Методическая статья

Хондрогенный Дифференциация Индукционная полученных из жировой ткани стволовых клеток под действием центробежной силы тяжести

DOI:

10.3791/54934

⸱

24 февраля 2017 г.

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Механическое воздействие может вызвать хондрогенную дифференцировку стволовых клеток, обеспечивая потенциальный терапевтический подход для восстановления поврежденного хряща. Мы представляем протокол индуцирования хондрогенной дифференцировки стволовых клеток жировой ткани (ASC) с использованием центробежной гравитации (CG). Индуцированная компьютерной графикой апрегуляция SOX9 приводит к развитию хондрогенных фенотипов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поврежденный хрящ не может зажить естественным путем. В настоящее время наиболее совершенной терапией дефектов хряща является трансплантация хондроцитов, дифференцированных из стволовых клеток, с использованием цитокинов. К сожалению, цитокин-индуцированная хондрогенная дифференцировка является дорогостоящей, трудоемкой и связана с высоким риском контаминации во время дифференцировки in vitro. Тем не менее, биомеханические стимулы также служат важнейшими регуляторными факторами для хондрогенеза. Например, механический стресс может индуцировать хондрогенную дифференцировку стволовых клеток, что предполагает потенциальный терапевтический подход для восстановления поврежденного хряща. В этом исследовании мы продемонстрировали, что центробежная гравитация (CG, 2400 × g), механическое напряжение, легко применяемое центрифугированием, индуцировала активацию определяющей пол области Y (SRY)-бокс 9 (SOX9) в стволовых клетках жировой ткани (ASC), заставляя их экспрессировать хондрогенные фенотипы. Центрифугированные ASC экспрессировали более высокие уровни маркеров хондрогенной дифференцировки, таких как аггрекан (ACAN), коллаген типа 2 альфа 1 (COL2A1) и коллаген типа 1 (COL1), но более низкие уровни коллагена типа 10 (COL10), маркера гипертрофических хондроцитов. Кроме того, в центрифугированных АСК наблюдалось образование хондрогенных агрегатов, являющееся предпосылкой для хондрогенеза.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дефекты в суставном хряще не заживают естественным образом. Следовательно, трансплантации стволовых клеток была предложена в качестве перспективного подхода для ремонта нарушенного хряща. Тем не менее, этот метод требует как приобретение достаточного количества стволовых клеток и индукции этих клеток к дифференцировке хондрогенное. Костный мозг (ВМ) широко используется в качестве источника стволовых клеток, но изоляция клеток из ВМ имеет два основных недостатка: инвазивность и недостаточная урожайность. Из-за своей легкости приобретения, жировая ткань является предпочтительным источником стволовых клеток. Предыдущие исследования показали возможность выделения стволовых клеток из жировой ткани и вызывая хондрогенное дифференцировки в этих клетках с использованием цитокинов, таких как TGF & beta ; 1-1, 2. Эти методы являются эффективными, но дорогими.

В качестве альтернативы меньшей стоимости на цитокины, механическое напряжение, может быть использован дляиндуцируют хондрогенный дифференциации. Механическая нагрузка играет важную роль в поддержании здоровья суставном хряще 3, и это может вызвать хондрогенное фенотипы в различных клетках. Например, гидростатическое давление вызывает хондрогенное фенотипы в синовиальной оболочке , полученных клеток - предшественников с помощью МАР - киназы / JNK пути 4, и механическое сжатие вызывает хондрогенез в человеческих мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с помощью повышающей регуляции генов chondrocytic 5. Кроме того, напряжение сдвига способствует экспрессии хондрогенезе связанных с внеклеточным матриксом (ECM) в человеческих ПКЦ 6. Центробежная сила тяжести (CG), легко наносится и под контролем механического напряжения генерируется путем центрифугирования, может вызывать дифференциальную экспрессию генов в клетках 7. Например, в клетках карциномы эпителия легких, экспрессия интерлейкина (IL) -1B позитивно регулируется с помощью центрифугирования 8. Therefore, как экспериментально индуцибельной механических напряжений, CG может быть использован для индукции chondrocytic экспрессии генов в стволовых клетках. Тем не менее, остается неясным, может ли CG вызвать хондрогенный дифференцировки стволовых клеток.

