Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Гистологическое Количественное хронического инфаркте миокарда у крыс

15.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54914

⸱

11 декабря 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Cardiology, Department of Medicine, University of Fribourg

В этой статье

Краткое содержание

Посмертная оценка инфаркта миокарда (ИМ) у грызунов основана на количественной оценке инфаркта на окрашенных срезах сердца. Мы описываем точный метод количественной оценки размера инфаркта с использованием систематического отбора проб собранных сердец крыс от основания до верхушки и анализа изображений гистологических срезов, окрашенных трихромом.

Аннотация

Инфаркт миокарда определяется как гибель кардиомиоцитов из-за длительной ишемии; воспалительная реакция и образование рубцов (фиброз) следуют за ишемическим повреждением. После начальной острой фазы хроническое ремоделирование левого желудочка (ЛЖ) изменяет структуру и функцию сердца. Постоянное коронарное лигирование у мелких животных широко используется в качестве эталонной модели для хронической модели ИМ. Истончение инфарктной стенки постепенно развивается до трансмурального фиброза. Обычно проводится гистологическая оценка размера инфаркта; Тем не менее, стандартизация методов количественной оценки отсутствует. Действительно, важные методологические аспекты, такие как количество анализируемых разделов и методы выборки и количественной оценки, обычно не описываются и, следовательно, исключают сравнение между исследованиями. Слишком часто количественная оценка проводится на одном участке, полученном на уровне сосочковых мышц. В связи с тем, что в настоящее время изучаются новые стратегии, направленные на уменьшение расширения и ремоделирования инфаркта, существует важная потребность в стандартизации точных протоколов отбора проб сердца. Мы описываем точный метод количественной оценки размера инфаркта с использованием систематической выборки собранных сердец крыс и анализа изображений гистологических срезов с трихроматическим окрашиванием, полученных от основания до верхушки. Мы также предоставляем доказательства того, что расчет индекса расширения (EI) позволил оценить размер инфаркта с учетом изменений левого желудочка на протяжении ремоделирования.

Введение

Инфаркт миокарда (ИМ) является ведущей причиной смерти и инвалидности во всем мире. Ишемическая болезнь сердца является основной причиной; MI приводит к ишемии последовательных коронарных событий, таких как окклюзии. Когда реперфузионного не выполняется в течение первых 6 ч, ишемия вызывает необратимый некроз миокарда. У пациентов, характеристика инфаркта миокарда зависит от различных диагностических инструментов, включая клинические признаки, электрокардиографии, оценка плазменных уровней биомаркеров, эхокардиография, МРТ и гистологического анализа 1. Острые и хронические MI классифицируются как две разные фазы травмы в зависимости от сроков некроза миокарда относительно времени окклюзии коронарной артерии. Острая фаза, происходит в течение первых 7 дней, связано с потерей кардиомиоцитов, обширные воспаления, а также набора фибробластов. Подострой фазы, характеризуется заживлению сердечной ткани и формирование рубца, происходитот 1 до 4 - 6 недель. Расширение инфарктом, желудочек утонением стенки и дилатацией желудочков характеризуют хроническую фазу. Обширный ремоделирования левого желудочка прогрессивно приводит к тяжелой сердечной недостаточности 2.

М. И. индуцированное постоянным левой передней нисходящей артерии (LAD) перевязки представляет собой стандартную модель грызуна хронического инфаркта миокарда. Коронарные лигатур подражает коронароокклюзии. Размер инфаркта зависит от места лигатуры. Характеристика миокарда ишемического повреждения в модели грызуна классически осуществляется с использованием плазменных уровней биомаркеров, таких как тропонин I и Т 3, эхокардиография, МРТ, гистологии и 4,5. уровни биомаркеров коррелируют со степенью смерти кардиомиоцитов. Эхокардиография оценивает нарушения функции левого желудочка в результате региональных аномалий движения стенки. Кроме того, неинвазивных методов визуализации, таких как МРТ или высокого разрешенияэхокардиография, позволяют оценивать сокращения движения стенки, объем области рубца с пониженной перфузией и жизнеспособного миокарда, а также утонением стенки. Размеры LV позволяют точную оценку размера инфаркта. И, наконец, определение количества жизнеспособных и мертвую миокарда может быть выполнена с использованием специфических вскрытие пятна гистологических срезов добываемых сердца и позволяет проверить размер инфаркта (ИР). Еще одной важной особенностью является оценка индекса расширения инфарктов (EI) 6. ЭИ связан с трансмурального инфаркта и начинается в течение первых 3-х дней. EI характеризуется прогрессирующим уменьшением толщины стенки, увеличение размеров полости ЛЖ, и последующие изменения в форме ЛЖ.

