колб MDCK или MDCK-SIAT1 клеток приведены в таблице 1.
  2. Промыть клетки 3 раза с помощью 200 мкл среды для роста вируса (VGM) на лунку. Стерилизацию многослойный пластинчатый шайбу с 70% этанола в течение 30 мин, а затем промыть его в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) или ВГМ перед промывкой.
  3. Аспирируйте ВГМ и сразу же добавить 50 мкл ВГМ в каждую лунку.
  4. Добавьте 900 мкл ВГМ в каждой из 6 стерильные пробирки (или меньше, в зависимости от количества тестовых вирусов и дубликатах). Пипетировать 100 мкл вируса в первую пробирку, хорошо перемешать, и серийно разбавленных, меняя концы между каждым разведением. Повторите эти действия для каждого вируса титровать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это даст вирус разведений 10 -1 до 10 -6.
  5. Добавьте 50 мкл каждого вируса разведения, начиная с наибольшего разведения (1 х 10 -5 на рисунке 1), для дублированных скважин (столбцы 9 и 10 на рисунке 1) 96-луночный планшет.
  6. Поместите планшет при 37 ° С в течение 2-3 ч, чтобы дать вирусу инфицировать клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: от 2 до 3 ч инкубации необходимо убедиться, что вирусы в прививочного имеют достаточно времени, чтобы достичь монослой.
  7. Подготовьте накладку (10 мл / планшет)
    Примечание: Покрышка состоит из 5 мл 2 раза DMEM, трипсин (2 мкг / мл конечной концентрации), 20 мкл 1 мг / мл запас, и 5 мл целлюлозы хлопкового пуха (см список материалов).
  8. Удалите прививочный материал.
  9. Добавьте наложение (200 мкл в каждую лунку). Инкубируют в течение ночи при температуре 37 ° С, ненарушенной.
    Примечание: Вирус почкование происходит примерно через 4 часа, поэтому важно, чтобы пластина не нарушается после этого времени.
  10. Аспирируйте накладку из лунок.
  11. Добавить ледяной 4% параформальдегида в PBS А (200 мкл / лунку). Поместите их при температуре 4 ° С в течение 30 мин или при комнатной температуре в течение 20 мин.
    Примечание: PBS, А естественный рН-забуференный фосфатом физиологический раствор с 10 ходуе NaCl, 0,25 г KCl, 1,437 г Na 2 HPO 4, 0,25 г KH 2 PO 4 и 1 л дистиллированной воды (см список материалов).
    Примечание: параформальдегид вреден при вдыхании и может вызвать ожоги при попадании внутрь. Существует также ограниченные доказательства канцерогенного эффекта, и это может вызвать повышенную чувствительность при контакте с кожей.
  12. Аспирируйте параформальдегид и промыть пластины в два раза с PBS A (200 мкл / лунку).
  13. Хранить пластины в PBS А при 4 ° С для последующего использования, или продолжить выполнение следующих шагов.
  14. Добавить пермеабилизирующего буфера (100 мкл / лунку). Оставьте его при комнатной температуре в течение 30 мин.
  15. Промывают планшет дважды PBS A (200 мкл / лунку).
  16. Добавьте 50 мкл первого антитела, мышиное моноклональное антитело против гриппа типа А (1: 1000 в буфере) ELISA, в каждую лунку. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа (или 4 & deg; C в течение ночи), при встряхивании.
  17. Промыть ее 3 раза в 100 мкл промывочного буфера (0,05% твина 80 в PBS, A, об / об) рэр хорошо. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин между промывками. С другой стороны, промойте его в 3 раза без инкубации с использованием 300 мкл на лунку.
  18. Добавьте 50 мкл второго антитела, козьего антитела против мышиного IgG (H + L) конъюгат пероксидазы хрена (1: 1000 в ELISA-буфера), в каждую лунку. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, при встряхивании.
  19. Помойте его 3 раза, как описано в шаге 1.17.
  20. Добавляют субстрат (50 мкл / лунку). Выдержите при комнатной температуре в течение 30 мин или до развития синего цвета хорошо видна.
  21. Для остановки реакции, промойте пластину дважды 200 мкл дистиллированной воды на лунку, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 -3 мин между промывками.
  22. Высушите плиту и хранить ее в темном месте (например, завернуть в алюминиевую фольгу).