В этом исследовании мы обнаружили, что CG индуцирует повышающую регуляцию SOX9, мастер-регулятор хондрогенезе, в человеческих ИСС, что приводит к избыточной экспрессии генов chondrocytic. Кроме того, мы сравнили эффекты CG на хондрогенезе с теми TGF- 1, фактор роста наиболее часто используется , чтобы вызвать в пробирке хондрогенез в стволовых клетках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол исследования был одобрен этическими комитетами католического университета Кореи (KC16EAME0162) и осуществляется в соответствии с руководящими принципами NIH. Все ткани были получены с письменного информированного согласия.

1. Центробежные силы тяжести Загрузка и пеллетах Культура

  1. Клеточные культуры и урожай
    1. Культура ИСС (Р2-Р3, см список материалов) в модифицированной среде низкой глюкозы Дульбекко Eagle (DMEM-LG), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S) при 37 ° C в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
    2. Когда клетки достигают 80% сплошности, отбрасывать среды и промыть клетки с 5 мл 1х фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
    3. Добавить 1 мл PBS , содержащего 1 мМ ЭДТА и инкубировать в течение 2 мин при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
    4. Нажмите на культуральную пластину осторожно, добавить 4 мл свежей среды, передают клеткамконическая трубка 15-мл, и центрифуга клетки при 250 х г в течение 2 мин при комнатной температуре (RT).
  2. Центробежная сила тяжести нагрузки
    1. После центрифугирования (этап 1.1.4), удалить супернатант, не нарушая гранул и ресуспендируют осадок в 10 мл DMEM-LG с добавлением 10% FBS. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
    2. Для CG нагрузки, передача 2,5 × 10 5 клеток в новую коническую пробирку и центрифугировать 15 мл при 2400 х г в течение 15 мин.
  3. Пелле культура
    1. Сразу же после центрифугирования, аспирация супернатант и добавляют 500 мкл определенной среде хондрогенный дифференцировки (МЧР, DMEM с высоким глюкозы с добавлением 1% FBS, 1% ITS + премикс, 100 нМ дексаметазона, 1x MEM несущественные аминокислотного раствора, 50 мкг / мл L-пролина, и 1% пенициллина / стрептомицина). Добавить 50 мкг / мл свежеприготовленного L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата при каждой смены среды. В качестве положительного контроля, вызывают хондрогенный differentiatiна в uncentrifuged клетках путем добавления МЧР, содержащий 10 нг / мл TGF- 1.
    2. Поместите неполностью закрываютс крышкой , пробирки , содержащие гранулы в стоячем положении и инкубировать при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
    3. Изменение носителя через день в течение 3-х недель.
  4. Micromass культура
    1. Сразу же после центрифугирования (этап 1.2.2; 2400 & bull; g в течение 15 мин), аспирата супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мкл МЧР.
    2. Чтобы сформировать Micromass, поместите ресуспензированной клетки в центре лунки 24-луночного планшета.
    3. Через 2 ч, осторожно добавляют 1 мл CDM к колодцу, пипеткой к стенке пластины, чтобы избежать срыве Micromass. В качестве положительного контроля, выполнить Micromass культуру с uncentrifuged клеток путем добавления CDM, содержащий 10 нг / мл TGF- 1.
    4. Выдержите Micromass при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
    5. Изменение среды эвERy день в течение 3-х недель.

2. обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции (RT-PCR) для обнаружения транскрипционные повышающую регуляцию хондрогенный Дифференциация Маркеры

  1. На 14-й день, используйте пипетку для переноса сфероидами гранул в новую 1,5-мл пробирку и промойте их в 1x PBS.
  2. Извлечение общей РНК из гранул с использованием гуанидина тиоцианата-фенол-хлороформ метод 9 экстракции.
  3. Синтеза кДНК из 2 мкг тотальной РНК с использованием обратной транскриптазы в соответствии с протоколом производителя (инкубировать при 42 ° С в течение 1 ч, а затем инактивации фермента при температуре 70 ° С в течение 5 мин).
  4. Выполните ПЦР с использованием праймеров , специфичных для хондрогенными маркеров дифференцировки 10.

