Методическая статья

Инженерной искусственных факторов в частности Манипулирование альтернативного сплайсинга в клетках человека

DOI:

10.3791/54967

⸱

26 апреля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Computational Biology, CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS), 2Institute of Cancer Stem Cell, Second Affiliated Hospital, Cancer Center, Dalian Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот отчет описывает способ биоинженерии на проектирование и строительство новых искусственных сплайсинг факторов (ASFs), которые специфически модулируют сплайсинг генов-мишеней в клетках млекопитающих. Этот метод может быть дополнительно расширен инженером различных искусственных факторов, манипулировать другие аспекты метаболизма РНКА.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обработка большинства эукариотических РНК опосредуется РНК-связывающими белками (RBP) с модульными конфигурациями, включая модуль распознавания РНК, который специфически связывает мишень пре-мРНК и эффекторный домен. Раньше мы использовали уникальный способ связывания РНК PUF-домена в человеческом Pumilio 1 для генерации программируемого RNA binding scaffold, который использовался для разработки различных искусственных RBP для манипулирования метаболизмом РНК. Здесь описывается подробный протокол, чтобы построить Engineered Splicing Factors (ESF), специально предназначенные для модуляции альтернативного сплайсинга целевых генов. Протокол включает в себя то, как спроектировать и построить настраиваемый PUF-каркас для конкретной целевой РНК, как построить плазмиду экспрессии ESF, сплавляя дизайнерский PUF-домен и эффекторный домен, и как использовать ESF для манипулирования сплайсированием целевых генов. В репрезентативных результатах этого метода мы также описали общие анализыАктивности ESF с использованием сплайсинга репортеров, применения ESF в культивируемых клетках человека и последующего эффекта изменений сплайсинга. Следуя подробным протоколам в этом отчете, можно разрабатывать и генерировать ESF для регулирования различных типов альтернативного сплайсинга (AS), предоставляя новую стратегию изучения регуляции сплайсинга и функции различных сплайсинговых изоформ. Более того, путем слияния различных функциональных доменов с разработанным доменом PUF, исследователи могут создавать искусственные факторы, которые нацелены на конкретные РНК для манипулирования различными этапами обработки РНК.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большинство генов человека подвергаются альтернативного сплайсинга (AS) , чтобы произвести несколько изоформ с различными деятельности, что значительно увеличило сложность кодирования генома 1, 2. AS обеспечивает большую механизм для регулирования функции гена, и он жестко регулируется посредством различных путей в различной клеточной и развитии стадии 3, 4. Поскольку сращивание misregulation является частой причиной заболевания человека 5, 6, 7, 8, нацеливание регулирования сплайсинга становится привлекательным терапевтическим маршрутом.

В соответствии с упрощенной модели регулирования сплайсинга, как в основном контролируется сращивания регуляторной цис - элементы (SRES) в пре-мРНК , которые функционируют в качестве усилителей сплайсинга или глушителей альтернативных экзонов. ThESE SRES специально набирать различный транс -Актерских белковые факторов (т.е. факторы сплайсинга) , которые способствуют или подавляют реакцию сплайсинга 3, 9. Большинство факторов сплайсинга транса -Актерских имеют отдельный РНК последовательности специфической связывающие домены для распознавания их целей и эффекторных доменов для управления сплайсингом. Наиболее известные примеры являются членами серина / аргинин-богатых (SR) семейства белков , которые содержат N-концевой РНК Признание Мотивы (РРС), которые связываются exonic энхансеров сплайсинга, и С-концевые RS доменов, которые способствуют экзону включения 10 , С другой стороны , hnRNP А1 связывается с exonic сплайсинга глушителей через RRM доменов и ингибирует включение экзона через C-концевой глицин-богатых доменов 11. Использование таких модульных конфигураций, исследователи должны иметь возможность проектировать искусственные факторы сплайсинга путем объединения специфической РНК-связывающий домен (RBD) с различными эфКоторые активируют или ингибируют сплайсинг.

Ключом такой конструкции является использование RBD, который распознает заданные цели с программируемой специфичностью связывания РНК, что аналогично режиму связывания ДНК домена TALE. Однако большинство родных факторов сплайсинга содержат RRM или K гомологичные (KH) домены, которые распознают короткие элементы РНК со слабой аффинностью и, следовательно, не имеют прогностического «кода» распознавания РНК-белка. RBD повторных белков PUF ( т.е. PUF-домен) обладает уникальным режимом распознавания РНК, что позволяет редизайн доменов PUF специфически распознавать разные мишени РНК 13 , 14 . Канонический домен PUF содержит восемь повторов трех α-спиралей, каждый из которых распознает одно основание в мишени 8-nt РНК. Боковые цепи аминокислот в определенных положениях второй α-спирали образуют специфические водородные связи с краем Уотсона-Крика tон РНК базы, которая определяет РНК специфичность связывания каждого повтора (рис 1А). Код РНК базового признания ППУ повтора на удивление прост (Фигура 1А), что позволяет для генерации ППУ доменов , которые распознают любую возможную 8-базовую комбинацию (обзор Wang Wei и 15).