2. Титрование Количественный

  1. Поместите луночный планшет в области сканирования планшетного сканера, как показано на рисунке 2а. Используйте предельное положение L-формуобеспечить оптимальное и воспроизводимое расположение изображения.
    Примечание: Можно изображения двух луночных планшетах в одном сканировании.
  2. Сканирование изображения.
    Примечание: Параметры приведены в таблице 2.
  3. Запустите программу "Wellplate Reader" для расчета требуемой концентрации вируса (Рисунок 3).
    1. Нажмите кнопку "Загрузить изображение", чтобы загрузить изображение. Вставьте красную полосу в гистограмме на вкладке "Global Threshold" для регулировки порога выборки. Нажмите на кнопку "Обновить", чтобы изучить влияние на изображение.
    2. Установите флажок "Рассчитать Нейтрализация / Титрование". Нажмите кнопку "Sampling" для количественной оценки ПМС. Нажмите на кнопку "Сохранить" для сохранения результатов выборки при появлении соответствующего запроса.
      Примечание: После того, как процесс отбора проб, новое окно под названием "Нейтрализация и титрование Расчет" появляется автоматически, если флажок "Рассчитать Нейтрализация / Титрование" помечена.
    3. Загрузка или ввод карта определение хорошо пластины. Укажите пороговое значение (например, 30%) в "Титрование: Оптимальное популяции вируса (%)". Выберите вкладку "Титрование Process" для вычисления результатов титрования. Проверьте результаты титрования. Нажмите кнопку "Сохранить & Закрыть", чтобы сохранить результаты титрования.
      Примечание: Обратитесь к Дополнительной S1 для получения более подробной инструкции по программному обеспечению. Копия заказного программного обеспечения предоставляется по запросу.
      Примечание: Как правило, лучший вирус разбавления для анализа урожайности бляшек сокращения около 50% (20-85%) от общего числа ПМС клеток в каждую лунку 11.

3. Вирус Нейтрализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитать количество пластин, необходимых для анализа нейтрализации. Каждая пластина может разместиться один вирус и ряд сывороток.

Примечание: В зависимости от количества антисыворотки и числа повторов, а пластина может быть установлена ​​с гое следующие: гибкие (1) разведение сыворотки можно расположить вдоль любой строки или столбца (рисунок 4). Каждая сыворотка должна занимать отдельную строку или столбец. (2) Приращение разбавления сыворотки является гибким, но она должна начинаться с самой высокой концентрацией в сыворотке крови в верхнем левом углу пластины. (3) Количество дублей уравновешивает количество сывороток. Больше дубликатами может помочь сгладить экспериментальные варианты. (4) Количество ВК и количество контроля клеточного (CC) дубликатами являются гибкими, но они также должны быть в отдельных строках или столбцах. Ожидается, что количество VC дублей значительно больше, чем у антисыворотки.