3. Окрашивание для обнаружения сверхэкспрессии хондрогенный Дифференциация маркерных белков

  1. Парафин-встраивание гранулы клеток
    1. На 21-й день,использовать пипетку для сбора сфероидами гранул и мыть их с 1x PBS.
    2. Закрепить сфероидами гранул путем погружения в 4% параформальдегида в течение 24 ч.
      Внимание: параформальдегид очень токсичен. Избегать попадания в глаза, на кожу или слизистые оболочки. Сведение к минимуму воздействия и избегать вдыхания во время приготовления. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.
    3. Выбросьте закрепитель и промыть гранулы клеток деионизированной водой (DW).
    4. Поместите один слой марли на кассету и передавать неподвижные гранулы с помощью пипетки. Покрытие гранул путем складывания марлю и закройте крышку кассеты.
    5. Высушить гранул.
      1. Погружают гранулы в 70% этаноле (EtOH) в течение 5 мин при комнатной температуре.
      2. Погружают гранул в 80% этанола в течение 5 мин при комнатной температуре.
      3. Погружают гранул в 95% этанола в течение 5 мин при комнатной температуре.
      4. Погружают гранул в 100% EtOH в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите дважды.
      5. Погружают гранул в 100% ксилола в течение 15 мин при комнатной температуре. Повторить Twiсе.
    6. Встраивание фиксированных гранул клеток в парафин при температуре 56 ° С в пресс-форме; гранулы могут быть встроены в парафин с использованием специализированных систем автоматизированной обработки тканей.
    7. Вырезать 5 мкм срезы толщиной от залитой в парафин клеточного осадка с помощью роторного микротома.
    8. Поплавок секции в 50% этанола, а затем передавать их на водяной бане при 50 ° C с использованием слайд.
    9. Поместите плавающие разделы на слайдах.
  2. Safranin O и Альциановый голубое окрашивание
    1. Увлажняет секции парафина.
      1. Погрузите слайды в ксилоле в течение 15 мин. Повторите дважды.
      2. Погрузитесь слайдов в 100% EtOH в течение 5 мин. Повторите дважды.
      3. Погрузитесь слайдов в 90% этанола в течение 5 мин.
      4. Погрузитесь слайдов в 80% этанола в течение 5 мин.
      5. Погрузитесь слайдов в 70% этанола в течение 5 минут, а затем промойте их в 1x PBS.
    2. Пятно регидрировали секций с 1% -ным раствором Safranin O и 3% Альциановый синий для30 минут.
    3. Выбросьте окрашивание раствора и промойте участки с DW.
    4. Пятно секции с раствором гематоксилин / эозином (контрастное) в течение 1 мин.
    5. Выбросьте окрашивание раствора и промойте участки с DW.
    6. Поместите каплю монтажа среды на покровным после удаления остаточной воды. Осторожно поместите слайд (ячейка стороной вниз) на покровное содержащей монтажную среду.
    7. Разрешить слайды высохнуть в течение 2-3 ч при комнатной температуре.
    8. Захват изображений с использованием светлого поля микроскопа (автоматизированный прямой микроскоп, 50X и 200X).
  3. иммунофлюоресценции
    1. Увлажняет секции, как описано в разделе 3.2.1.
    2. Погрузитесь слайдов в цитрат натрия буфера (10 мМ цитрат натрия, 0,05% Tween 20, рН 6,0), а затем поддерживать их при температуре к югу от кипячения в течение 10 минут с использованием микроволновой печи.
    3. Охладить слайды в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем промойте их с водопроводной водой.
    4. Инкубируйте слайды в 3%H 2 O 2 (в 1X PBS) в течение 15 мин, а затем промыть их проточной водой в течение 15 мин 11.
    5. Блок слайды с блокирующим буфером (10% нормальной козьей сыворотки в PBS) в течение 1 ч.
    6. Аспирируйте блокирующий раствор, а затем применить первичное антитело, разбавленное с 5% нормальной козьей сыворотки на слайдах.
    7. Инкубируйте слайды в течение ночи при температуре 4 ° С.
    8. Вымойте слайды три раза в 1x PBS в течение 5 минут каждый.
    9. Инкубируйте слайдов в флюорохром-конъюгированные вторичного антитела, разбавленного 5% нормальной козьей сывороткой в ​​течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
    10. Вымойте слайды три раза в 1x PBS в течение 5 минут каждый в темноте.
    11. Инкубируйте слайдов с использованием DAPI (1 мкг / мл) в течение 10 мин, а затем промыть их два раза в 1X PBS в течение 5 мин каждый.
    12. Поместите каплю монтажа среды на покровным после удаления остаточной воды. Осторожно поместите слайд (ячейка стороной вниз) на монтажной среде.
    13. Разрешить слайды высохнуть в течение 2-3ч в темноте при комнатной температуре.
    14. Визуализируйте слайды с помощью флуоресцентной микроскопии (Rhod: 594 нм, DAPI: 340 нм; 60X и 200X увеличение) 12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Центробежная сила тяжести вызывает избыточную экспрессию хондрогенными маркеров дифференцировки в жировой ткани стволовых клеток.