Этот модульный принцип конструкции позволяет генерацию Engineered сращивания фактора (ФЭБ) , который состоит из настраиваемой ППЫ области и области сплайсинга модуляции (т.е. домена SR или Кли-богатого домен). Этот ESFS может функционировать либо как сплайс - активаторы или ингибиторы , как управлять различными типами сплайса событий, и они оказались полезными в качестве средств для манипулирования сплайсинга эндогенных генов , связанных с заболеванием человека 16, 17. В качестве примера, мы построили ESFS ППУ-Гли-типа специфически изменить сплайсинг гена Bcl-X, Превращая антиапоптозную длинную изоформы (Bcl-XL) в проапоптотическую короткую изоформы (Bcl-Xs). Сдвиг отношения Bcl-X изоформы было достаточно , чтобы привлечь внимание несколько раковых клеток в нескольких химиотерапевтических препаратов против рака 16, предполагая , что эти искусственные факторы могут быть полезны в качестве потенциальных терапевтических реагентов.

В дополнение к управлению сращивание с известными сплайсинга эффекторных доменов (например, RS или Gly-богатых доменов), сконструированные ППУ факторы также могут быть использованы для изучения деятельности новых факторов сплайсинга. Например, при использовании этого подхода, мы показали , что С-концевой домен из нескольких SR белков может активировать или ингибировать сплайсинг при связывании с различными пре-мРНК областей 18, что аланин-богатый мотив RBM4 может ингибировать сплайсинг 19, и что пролин-богатый мотив DAZAP1 может усилить сплайсинг 20, 21 </ Sup>. Эти новые функциональные домены могут использоваться для построения дополнительных типов искусственных факторов для точной настройки сплайсинга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Строительство ППЫ строительных лесов с настраиваемым РНКОМ-специфичности связывания с помощью перекрывающего ПЦРА