  1. Подготовьте клеточный монослой, как на этапах 1.1-1.3, 2 или 3 дней.
  2. Добавляют 50 мкл ВГМ в каждую лунку планшета.
  3. Использование столбцов 11 и 12 для VC и CC, соответственно. Добавляют 50 мкл аликвоты 1:20 фермента, разрушающий рецепторы (RDE) -обработанной сыворотки к первому ряду (А) Columнс 1-10.
    Примечание: Для каждого вируса и сыворотки комбинации, анализ выполняется в двух экземплярах, так что одна пластина может, например, содержать один вирус испытаны против пяти антисыворотки.
  4. Выполните 2-кратных серийных разведений путем переноса 50 мкл из строки A к ряду H (столбцы 1-10 на рисунке 4) и отбрасывая 50 мкл из строки H.
  5. Добавьте 50 мкл разбавителя в каждую лунку колонки CC (колонка 12 на фиг.4).
  6. Добавляют 50 мкл вируса в каждую лунку планшета, за исключением столбца CC (Столбцы 1-11, Ряды AH на рисунке 4).
  7. Инкубируют при 37 ° С в течение 2-3 ч. Удалите прививочный материал. Добавьте накладку (200 мкл) в каждую лунку. Выдержите его в течение ночи при 37 ° C, ненарушенной. Фикс и окрасить пластины как для титрования вируса (шаги 1.11-1.22).

4. Нейтрализация Количественное

  1. Поместите луночный планшет в области сканирования планшетного сканера, как показано на FIGUповторно 2а. Используйте предельное положение L-образную форму, чтобы обеспечить оптимальное и воспроизводимое расположение изображения.
    Примечание: Можно изображения двух луночных планшетах в одном сканировании.
  2. Сканирование пластины, как описано в пункте 2.2.
  3. Запустите программу "Wellplate Reader" , чтобы вычислить необходимые вирусные титры (Рисунок 3, шаг 2.3).
    1. Нажмите кнопку "Загрузить изображение", чтобы загрузить изображение. Вставьте красную полосу в "Global Threshold" для регулировки порога выборки. Нажмите на кнопку "Обновить", чтобы изучить эффект.
    2. Установите флажок "Рассчитать Нейтрализация / Титрование". Нажмите кнопку "Sampling" для количественной оценки ПМС. Нажмите на кнопку "Сохранить" для сохранения результатов выборки при появлении соответствующего запроса.
      Примечание: После того, как процесс отбора проб, новое окно под названием "Нейтрализация и титрование Расчет" появляется автоматически, если флажок "Рассчитать Нейтрализация / Титрование" помечена.
    3. Загрузка или вход хорошо рв конце карты. Указывает порог (например, 50%) в "Нейтрализация: инфекции дедукции (%)."
    4. Выберите "процесс" нейтрализации для расчета титра. Проверьте титр и нажмите кнопку "Сохранить & Закрыть", чтобы сохранить результаты нейтрализации.
      Примечание: Нейтрализация сообщается в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки с предопределенным сокращения ПМС (например, 50% или 80%) по отношению к ВК (средним значением в столбце 11 на фиг.4). Сокращение ПМС 50% использовали в представительных результатов.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После вышеуказанных процедур, мы приведем некоторые результаты недавних антигенных экспериментов по характеристике. Установка титрование был разработан, чтобы изучить восемь входных вирусов, с двойными дублей для каждого разведения. Вирусные разведений тестировали в пределах от 1,0 × 10 -1 и 1,0 х 1,0 -6 охватить различия между вирусами. Тестовые вирусы из подтипа H3N2, в том числе A / Камерун / 15В-3538/2015, A / Владивосток / 36/2015, A / Москва / 103/2015, A / Томск / 5/2015 /, А / Москва / 101 / 2015, A / Москва / 100/2015, A / Москва / 133/2015 и A / Братислава / 437/2015. Результаты титрования показаны на рисунке 5. Рисунок 5d показывают снижение доли МСП с увеличением вирусной разведения. Кривые были нормализованы в отношении МСП тех же вирусов , которые давали инфекции во всех клетках в скважине 12 (определяется как ICP насыщением). Если ПМС не достигает насыщения с приветGhest концентрация вируса, средний ПМС из соответствующих дубликатами использовали вместо (А / Москва / 103/2015 г. Рисунок 5d). Вирус разведений , которые произвели 30% ПМС насыщения были выбраны в качестве вируса входного разбавления для нейтрализации (таблица 3).