Для того, чтобы определить степень центробежной силы тяжести, которая является подходящей для индукции дифференцировки хондрогенное, ИСС стимулировали различными степенями CG (0, 300, 600, 1200 и 2400 XG) в течение 15 мин. После стимуляции ИСС были повторно высевают на культуральные планшеты и культ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стволовости состояние клеток является очень важным для CG-индуцированной избыточной экспрессии SOX9. В нашем исследовании, экспрессия SOX9 может быть вызвано CG в начале пассажей ИСС (2-3), но не позже пассажей ИСС. Сообщалось , что, во время культивирования, ИСС не содержат CD34 + клеток до 3 -х проходов 16. ИСС, как правило, теряют экспрессию CD34, так как клетки пассируют, что приводит к низкой эффективности лечения CG.

С помощью центробежной силы тяжести, гидроста...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы заявляем, что у нас нет конфликтов интересов, связанных с этой работой.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантом Корейского проекта исследований и разработок в области технологий здравоохранения через Корейский институт развития индустрии здравоохранения (KHIDI), финансируемый Министерством здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея (номер гранта: HI14C2116) и Исследовательским фондом Сеульской больницы Святой Марии, Католический университет Кореи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Plasticware
100 мм ТарелкаTPP93100
60 мм ТарелкаTPP93060
50 мл Кузнечная трубкаSPL50050
15 мл Кукурузная трубкаSPL50015
10 мл Одноразовая пипеткаFalcon7551
5 мл Одноразовая пипеткаFalcon7543
ASC Культуральная среда Материалы
DPBSLife Technologies14190-144
DMEM Low glucoseLife Technologies11885-084базовая среда
роста Пеницилин стрептомицинSigma AldrichP43331%
Фетальная бычья сывороткаLife Technologies16000-04410%
PBS/1 мМ EDTALife Technologies12604-039
Материалы для хондрогенной дифференцировки
DMEM High glucose LifeTechnologies11995среда для хондрогенной дифференцировки
MEM Раствор заменимых аминокислот (100x)Life Technologies11140-050
ДексаметазонСигма ОлдричD2915100 нМ
пеницилин стрептомицинЛайф ТекнолоджизP43331%
фетальная бычья сывороткаЛайф Текнолоджс16000-0441%
аскорбат-2-фосфатСигма ОлдричA896050 μ г/мл
L-пролинSigma AldrichP560750 μ г/мл
егоБД1%
ТГФ человека&бета; 1Peprotech100-2110 нг/мл
Materials
18 мм Cover GlassSuperiorHSU-0111580
4% ПараформальдигидTech & ИнновацияBPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
Сыворотка крупного рогатого скота АльбуминВектор ЛабораторияSP-5050
Антитела против коллагена IIabcam ab347121:100
Козий антикролик IgG (H+L) Вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 594Молекулярный зондA-110371:200
DAPIМолекулярный зондD1306
Пролонгировать золото антивыцветающий реагентInvitrogenP36934
Слайдовое стекло, покрытоеHyun Il Lab-MateHMA-S9914
ТризолИнвитроген15596-018
ХлороформСигма Олдрич366919
изоприпилспиртМиллипоры109634
этанолDuksan64-17-5
RevertAid First Strand набор для синтеза кДНКThermo ScientficK1622
i-Taq ДНК-полимеразаiNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE BufferLife Technologies15581-044
загрузка звездыDyne BioA750
AgaroseSigma-Aldrich9012-36-6
1 kb (+) ДНК лестничный маркерEnzynomicsDM003
Стволовые клетки, полученные из жировой ткани человека (ASCs)Catholic MASTER Cells
354352

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
  2. Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
  3. Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
  4. Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
  5. Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
  6. Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
  7. Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
  8. Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
  9. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  11. Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
  12. Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).
  13. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  14. Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
  15. Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
  16. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
  17. Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
  18. Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
  19. Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SOX9II

Похожие статьи