  1. Дизайн серии ПЦР - праймеров , содержащих PUF последовательности , которые специфически распознают различные нуклеотиды РНК в каждой позиции 12 (см таблицу 1 для последовательностей праймеров и рисунок 1 А для РНК: ППУ код распознавания). Для каждого ППУ повтора, дизайн четыре различных праймера, чтобы распознать другую базу на каждой позиции.
    Примечание: Эти праймеры будут использованы в серии из четырех раундов ПЦР - реакций для генерации PUF фрагментов , которые соединены друг с другом (фиг.1 B).
  2. Выберите сайт узнавания гена-мишени вблизи альтернативного сайта сплайсинга.
    Примечание: Этот сайт может быть принято пользователем, и обычно выбирается в пределах 10 - 50 нт от альтернативных сайтов сплайсинга.
  3. Раунд 1: Генерация кодирующих последовательностейДля 4 повторов PUF, универсальных фрагментов моста и фрагментов крышки.
    1. Используйте целевой сайт, чтобы определить код распознавания для каждого повторения настроенного PUF. Выберите набор праймеров ПЦР для повторов PUF 1-8. Проведите четыре последовательных цикла ПЦР для получения настроенного домена PUF, как описано ниже ( Рисунок 1 B ).
    2. В первом цикле ПЦР устанавливают стандартные реакционные смеси ПЦР (содержащие 2,5 мкл 10х буфера, 0,5 мкл 10 мМ дНТФ, 0,5 мкл 10 мкМ прямых и обратных праймеров, 50 нг ДНК-матрицы (человеческая кДНК или экспрессирующий вектор Домена WT PUF) и ДНК-полимеразу с высокой точностью 0,5 U в 25 мкл конечного объема).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Эти реакции будут продуцировать последовательности ДНК, соответствующие каждому повторному PUF, универсальным фрагментам мостика и двум фрагментам каппа с различными сайтами рестрикции ( фиг. 1B). Краткий список шаблонов, праймеровИ генерируемые ПЦР - продукты , используемые на этой стадии , приведены в таблице 2.
    3. Установите программу ПЦР следующим образом: 5 мин при 95 ° С; 28 циклов по 30 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С и 15 с при 72 ° С; и 5 мин инкубации при 72 ° С. Используйте высококачественную ДНК-полимеразы, чтобы минимизировать точечные мутации в процессе ПЦР.
  4. Этап 2: Генерация кодирующие последовательности для R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) и R5 / R6 / R7 / R8 (R 5 - 8).
    1. Отдельные продукты ПЦР, полученные на этапе 1.3.3 с помощью электрофореза с 1,5% агарозном геле (25 мин при постоянном напряжении 120 В). Гель-очистить все продукты ожидаемого размера с использованием набора для очистки геля. Используйте другую смесь этих продуктов в качестве матрицы в следующих раундах ПЦР.
      Примечание: Смешайте три продукта ПЦР в примерно в соотношении 1: 1: 1. Они, как правило, не должны быть определены количественно, пока интенсивность каждого продукта похожа на геле.
    2. Смешайте около 5% очищенных продуктов ПЦР в качестве ПЭМпластина в следующий раунд ПЦР. В качестве альтернативы, количественно очищенные продукты ПЦР с использованием UV-VIS спектрофотометр и использовать 15 нг каждого ПЦР-продукта в матричной смеси.
    3. Используйте очищенные ПЦР-продукты R1 / R2, R3 / R4, и мост 2/3 в виде смешанных шаблонов и R1-F и R4-R в качестве праймеров. Настройка реакции PCR, как описано на стадии 1.3, чтобы получить перекрывающийся ПЦР продукт R1 - 4.
    4. Используйте очищенные ПЦР - продукты R5 / R6, R7 / R8, и мост 6-7 в качестве смешанных шаблонов и R5-F и R8-R в качестве праймеров для получения перекрывающего ПЦР - продукта R5-8 (рисунок 1 В). Установите программу ПЦР следующим образом: 5 мин при 95 ° С; 28 циклов по 30 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С и 30 с при 72 ° С; и 5 мин при 72 ° С. Гель очищают R1-4 и R5-8.
  5. Этап 3: Генерировать кодирующие последовательности для R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 без крышек).
    1. В третьем раунде ПЦР с использованием очищенного R1-4, R5-8, и Мост 4/5, как смешанные шаблоны и R1-F иR8-R, в качестве праймеров, настроить реакцию PCR, как описано на стадии 1.3, чтобы получить перекрывающего ПЦР продукта R1-8 без крышек.
    2. Установите программу ПЦР следующим образом: 5 мин при 95 ° С; 28 циклов по 30 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С и 55 с при 72 ° С; и 5 мин при 72 ° С. Гель очищает R1-8 без шапок.
  6. Round 4: Генерация кодирующих последовательностей для полных ППЫ доменов.
    1. В последнем раунде ПЦР с использованием очищенного R1-8 без крышек и 5'-конца и 3'-концевыми крышками как смешанные шаблоны и Cap-F и Cap-R в качестве праймеров, созданной ПЦР-реакции, как описано на стадии 1.3 для получения конечных мутированные домены PUF.
    2. Установите программу ПЦР следующим образом: 5 мин при 95 ° С; 28 циклов по 30 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С и 1 мин при 72 ° С; и 5 мин при 72 ° С.
    3. Гель-очистки продуктов ПЦР конечных репрограммированных доменов ППУ. Используйте эти продукты для построения экспрессии плазмиды ФЭБА в последующих стадиях. SequENCE окончательной конструкции с целью проверки перепрограммировать последовательности ППУ доменов.
      Примечание: Крышка-F кодирует NLS (PPKKKRKV) между BamH I и сайтами Xba I и Cap-R кодирует стоп - кодон и сайт Sal I (сайты рестрикции были разработаны для построения экспрессии векторов ESFS, рисунок 1 С).

2. Построение функционального модуля из ESFS

  1. Две стратегий обычно используется для клонирования функциональных модулей ESFS (RS доменов или Кли-богатые домены): чтобы усилить эти домены с помощью ПЦРА с использованием общей кДНК человека в качестве матрицы (этап 2.2) или непосредственно синтезировать фрагменты ДНК, которые кодируют различные RS или Gly-богатые домены (этап 2.3).
  2. С помощью ПЦР для клонирования RS домены из остатков 123 - 238 из 9G8 (NP001026854), остатков 180-272 из SRP40 (NP008856), или остатки 117 - 221 SC35 (NP003007). Клон Gly-богатых доменов из остатков 195 - 320 hnRNP A1 (NP_002127), остатокс 203 - 353 hnRNP A2 (NP112533), или остатки 211 - 378 из hnRNP A3 (NP919223).
    1. Используйте NCBI праймер дизайн инструмента (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) или Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) для разработки праймеров для клонирование RS доменов или Кли-богатые домены (функциональный модуль ESFS).
      Примечание: Прямой праймер содержит N-концевой FLAG тег после сайта Nhe I. Обратный праймер содержит сайт BamHI - I для клонирования в векторы экспрессии (Рисунок 1 С).
    2. Настройка стандартной реакции ПЦР, как описано на стадии 1.3, для усиления RS или Gly-богатых доменов. Установите программу ПЦР следующим образом: 5 мин при 95 ° С; 28 циклов по 30 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С и 30 с при 72 ° С; и 5 мин при 72 ° С.
  3. Клон RS-домены или Gly-богатых доменов путем прямого синтеза ДНК. Вместо того чтобы генерировать ПЦР-продукты, которые кодируют эффекторные домены на шаге 2.2, СЕНТРазмер олигонуклеотид, который кодирует короткий фрагмент-домен RS (RSRSRSRSRSRS) или Gly-богатый домен (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG), используя коммерческий источник ДНК-олигонуклеотидов.