Для оценки терапевтической эффективности новых методов лечения - в частности, регенеративные стратегии на основе клеток, матриц, и ген-доставки точная оценка ИМ у грызунов имеет первостепенное значение.При измерении на одном поперечном сечении, полученной на уровне папиллярных мышц, размер может быть неточными в связи с большой изменчивостью, которая существует в развитии инфаркта следующие ЛАД перевязки; апекс Инфаркт может быть затем затемнена. Важно отметить, что более точные методологии для определенной размера MI были описаны для мышей или крыс 7-9 10. Тем не менее, IS недостаточно для точного количественного определения ремоделирования ЛЖ или терапевтически индуцированные сокращения (или) предупреждения ремоделирования. В самом деле, обычно выражается в процентах от общего объема ЛЖ, оцениваемой сечениях сердца. Хотя этот метод действует для острого инфаркта миокарда, истончение стенки ЛЖ , произошедшей в ходе ремоделирования остается под оценивали 11,12. Полный морфометрического Количественное размера инфаркта и структурных изменений следует провести количественную оценку нескольких параметров, таких как эндокарда и эпикарда длины и диаметра, а также инфаркту и здоровых районов. Описан методологический провертренере, чтобы точно оценить ИМ и ремоделирования в хронической крысиной модели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные получали гуманного ухода в соответствии с Европейской конвенцией по уходу за животными. Хирургические процедуры были выполнены в соответствии с Законом о швейцарской охране животных после получения разрешения Государственной ветеринарной службы, Фрибург, утвержденным Швейцарского Федерального ветеринарного бюро, Швейцарии.

1. Сердце Уборочная

ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические вмешательства проводились под анестезией изофлуран. Были предприняты усилия, чтобы уменьшить страдания животных. В частности, все животные получали подкожную инъекцию 0,1 мг / кг бупренорфина предоперационного. Хирургический протокол для индуцирования инфаркта миокарда был описан ранее в другом месте 13.

  1. Выполните стернотомию на myocardially инфарктом животных под наркозом (интубированного животное, 2,5% изофлуран, собственно анестезии подтверждается лапой пинч рефлекса).
    1. Открыть животное путем резки кожи, а затем мышцыс хирургическими ножницами. Нарезать ребра слева и справа, а затем удалить грудь.
    2. Удалите спаек оставшиеся после предыдущей операции (ЛАД лигирования). Вырезать аорту и удалить сердце. Поместите ткань в 1 М KCl (в PBS), а затем промыть его с PBS.

2. Подготовка ткани

  1. Поместите инфарктом сердца в продольном направлении в акриловой матрице сердца крысы. Хранить ее при -20 ° С в течение 1 часа.
  2. Вырезать сердце непосредственно в матрице, используя лезвие бритвы с поперечно. Убедитесь, что каждый ломтик толщиной 2 мм. Вырезать приблизительно 5 - 7 слайдов для каждого сердца (на основе уровня ремоделирования); это называется систематический отбор.
  3. На этом этапе выполнения окрашивания 2,3,5-трифенилтетразолий (TTC) является необязательным (сохранить ориентацию срезов сердца основанием к вершине).
    1. Выдержите в 1% ТТС в PBS в течение 50 мин при 37 ° С. Выдержите его в 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин до 1 ч. Положите секции betweeп две стеклянные пластины с 2-мм прокладками и снимать с стереологического микроскопа в сочетании с камерой при 15X увеличении.
      ВНИМАНИЕ! Параформальдегид является токсичным.
  4. Slide заморозка (1 - й вариант)
    1. Поместите каждый слайд в пластиковые формы (10 х 10 х 5 мм) с монтажной средой для cryotomy (оптимальная температура резания, ОКТ), сохранить ориентацию (поместите апекс-ориентированной стороне секции вниз на дно формы). Замораживание блоки с парами 2-метилбутан под жидким азотом охлаждения в течение 10 - 15 мин. И, наконец, хранить ткань при температуре -80 ° С.
  5. Paraffinization (2 - й вариант)
    1. Поместите каждый слайд в встраивание кассеты (поддерживать ориентацию путем размещения апекс-ориентированной стороне секции вниз на нижней части кассеты), а затем в 4% PFA в течение 24 часов. Положите его в машине на ночь процессор ткани.
      1. Выдержите его в этаноле 70% в течение 2 часов. Выдержите его в Этанол 95% в течение 2 часов. Выдержите его в этаноле на 100% в течение 3 часов. Выдержите его в ксилоле в течение 4 часов. Выдержите его в парафин (расплавленной при 60 ° С в печи) в течение 5 часов. И, наконец, сделать блоки путем встраивания каждого сердца слайд в парафин.