Нейтрализация целью иметь вирус один вход против пяти антисыворотки, с двойными дублей на каждой пластине. Эталонный вирус показан H3N2 A / Стокгольм / 63/2015 года. Пять антисыворотки A / HK 4801/14 Яйцо F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Южная Африка R2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, и A / Dutch 525/14 SIAT F23 / 15. Результаты нейтрализации показаны на рисунке 6. Рисунок 6D показывает ход инфекции с увеличением разбавления сыворотки. Нормированная положительная популяция на вертикальной оси представляет собой отношение от МСП соответствующего ответа антисыворотки против среднего ПМСэталонного вируса 12. Фон ICP из неинфицированных контрольных клеток вычитали в процессе нормализации. Нейтрализация титры были определены в качестве обратных антисыворотки разведений , соответствующих 50% снижению ПМС (таблица 4). Линейная интерполяция была использована для оценки титра, попадающие между двумя соседними разведений сывороток.

figure-results-1
Рисунок 1: Пример подключения луночного планшета в вирусе титровании эксперимента. Вирусы Тестовые назначаются отдельным строкам (от А до Н). Колонки предназначены для различных вирусных разведений (от 1 до 12). Две колонны использовались в качестве дублей для каждого вирусного разведения. Шкала бар = 10 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 2: Схематическое изображение системы сканирования образца. (А) 96-луночного планшета на позиции формирования изображения планшетного сканера (переиздана из ссылки 11 с разрешения Elsevier BV), и (б) размеры предельного положения L-форму , показанную на стадии (а). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 3: Обои для рабочего диаграмма Количественное программного обеспечения "Wellplate Reader". Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 4: Пример установки хорошо пластины в нейтрализации эксперимента. Каждый антисыворотка назначен двум колонкам с дубликатами (от 1 до 10). Ряды предназначены для различных разведений сывороток (от А до Н). Контроль вируса занимает столбец 11, с восемью дубликатами (А11 до Н11). Контрольная ячейка находится в колонке 12, с восемью дубликатами (А12 до Н12). Шкала бар = 10 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 5: Результаты титрования эксперимента. (А) Установка хорошо пластины, (б) сканируется луночного планшета изображение, (с) иллюстрацияцветовой кодировкой, количественно, инфицированных вирусом клеток популяции, и (г) Нормализованный инфицированных вирусом популяций клеток против вируса разведений. 30% ПМС был использован в качестве порогового значения. Столбики ошибок в (г) являются стандартные отклонения (SD) от образца дупликации (± 1 SD). Шкала баров в (б) и (с) = 10 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 6: Результаты эксперимента нейтрализации. (А) установка луночного планшета, (б) отсканированы хорошо изображение пластины, (с) иллюстрация, количественно Зараженные вирусом популяции клеток, и (г) нормализуется вирус-инфицированных популяция клеток против разведения сыворотки. Вход VIрус (VC) является A / Стокгольм / 63/2015 года. 50% МСП использовали для расчета титра. Столбики ошибок в (г) являются стандартные отклонения (SD) от образца дупликации (± 1 SD). Шкала баров в (б) и (с) = 10 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный S1: Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот файл.

Типичное разведение
клетки MDCK Клетки MDCK-SIAT1
2 дня 1: 5 (1 + 4) 1:10 (1 + 9)
3 дня 1:20 (1 + 19)
Типичное количество клеток на мл
клетки MDCK Клетки MDCK-SIAT1
2 дня 2 х 10 5 1 х 10 5
3 дня 1 х 10 5 5 х 10 4
1:10 (1 + 9)

Таблица 1: Типичные разведения на субкультуры сливающихся колб MDCK или MDCK-SIAT1 клеток.

Режим Профессиональный режим
тип документа Фильм (с Film Guide Area)
Тип Автоматическая установка экспозиции Фото
Явозраст Тип 24-битный цвет
разрешение 1200 точек на дюйм
Сохраненный формат изображения TIFF

Таблица 2: Типичная установка планшетного сканера.