3. Построение ESF экспрессирующих плазмид

  1. Построить ESF плазмиды экспрессии, используя любой вектор экспрессии,.
    Примечание: Выражение построить PGL-Gly-MS2 (подарок от доктора Р. Breathnach из Института де Biologie-CHR 11) был первоначально использован, который кодирует от N- к С-концевой FLAG, с эпитопом, в Gly -богатый домен hnRNP А1, и белок MS2, шерсть. Таким образом, это выражение конструкция использует в качестве примера в следующем шаге.
    Примечание: Другие векторы экспрессии с несколькими сайтами клонирования может быть также использованы и стандартные шаги по клонированию будет применяться для соединения фрагментов вместе.
  2. Дайджест 1,5 мкг плазмид экспрессии (PGL-Гли-MS2), указанных в пункте 3.1, чтобы удалить фрагмент белка оболочки MS2. Используйте ОГРАНИЧЕНИЯЭндонуклеаз BamH I и Sal I в течение 1 ч при 37 ° С. Переварить модуль распознавания ESF (кодирующий NLS и перепрограммированные PUF-домены, сгенерированные на шаге 1.5) с BamH I и Sal I в том же состоянии.
  3. Добавляли 5х красящий краситель к реакциям рестрикционного переваривания и медленно электрофорезировали общий объем с 1,5% агарозным гелем, содержащим пятно ДНК-геля в течение 40 мин при 120 В. Гель-очищают переваренные продукты.
  4. Подготовьте 10 мкл реакций лигирования с очищенным модулем узнавания вставками ESF и ДНК вектора экспрессии в соотношении 3: 1, 1 мкл ДНК-лигазы и 1 мкл буфера 10 лигирования. Инкубируйте реакции лигирования в течение ночи при 4 ° С; Результирующая конструкция экспрессирует ESF Gly-PUF (pGL-Gly-PUF) под контролем промотора CMV ( фиг. 1 C ).
  5. Удалите фрагмент, кодирующий домен FLAG / Gly-rich, с помощью переваривания Nhe I и BamH I в течение 1 ч при 37oC. Замените его фрагментом, который кодирует домен RS (сгенерированный на этапе 2.2, также перевариваемый Nhe I и BamH I); Результирующая конструкция выражает ESF RS-PUF-типа (фиг.1С).

4. Строительство сплайс-репортера

  1. Синтезируют олигонуклеотиды, содержащие последовательности-кандидаты ( т.е. последовательности-мишени PUF-доменов), фланкированные сайтами Xho I и Apa I или сайтами Xho I и EcoR I. Отжиг олигонуклеотидов в течение 5 мин при 55 ° С с получением двухцепочечных вставок, содержащих сайты узнавания доменов PUF, фланкированных сплоченными концами участков Xho I и Apa I или Xho I и EcoR I.
  2. Начните с ранее описанного модульного сплайсингового репортера 22 , pGZ3, который содержит два экзона GFP, разделенных тестовым экзоном (экзон 12 человеческого IGF2BP1, Ensemble ID ENSG00000159217) и его фланговые интронов.
    Примечание: Тест экзон был разработан с сайтами Xho I и Apa I, которые могут быть использованы для вставки синтезированных олигонуклеотидов , содержащих последовательности - кандидатов (целевые последовательности доменов ППЫ). Этот модульный сплайсинга репортер (pGZ3) обеспечивается с помощью плазмиды хранилище Add-гена.
  3. Дайджест базовый репортер pGZ3 (полученного на стадии 4.2) с эндонуклеаз рестрикции Xho I и Apa I в течение 1 ч при 37 ° С.
  4. Гель-очистить переваренные продукты, как описан на стадии 3.3.
  5. Готовят 10 мкл лигирования реакций с двухцепочечных вставками, генерируемых на этапе 4.1 и переваренного вектора pGZ3, генерируемых на этапе 4.4 в 3: молярном соотношении 1, 1 мкл ДНК-лигазы и 1 мкл 10-кратного буфера для лигирования. Инкубируйте реакции лигирования в течение ночи при 4 ° С, чтобы получить конструкционный сплайсинг репортера вектор pGZ3.
  6. Вставьте вкладыши двухцепочечной, сгенерированные на этапе 4.1 в ранееОпубликованных репортеров, pEZ-1B (с использованием сайтов Xho I и EcoR I) и pEZ-2F (с использованием сайтов Xho I и Apa I) 23 , для получения конкурирующего репортера 5 и репортера 3-го участника, как описано в шагах 4.3-4.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Оба типа репортеров сплайсинга будут доступны через Add-gene.