3. Массон-Гольднер трехцветный Окрашивание

  1. Сделать срезы ткани из парафиновых блоков с ручным микротома (толщина: 5 мкм) или из ОКТ блоков с криостат установлен до -18 ° С (толщина: 7 мкм).
  2. Пятно один слайд из каждого сердца части для каждой крысы (3 - 4 поперечных срезов на слайде) с Массон-Goldner трехцветный окрашивания (см . Приложение)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с этого шага для парафиновых срезов.
    1. Растопить слайды при 60 ° С в печи. Под вытяжкой, deparaffinize их в ксилоле два раза в течение 10 минут каждый. Увлажняет их в 100% этаноле, 95% этанола, 70% этанола и дистиллированной воде в течение 3 минут каждый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с этого шага для cryosections.
    2. Закрепите их в растворе на ночь Bouin. Затем промойте их в проточной водопроводной воде в течение 10 - 15 мин. Промыть их в дистиллированной воде. Выдержите их в гематоксилином Майера в течение 3 мин.
    3. Удалить слайды и оставить их в дистиллированной воде в течение 5 мин. Затем, инкубировать их в кислой фуксин-пунцовый в течение 5 мин. Промыть их в 1% -ной уксусной кислоты в течение 1 мин.
    4. Затем, инкубировать их в фосфорно кислоты Оранжевый G в течение 1 мин. Промыть их в 1% -ной уксусной кислоты в течение 1 мин, инкубировать их в светло-зеленого красителя в течение 10 мин, и полоскание их в 1% -ной уксусной кислоты в течение 1 мин.
    5. Высушить их в 70% этаноле (30 сек), 95% этанола (30 сек), и 100% этанола (5 мин). Положите одну каплю смолистым монтажной среды на срезах тканей, покрывают их покровные, и дайте им высохнуть.

4. Инфаркт Размер Анализ

  1. Приобретайте одно изображение из каждого слайда на стереомикроскопа (15x увеличение) в сочетании с камерой. Сфотографировать линейку с той же настройкойs.
  2. С помощью программного обеспечения для анализа изображений для измерения толщины рубец в середине инфарктом, толщина перегородки, области полости левого желудочка (ЛЖ), области инфаркта, а также область ткани левого желудочка с использованием.
    1. Установите шкалу с линейкой изображения (рисунок 1А).
      1. Нажмите по измерениям затем выберите Set Коэффициент преобразования. Нарисуйте линию на панели калибровки. Щелкните правой кнопкой мыши на картинку и нажмите на End калибровки. Обратите внимание на значение бар, а затем нажмите кнопку OK.
    2. Выберите LV из окрашенного сердца картины (рис 1B). Используйте Multiple инструмент сегмента. Выберите точку за точкой левого желудочка, а затем щелкните правой кнопкой мыши Копировать / Вставить в любом месте.
    3. Измерьте толщину рубца и перегородку с помощью инструмента измерения одного сегмента (рис 1C ).
    4. Автоматическое определение LV полости, инфаркт, и LV областей с помощью инструмента автоматического измерения площади в режиме RGB (Рисунок 1D).
      1. Нажмите на инструмент. Активировать только границы и Прилежащей в режиме RGB. Наконец, щелкните внутри области, представляющей интерес для его обнаружения. При необходимости, используйте точных инструментов.
  3. Вычислить размер инфаркта, как отношение площади инфаркта к площади ЛЖ.
  4. Вычислить индекс расширения следующим образом: [площадь полости ЛЖ / вся область LV] / [толщина инфаркта / толщина перегородки], со всей области ЛЖ, включая как полости ЛЖ и областей ткани ЛЖ.
  5. И, наконец, вычислить «средний» для каждого сердца следующим образом: [среднее значение индекса расширения с инфарктом слайдов] * [Количество инфарктом слайдов / общее количество слайдов].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Через шесть недель после ЛАД лигирования, сердца собирали из крыс Льюиса. Срезы ткани 2-мм были получены от вершины до основания. TTC процедура окрашивания была выполнена для визуализации области инфаркта, который появляется в белом цвете, а здоровый миокард, который отображается красным цветом (Рисунок 2). В зависимости от места перевязки ЛАД, размер инфаркта изменяется. При больших ИМ, наблюдались трансмуральных инфаркты от вершины до основания (Рисунок 2А).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги в рамках Протокола