Ряд Вирус Рекомендуемое разведение
A / Cameron / 15V-3538/2016 1,0 х 10 -2
В А / Владивосток / 36/2015 1,0 × 10 -3
С A / Москва / 103/2015 1,1 х 10 -1
D A / Томск / 5/2015 5,9 х 10 -1
Е A / Москва / 101/2015 8,3 х 10 -1
F A / Москва / 100/2015 1,4 х 10 -2
г A / Москва / 133/2015 1,3 х 10 -2
ЧАС A / Братислава / 437/2015 1,3 х 10 -4

Таблица 3: Вирусные разведения , рассчитанные от населения 30% ПМС.

колонка Сыворотки Рекомендуемый титр
1 - 2 A / HK4801 / 2014 110
3 - 4 A / HK7295 / 2014 213,3
A / Южная Африка / R2665 / 2015 2155,8
7 - 8 A / Швейцария / 9715293/2013 89,4
9 - 10 A / Нидерланды / 525/2014 78,6

Таблица 4: Титры на 50% ПМС А / Стокгольм / 63/2015 против антисыворотки.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании мы описали формирования изображения на основе анализа MN, чтобы количественно оценить истинные антигенные отношения между вирусами. По сравнению с другими анализов доска снижение, метод измерения делает акцент ПМС целой скважины, обеспечивая полный охват инфекционном населения. Его независимость образования бляшек также расширяет применение анализа на вирусы, которые могут образовывать в основном невидимые маленькие бляшки или которые могут управлять только инфекцией одноклеточных. Таким образом, анализ способен изучения больше вирусов и эффектов более широкого спектра антител , чем HI, и это помогает более полно отражать антигенные сходства или различий между вирусами 12. Например, когда озельтамивир карбоксилат включен, анализ МН менее подвержена воздействию НС-зависимое связывание, что отражает антигенные различия более точно. Во время разработки анализа, были сделаны большие усилия для повышения согласованности эксперимента, скорость и обнаружениечувствительность, в том числе путем контроля входных вирусов через титрования, количественно изображения в высокой пропускной способности с помощью планшетного сканера, а также реализует удобную платформу для обработки данных. Результаты, как правило, согласуются с результатами и подтвердили те HI. Следует отметить, что результаты также показали антигенные различия между антигенных вариантов дрейфа последних вирусов типа А и вакцины B, а также антигенные изменения, вызванные культуры отобранных или спорадических изменений, таких как замена G155E в ГА1 некоторых A (H1N1) вирусов pdm09 12.

Протокол соответствовал тип вируса или подтип с выбором клеточных линий, которые дали самую сильную инфекцию, что значительно повысило сигнал формирования изображения. Экспериментальное изменение сглаживали с конструкцией дубликатами, что сбалансированное с числом протестированных сывороток. Неопределенности могут также исходить от качества изображения, которое в основном зависит от устройства формирования изображения. Приличное цветной планшетный сканер может Significantly улучшить контраст изображения и снизить уровень шума. Количество вируса в входного нейтрализации должна быть количественно определена заранее из соответствующего титрования в то время как вирусы по-прежнему поддерживать одинаковый статус. В процессе нейтрализации, реакция антисыворотки к инфекции нормализована по отношению к разнице между контрольным вирусом (VC) и фонового уровня (CC). Точные измерения VC и CC имеют важное значение для нейтрализации эксперимента. Более дубликатами рекомендуется (восемь дубликатами были использованы в представительных результатов). И, наконец, понимание программного обеспечения имеет жизненно важное значение для успеха эксперимента. Программное обеспечение было протестировано для рутинной характеризации вирусов в центр по гриппу ВОЗ, Великобритания в течение более двух лет. Подробные инструкции по работе с различными ситуациями предусмотрено в дополнительном S1.