5. Конструирование векторов экспрессии лентивирусов для ESF

  1. Настроить стандартную реакцию ПЦР, как описано в шаге 1.3, для амплификации полноразмерных ESF из исходных векторов экспрессии (pGL-Gly-PUF или pGL-RS-PUF) с праймерами, содержащими сайты Mlu I / Spe I. Установите программу PCR следующим образом: 5 мин при 95 ° C; 28 циклов 30 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С и 1,5 мин при 72 ° С; И 5 мин при 72 ° C.
  2. Через реакцию пищеварения, гелевую очистку и реакцию лигирования, интегрируют ESF в лентивирусный вектор экспрессии pWPXLd между Mlu I / сайтов Spe I, как описано в пунктах 3.2-3.4.
  3. С помощью стандартного метода осаждения фосфата кальция, как сообщалось ранее 24, чтобы генерировать лентивирусы от cotransfecting HEK293T клеток путем упаковки векторов, psPAX2 и pMD2.G, либо с pWPXLd-Гли-ППА (Bcl-X), pWPXLd-Гли-ППА ( по массе) (в качестве контроля специфичности) или pWPXLd-GFP (макет).
    1. Семенной 5x10 6 HEK293T клеток в 10 см чашки и выращивают клетки в течение ночи в 10 мл Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , на чашку в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2 , Выполните трансфекции, когда клетки 70 - 90% сплошности.
    2. Готовят смесь плазмиды путем добавления трех плазмид (7,5 мкг вектора упаковки, psPAX2; 2,5 мкг pMD2.G и 10 мкг либо pWPXLd-Гли-ППУ (Bcl-X), pWPXLd-Гли-ППУ (вес) или pWPXLd-GFP), в 2 мл пробирку.
    3. Добавьте 560 мкл 0,25 М CaCl2 и 560 мкл раствора 2x BBS к трубе 2-мл. Осторожно перемешать несколько раз и инкубировать ее в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы приготовить смесь для трансфекции.
    4. Добавьте все трансфекции смесь с 10-см чашек. Вихревой посуду мягко и инкубировать их в течение ночи при 3% CO 2 и 37 ° С.
    5. Извлеките носитель, добавьте 10 мл свежей среды DMEM с 2% FBS в каждую чашку, и инкубируют их при 10% CO 2 и 37 ° CO / N.
    6. Собирают первый супернатант из блюд. Добавьте 10 мл свежей DMEM с 2% FBS к каждому блюду. Инкубируйте блюда O / N в 10% CO 2 и 37 ° С. Хранить супернатант при 4 ° С.
    7. Собрать второй супернатант из блюд. Бассейн супернатант из первого и второго урожая. Очистить супернатант клеточного дебриса путем ее фильтрации через фильтр 0,4 мкм. Используйте очищенную надосадочную жидкость непосредственно или хранить его при температуре -80 ° С.
  4. Определить титр лентивирусов путем заражения HEK293T с серийными разведениями вирусного препарата, как сообщалось ранее 25 .

6. Конкретная модуляция включения экзонов и альтернативное использование сайтов сплайсинга с ESF