Фиброзной ткани могут быть точно оценены в хронической крысиной модели MI с использованием систематической выборки собранного сердца и образа анализа трехцветных окрашенных гистологических срезов, полученных от основания к вершине. Два шага особенно важны для успешной реализации протокола. Во-первых, использование KCl для уборки сердца позволяет сердечной мышцы, чтобы поддерживать в ненапряженном состоянии. Этот шаг важен ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследование было поддержано Швейцарским национальным фондом [SNF 310030-149986 to MNG], Университетом Фрибурга и больницей Фрибурга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Акриловая матрица сердца крысы 2 мм72-5015Harvard Appartus
Inspira усовершенствованный аппарат искусственной вентиляции легких с регулируемым объемомАппарат557058
катетером Insyte 14 GBD381267
VWR
TTCT8877-10GSigma Aldrich
Mayer гематоксилинMHS32-1LСигма Олдрич
Кислота фуксин<бр/> CI 42685F8129-50GСигма Олдрич
Понсо Ксилидин<бр/> CI 16150P2395-25GСигма Олдрич
Оранжевый G
CI 16230		O3756-100GСигма Олдрич
Светло-зеленый<бр/> CI 42095L5382-25GСигма Олдрич
KClP9333-500GСигма Олдрич
Ксилол10315083HoneyWell
Абсолютный этанол10303990HoneyWell
2-метилбутанM32631-1LСигма Олдрич
Стереографический микроскопSM2800Формальдегид Nikon
99340Reactolab
Встраиваемая кассетаK113.1Carl Roth
Bersoft Программное обеспечениедляЛицензионное программное обеспечение
O.C.T BDHA361603E измерения изображений Bersoft.com

Ссылки

  1. Amsterdam, E. A., et al. AHA/ACC Guideline for the Management of Patients with Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 64, e139-e228 (2014).
  2. Konstam, M. A., Kramer, D. G., Patel, A. R., Maron, M. S., Udelson, J. E. Left ventricular remodeling in heart failure: current concepts in clinical significance and assessment. JACC Cardiovasc Imaging. 4, 98-108 (2011).
  3. Frobert, A., et al. Prognostic Value of Troponin I for Infarct Size to Improve Preclinical Myocardial Infarction Small Animal Models. Front Physiol. 6, 353(2015).
  4. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17, 268-272 (2012).
  5. Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, 2996-3006 (2014).
  6. Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117, 1388-1396 (2008).
  7. Valente, M., et al. Optimized heart sampling and systematic evaluation of cardiac therapies inmouse models of ischemic injury: Assessment of cardiacremodeling and semi-automated quantification of myocardial infarctsize. Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 359-391 (2015).
  8. Csonka, C., et al. Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 163-170 (2010).
  9. Zornoff, L. A., Paiva, S. A., Minicucci, M. F., Spadaro, J. Experimental myocardium infarction in rats: Analysis of the model. Arq. Bras Cardiol. 93, 434-440 (2009).
  10. Lichtenauer, M., et al. Myocardial infarct size measurement using geometric angle calculation. Eur J Clin Invest. 44, 160-167 (2014).
  11. Lutgens, E., et al. Chronic myocardial infarction in the mouse: cardiac structural and functional changes. Cardiovasc Res. 41, 586-593 (1999).
  12. Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, L., Giraud, M. N. Cell-based therapy for heart failure in rat: double thoracotomy for myocardial infarction and epicardial implantation of cells and biomatrix. J Vis Exp. , e51390(2014).
  13. Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. J Appl Physiol (1985). 102, 2104-2111 (2007).
  14. Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101, 593-600 (1981).
  15. Weisman, H. F., Bush, D. E., Mannisi, J. A., Weisfeldt, M. L., Healy, B. Cellular mechanisms of myocardial infarct expansion. Circulation. 78, 186-201 (1988).
  16. Mannisi, J. A., Weisman, H. F., Bush, D. E., Dudeck, P., Healy, B. Steroid administration after myocardial infarction promotes early infarct expansion. A study in the rat. J Clin Invest. 79, 1431-1439 (1987).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Инфаркт миокардаколичественное определение размера инфарктасистематический забор проб сердцатрихромное окрашиваниеанализ изображенийрасчет индекса расширенияремоделирование левого желудочкамодель сердца крысыгистологическое секционированиеокрашивание ТТХ
Гистологическое Количественное хронического инфаркте миокарда у крыс
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.