Этот MN анализ подходит для применений, где образцы покрывают собой добremely большое поле зрения, но требуют лишь умеренного разрешения изображения. Низкая стоимость и простота установки делают систему доступной для большинства вирусологических лабораториях. Разброс измерений одного и того же образца составляла менее 3%, что примерно определяет неопределенности , вводимой во время сканирования 11. Такая воспроизводимости достаточно во многих исследованиях вирусологии и может быть дополнительно уменьшена путем усреднения изображений с использованием нескольких циклов сканирования.

В заключение, данное исследование демонстрирует надежный анализ MN, который может быть широко используется при антигенной исследовании и поддерживать данные HI в детальном анализе в настоящее время циркулирующих вирусов гриппа, в частности, за два раза в год отбора вирусов для включения в вакцины гриппа человека.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят доктора М. Матросовича за предоставление родительских клеточных линий MDCK и MDCK-SIAT1 и компанию Roche Pharmaceuticals за поставку карбоксилата осельтамивира. Мы также благодарны доктору Энн Уэстон за ценные предложения по рукописи. Это исследование зависело от ценного сотрудничества между Национальными центрами ВОЗ по гриппу и КЦ ВОЗ в рамках ГСЭГО ВОЗ, которые предоставили используемые вирусы гриппа. Эта работа финансировалась Советом по медицинским исследованиям в рамках Программы U117512723.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
VGMSigmaD6429, P0781500 мл DMEM+5 мл Pen/Strepb
PBS ANature pH Фосфатно-солевой буфер: NaCl 10  г, KCl 0,25  г, Na2HPO4 1,437 г, KH2PO4 0,25 г, и Dist. Water 1 л.
AvicellFMCRC-581F2,4 г в 100 мл дистиллированной воды растворить перемешиванием на магнитной мешалке в течение 1 ч. Стерилизовать автоклавированием.
2x DMEMGibco 21935-028
ТрипсинСигмаТ1426
Оверлей (10 мл/планшет):5 мл 2x DMEM, Трипсин 2  μ г/мл конечной концентрации, Avicell 5  мл
Тритон Х- 100<суп>еСигма T8787Буфер для пермеабилизации: 0,2% в PBS A (v/v)
Твин 80SigmaP5188Буфер для промывки: 0,05% Tween 80 в PBS A (v/v)
Лошадиная сывороткаPAA Labs LtdB15-021Буфер для ИФА: 10% в PBS A (v/v) + 0,1% Tween 80
Мышиный MAb против гриппа типа ABioradMCA 4001st Антитела: 1:1,000 в ИФА Буфер
Козий антимышиный IgG (H+L) HRP конъюгатBiorad172-10112nd Антитело: 1:1,000 в ИФА Буфер
True Blu пероксидазный субстратKPL 50-78-02Подложка: Истинный синий +0,03% H2O2g (1:1,000 30% раствора)
96-луночные плоскодонные микротитровые пластиныCostar 3596
8-канальная многостенная пластинчатая шайба и коллекторSigmaM2656
Perfection Plate ScannerEpsonV750 ProПрограммное обеспечение для работы с изображениями можно бесплатно загрузить с http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134& infoType=Загрузки.
Операционная среда программного обеспечения: Окно LabVIEWNational Instruments Corporationна основе NI Vision BuilderВерсия: LabVIEW2012 или выше

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walker, D. L., Horsfall, F. L. Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses. J Exp Med. 91, 65-86 (1950).
  2. Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology. 289, 74-85 (2001).
  3. Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment. J Virol. 84, 6769-6781 (2010).
  4. Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection. J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).
  5. Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).
  6. Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).
  7. Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro. J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).
  8. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3, 63-70 (2006).
  9. Comley, J. High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis. Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).
  10. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).
  11. Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).
  12. Lin, Y. P., et al. Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micro neutralization AssayInfluenza VirusVirus TitrationAntibody NeutralizationAntiviral ActivityFlatbed Scanner ImagingHigh throughput ImagingViral Antigenic StudiesVirus DilutionInfected Cell Population

Related Articles