  1. Семена 2 × 10 5 клеток HEK293T в каждую лунку 24-луночного планшета. Выращивают клетки в течение ночи в 500 мкл DMEM с добавлением 10% FBS в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 .
  2. Смешайте липосомальный трансфекционный реагент, осторожно переворачивая бутылки перед использованием. Разбавьте 2 мкл липосомного трансфекционного реагента в 50 мкл уменьшенной сывороточной среды. Тщательно перемешайте и инкубируйте их в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Разбавляют 0,04 мкг экспрессирующих векторов pGL-Gly-PUF и 0,2 мкг репортерных плазмид pGZ3 в 50 мкл среды с пониженной сывороткой в ​​стерильной пробирке. Разбавляют 0,4 мкг экспрессирующих векторов pGL-RS-PUF и 0,2 мкг репортерных плазмид pGZ3 в 50 мкл среды с пониженной сывороткой в ​​стерильной пробирке. D0,4 мкг экспрессирующих векторов pGL-RS-PUF и 0,2 мкг репортерных плазмид pEZ-1B или pEZ-2F в 50 мкл восстановленной сывороточной среды в стерильной пробирке.
  4. После 5-минутной инкубации при комнатной температуре осторожно перемешивают разбавленный липосомный трансфекционный реагент, полученный на стадии 6.2, с разбавленными плазмидами, полученными на стадии 6.3. Инкубируйте смесь в течение 20 мин при комнатной температуре.
  5. Добавьте в каждую лунку все трансфекционные смеси, содержащие векторы экспрессии и трансфекционный реагент, приготовленные на стадии 6.4, и инкубируйте в течение, по меньшей мере, 12 ч в увлажненном инкубаторе при 37 ° С и 5% СО 2 .
  6. Через 12 часов в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 отбросьте среду из каждой лунки и промойте их 500 мкл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) / лунку.
  7. Отбросьте PBS и добавьте 200 мкл трипсина в каждую лунку. Инкубируйте планшет в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 в течение 5 минут. Добавьте 1 мл среды, чтобы остановить диGestion и передачи клеток в стерильную пробирку на 1,5 мл.
  8. Центрифуга пробирки в течение 3 мин при 5000 мкг и отбросить среду. Добавить 0,5 мл буфера для экстракции РНК на пробирку, чтобы лизировать клетки от повторяющихся пипетированием. Инкубируйте гомогенизированные образцы в течение 5 мин.
  9. Для каждой экстракции РНК-буфера обработанной пробы, добавляют 0,1 мл хлороформа в 0,5 мл буфера для экстракции РНК. Invert пробирки в течение 15 с и инкубировать их в течение 3 мин при комнатной температуре.
  10. Центрифуга пробирки в течение 15 мин при 12000 х г и 4 ° С. Передача водной фазы в новую пробирку. Добавьте 0,25 мл изопропанола в 0,5 мл буфера для экстракции РНК, используемых для начальной гомогенизации.
  11. Смешайте встряхиванием и инкубировать их при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифуга пробирки при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. После центрифугирования осадок РНК обычно виден в нижней части трубы.
  12. Удалите супернатант и промыть осадок РНК с помощью 0,5 мл 75% этанола в 0,5 мл буфера для экстракции РНК.
  13. Вихревой энергично и центрифуге это при 7500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и сухой осадок РНК. Растворить РНК в 50 мкл РНКазы свободной воды.
  14. Добавьте 2 мкл 5U / мкл ДНКазы I, 7 мкл 10 - кратного буфера и 11 мкл H 2 O к каждому раствору 50-мкл РНК. Инкубировать пробирки при 37 ° С в течение 1 ч. Тепло их при 70 ° С в течение 15 мин для инактивации ДНКазы.
  15. Для каждого образца, добавьте следующие компоненты в 0,2 мл нуклеазы без трубки: 1 мкл 50 мкМ олиго дТ, 5 мкл 400 нг / мкл РНК (2 мкг), 1 мкл 10 мМ дНТФ, и 3 мкл H 2 О. Выполните обратный ПЦР.
    1. Смесь нагревают до 65 ° С в течение 5 мин и инкубировать ее на льду в течение по меньшей мере 2 мин, чтобы предотвратить повторное образование вторичной структуры. Добавьте следующие компоненты в одной и той же трубке: 4 мкл 5х первой цепи буфера, 1 мкл 0,1 М ДТТ, 1 мкл 200 ед / мкл обратной транскриптазы, и 4 мкл H 2 </ Sub> O. Смешайте пипеткой осторожно вверх и вниз и инкубируйте при 50 ° C в течение 60 минут. Остановите реакцию, нагревая ее при 70 ° C в течение 15 минут.
  16. Для каждого образца добавьте следующие компоненты в пробирку для ПЦР, чтобы завершить меченную телом ПЦР: 2,5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера, 0,5 мкл 10 мМ раствора dNTP, 1 мкл 10 мкМ прямого праймера, 1 мкл 10 мкМ Обратный праймер, 0,25 мкл 5 U / мкл Taq ДНК-полимеразы, 0,5 мкл 25 нМ Cy5-dCTP и 2 мкл кДНК, полученной на стадии 6.15.
    1. Нагреть реакцию до 94 ° С в течение 2 мин для денатурирования молекул, провести 25 циклов ПЦР (94 ° С в течение 30 с, 60 ° С 30 с и 72 ° С 30 с), поддерживать реакцию при 72 ° С для 7 мин, а затем оставьте его при 4 ° C.
  17. Растворить продукты ПЦР путем электрофореза через 10% полиакриламидный гель с 1x основанием Tris, борной кислотой и EDTA (TBE). Выполните сканирование с помощью флуоресцентного сканера. ИзмерьтеКоличество каждой изоформы сплайсинга с использованием денситометрического программного обеспечения.

7. Используйте ESF для модуляции эндогенного сплайсинга Bcl-x и измерения его влияния на апоптоз

  1. Пластину 2 х 10 5 клеток HeLa в каждую лунку 24-луночного планшета. Выращивают клетки в течение ночи в 500 мкл DMEM, дополненной 10% FBS, в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 .
  2. Через 12 часов трансфектируют клетки 2 мкг pGL-Gly-PUF (WT) или 0,2 мкг, 1 мкг и 2 мкг pGL-Gly-PUF (531) (перепрограммированный PUF-домен, который распознает преклинический Bcl- МРНК с высоким сродством, см . Фиг. 2A ).
  3. Через 24 часа собирают клетки. 1/3 клеток для выделения РНК и ПЦР-анализа (этапы 6.8-6.17) и 2/3 предназначены для выделения белка.
  4. Для анализа методом вестерн-блоттинга кипятите полные гранулы клеток в загрузочном буфере 2X додецилсульфат-полиакриламидный гель для электрофореза (SDS-PAGE) в течение 10 мин, А затем решить протеины в 12% геле SDS-PAGE. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану.
  5. Блок мембраны с 5% молока в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировать мембраны O / N с каспазы-3 (1: 1,000), PARP (1: 1,000), или бета-актина (1: 5000), первичные антитела (разбавленный в 5% молока) при 4 ° С.
  6. Промывают мембрану с ФБР, содержащим 0,1% Tween 20 (PBS-T) в течение 5 мин при RT 3x на ротационном шейкере. Инкубируйте мембрану с ПМ-связанными антителами (1: 5000, разбавленную в 5% молоке) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  7. Промывают мембраны с PBS-T 3x при комнатной температуре, а затем разрабатывает мембрану с помощью ECL-реагентов западных промокательного обнаружения.
  8. Добавьте 250 мкл поли-L-лизин (PLL) на покровные, инкубировать их в течение 15 мин при комнатной температуре, а также откачивать жидкость. Промывают ФАПЧ-покрытием покровные стекла с PBS 3 раза в течение 5 мин каждый. Для измерения иммунофлюоресценции анализа апоптоза, семян 5 х 10 5 HeLa клеток на поли-лизин-покрытием покровные стекла в 6-луночный планшет. трансфекцию рGL-Гли-ППА (WT) или PGL-Гли-ППА (531) плазмиды в клетки HeLa с использованием липосомального реагента для трансфекции (см шагов 6.1 - 6.5).
  9. Через 24 часа после трансфекции, клетки фиксируют на покровные с 1 мл 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS в течение 20 мин при комнатной температуре. ВНИМАНИЕ: ПФ токсичен; обращаться с осторожностью в вытяжном шкафу.
  10. Осторожно промыть клетки на покровные путем добавления 2 мл 1x PBS. Выдержите их в течение 5 мин. Удалить PBS с пипеткой. Повторите промывку 3x.
  11. Клетки проницаемыми с 0,2% Тритона Х-100 в 1x PBS в течение 10 минут, а затем промыть их 3x с 1x PBS.
  12. Блок-клетки с 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS 1x в течение 10 мин и промыть их 3x с 1x PBS.
  13. Развести FLAG антитела 1: 1000 в 3% BSA / PBS и пипеткой 30 мкл разведенного антитела FLAG на парафильмом листа.
  14. Вынуть покровное с клетками, тщательно высушить избыток буфера с лабораторными салфетками, и поставить его вверх-вниз (клетка на стороне вниз) на 30 мкл анти-FLAG секolution. Выдержите его в течение 1 ч при комнатной температуре.
  15. Добавляет приблизительно 500 мкл PBS 1x в сторону покровного инкубировали с первичным антителом до тех пор, пока покровные плавает на поверхности раствора. Возвращение его к 6-луночного планшета с 1x PBS в лунки.
  16. Промыть это 3x с 1x PBS в течение 5 мин каждый.
  17. Развести анти-мыши вторичного антитела (1: 500) в 3% BSA / PBS; опять же, использовать 30 мкл каждого покровное. Поместите покровное вверх-вниз на растворе вторичного антитела и инкубировать ее в течение 15 мин при комнатной температуре.
  18. Удалить покровную от парафина, как описано в шаге 7.15. Поместите его обратно в 6-луночный планшет и промыть его с 1x PBS 3x в течение 5 мин каждый.
  19. Установить покровные с монтажной средой (с DAPI), удалить избыток среды, и запечатать края с лаком для ногтей.
  20. Визуализация клеток с помощью флуоресцентного микроскопа (при 100-кратном увеличении) и сфотографировать их с помощью цифровой камеры.
    Примечание: Выражение ESF визуализируются с помощью флуоресцентных этикетокд вторичное антитело против FLAG тега, а ядерная фрагментация визуализировали с использованием DAPI окрашивания.

8. Измерьте апоптоз различных раковых клеток, экспрессирующих ESF

  1. Split 2 х 10 6 HeLa клетки, клетки MDA-MB-231 и А549 клеток в 60-мм чашки с 4 мл среды DMEM с добавлением 10% FBS в инкубаторе при 37 ° С и 5% СО 2 для обнаружения апоптоза с Пропидиум йодид (PI) окрашивание.
  2. Через 24 часа обновить среду и подготовить лентивирусы, как сообщалось ранее 24.
  3. Развести 10 х 10 6 Лентивирус pWPXld-Гли-ППУ (WT), pWPXld-Гли-PUF (531), или pWPXld-GFP запасов в 4 мл свежей среды , чтобы соотношение количества вируса к числу клеток , равным 5.
  4. Изменение среды в пластинах 4 мл вируса , содержащей среду , полученной на стадии 8.3 , и инкубируют планшеты в инкубаторе при 37 ° С и 5% CO 2. 12 ч после заражения, изменения среды.
  5. Через 24 ч после инфекции, сбора и окрашивания клеток в течение 5 мин в растворе PBS, содержащем конечную концентрацию 2 мкг / мл PI.
  6. Анализ PI-окрашенных клеток с проточной цитометрии, как описано ранее 16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот отчет описывает полный протокол для проектирования и строительства ESFS и сращивания репортеров. Он также описывает дальнейшее применение ESFS в манипулировании AS эндогенных генов 16. Чтобы проиллюстрировать типичные результаты ФЭБ-опосредованные изменения сплайсинга, мы используем данные из нашей предыдущей работы в качестве примера. В ESFS с различными функциональными доменами может быть использован для содействия или ингибировать включение целевой кассеты...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот отчет содержит подробное описание для проектирования и строительства искусственных факторов сплайсинга, которые могут специально манипулируют альтернативный сплайсинг гена-мишени. Этот метод использует преимущества уникальной РНК связывающим режиме ППУ повторяет для получения РНК-связывающие помост с настраиваемым специфичностью. Он может быть использован либо активировать или подавлять сплайсинг.

Важный шаг в этом протоколе является генерацией reprogramed ППУ домена, который определяет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом NIH R01-CA158283 и грантом 31400726 NSFC для ZWYW, финансируется Программой талантов молодых тысяч и Национальным фондом естественных наук Китая (гранты 31471235 и 81422038). XY финансируется научным фондом постдокторантов Китая (2015M571612).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Высокоточная ДНК-полимераза (Phusion High-Fidelity) с буфером для ПЦРNew England BiolabsM0530L
ДНК-лигаза (T4 ДНК-лигаза)New England BiolabsM0202L
Липосомальный реагент для трансфекции (Lipofectamine 2000)Invitrogen11668-019
Восстановленная сывороточная среда (Opti-MEM)Gibco31985-062
РНК экстракционный буфер (реагент ТРИзол)амбион15596018реактив ТРИзол содержит фенол, который может вызвать ожоги. Надевайте перчатки при работе с
PBS (1x)Life Technologies10010-031
SuperScript III Обратная транскриптаза (RT)Invitrogen18080044
Caspase-3антитело Технология клеточной сигнализации9668
Антитело PARPТехнология клеточной сигнализации9542
антитело Bcl-xBD Bioscience610211
антитело к бета-актинуSigma-AldrichA5441
антитело к альфа-тубулинуSigma-AldrichT5168
антитело FLAGSigma-AldrichF4042
Нитроцеллюлозная мембранаAmersham-PharmaciaRPN203D
ECL Western Blotting реагенты для обнаруженияInvitrogenWP20005
Cy5-dCTPGE HealthcarePA55021
Флуоресцентно-активируемый сортировщик клеток (FACS)BD BioscienceFACSCalibur 
Дульбекко s Модифицированный Eagle' s Medium (DMEM)GE HealthcareSH30243.01
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Инвитроген26140079
Пропидиум йодид (PI)SigmaP4170
Бычья сыворотка альбумин (BSA)SigmaA7638-5G
PromegaH5142
поли-L-лизин SigmaP-4832Фильтр-стерилизуем и храним при 4°С; C
Вектор pWPXLdAddgene12258
Вектор pMD2.GAddgene12259
Вектор psPAX2Addgene12260
DNаза I (без РНКазы)New England BiolabsM0303S
Oligo(dT)18 PrimerThermo ScientificSO131 
Вторичное антитело против мыши (Anti-mouse IgG, HRP-связанное антитело)Технология клеточной сигнализации7076S
Triton-X100

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).
  3. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14 (5), 802-813 (2008).
  4. Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).
  5. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).
  6. Wang, G. -S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).
  7. Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352 (6285), 600-604 (2016).
  8. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).
  9. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).
  10. Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).
  11. Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).
  12. Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).
  13. Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).
  14. Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).
  15. Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).
  16. Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).
  17. Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147(2012).
  18. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).
  19. McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).
  20. Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).
  21. Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
  22. Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).
  23. Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).
  24. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031(2012).
  25. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  26. Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).
  27. Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).
  28. He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4 (3), 4732(2009).
  29. Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).
  30. Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7 (8), 1002218(2011).
  31. David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).
  32. Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
  33. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).
  34. Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PUFHEK 293T

Похожие статьи