Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Поколение человеческих моноцитов дендритных клеток из цельной крови

20.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54968

⸱

24 декабря 2016 г.

 ,  , 
1Division of Hygiene and Medical Microbiology, Medical University of Innsbruck

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы демонстрируем, как моноциты выделяются путем отделения магнитных шариков от мононуклеарных клеток периферической крови после центрифугирования с градиентом плотности антикоагулированной крови человека. После инкубации в течение 5 дней моноциты человека дифференцируются в незрелые дендритные клетки и готовы к экспериментальным процедурам в неклинических условиях.

Аннотация

Дендритные клетки (ДК) распознают чужеродные структуры различных патогенов, таких как вирусы, бактерии и грибы, с помощью различных рецепторов распознавания образов (PRR), экспрессируемых на их клеточной поверхности, и тем самым активируют и регулируют иммунитет.

Основной функцией ДК является индукция адаптивного иммунитета в лимфатических узлах путем представления антигенов через молекулы MHC I и MHC II наивным Т-лимфоцитам. Поэтому ДК должны мигрировать с периферии в лимфатические узлы после распознавания возбудителей в местах инфекции. Для экспериментов in vitro или стратегий вакцинации против ДК обычно используются ДК, полученные из моноцитов. Эти клетки демонстрируют сходство в физиологии, морфологии и функциях с обычными миелоидными дендритными клетками. Они образуются за счет стимуляции интерлейкином 4 (IL-4) и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) моноцитов, выделенных от здоровых доноров. В данной работе мы демонстрируем, как моноциты выделяются и стимулируются из антикоагулированной крови человека после обогащения мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) центрифугированием с градиентом плотности. Моноциты человека дифференцируются в незрелые ДК и готовы к экспериментальным процедурам в неклинических условиях после 5 дней инкубации.

Введение

Дендритные клетки (ДК) являются наиболее важными специализированными антиген-представляющих клеток нашей иммунной системы. Незрелые РС (IDCS) находятся в коже или в тканях слизистой оболочки и поэтому среди первых иммунных клеток, чтобы взаимодействовать с вторгающихся патогенов. Контроллеры домена представляют собой мост между врожденной и адаптивной иммунной системы 1, так как они могут активировать Т- и В-клеточные реакции после обнаружения патогенных микроорганизмов. Кроме того, они способствуют провоспалительных иммунных реакций, из-за выделения больших количеств цитокинов, таких как IL-1, IL-6 и IL-12. Контроллеры домена также активирует клетки NK и привлечь другие иммунные клетки к месту инфекции хемотаксиса.

Контроллеры домена могут быть разделены на незрелые дендритные клетки (МССД) и зрелых дендритных клеток (MDCs) 2 на основе их морфологии и функции. После распознавания чужеродных антигенов одним из множества распознающих рецепторов (например, Toll-подобные рецепторы, С-типалектины, или дополнять рецепторы) в большом количестве экспрессируется на поверхности клетки, IDCS претерпит серьезные изменения и начинают созревать. Во время этого процесса созревания, рецепторы для захвата антигена вниз регулируется, в то время как молекулы , необходимые для презентации антигена являются повышающей регуляции 3. Зрелые контроллеры домена до регулировать основных комплексов гистосовместимости I и II (MHC I и II), Co-стимулирующего молекулы, такие как CD80 и CD86, которые имеют важное значение для презентации антигена и активации Т-лимфоцитов. Кроме того, экспрессия рецептора хемокина CCR7 на поверхности клеток индуцируется, что позволяет миграцию контроллеров домена из периферических тканей к лимфатическим узлам. Миграция способствует "прокатки" ДК вдоль хемокинным лиганда 19 (CCL19 / MIP-3b) и хемокина лиганд 21 (CCL21 / SLC) градиента к лимфатическим узлам 4-6.

После миграции, MDCs представить обработанный антиген наивных CD4 + и CD8 + Т - клеток, таким образом , иниtiating адаптивный иммунный ответ против вторгшегося возбудителя 7. Это взаимодействие с Т - клетками в лимфатических узлах , также связано с распространением вируса 8. Другие исследования в пробирке показали , что контроллеры домена эффективно захвата и передачи ВИЧ Т - клеток и что это результаты передачи в энергичном инфекции 9-12. Эти эксперименты подчеркивают , что в естественных условиях РС ВИЧ подвиги , как челноки от периферии к лимфатическим узлам. Во время презентации антигена, контроллеры домена выделяют ключевые интерлейкины, которые формируют дифференциацию эффекторных Т-клеток-хелперов, и, следовательно, исход всего иммунного ответа против микроба определяется при этом самого взаимодействия. Помимо типа 1 (Th1) и типа 2 (Th2) эффекторные Т - клетки, другие подмножества клеток - хелперов CD4 + Т (например, тип 17 (Th17) и тип 22 (Th22) Т - клетки) были описаны, и их индукция и функции были тщательно исследованы. ДК, кроме того, участвует вгенерация регуляторных Т - клеток (Tregs) 13,14. Эти клетки являются иммунодепрессивное и могут остановить или понижающей регуляции индукции или пролиферации эффекторных Т-клеток и, таким образом, решающее значение для развития иммунитета и толерантности.

Человеческие обычные контроллеры домена (CDCs) содержат несколько подмножеств клеток с миелоидного происхождения (т.е. клеток Лангерганса (LCS) и кожная и интерстициальные РСУ) или лимфоидной происхождения (т.е. плазмоцитов контроллеры домена (PDCs)). Для экспериментов в пробирке или стратегии вакцинации DC, моноцитов контроллеры домена , которые обычно используются в качестве модели для кожными контроллеров домена. Эти клетки демонстрируют сходство в физиологии, морфологии и функции с обычными миелоидные дендритные клетки. Они генерируются путем добавления интерлейкина 4 (IL-4) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) , моноцитов , выделенных из здоровых доноров 12,15-18. Дендритные клетки также могут быть непосредственно выделены из дермальных или слизистыми биопсий, или может даже бе развился из CD34 + гемопоэтических клеток - предшественников , выделенных из образцов пуповинной крови , полученных ех внутриутробного развития. Здесь показано, как моноциты изолированы и стимулировали от анти-свернувшегося крови человека после того, как мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) обогащения центрифугированием в градиенте плотности. После инкубации в течение 5 дней, моноциты человека при определенных условиях дифференцированы в IDCS и готовы к экспериментальным процедурам в доклинических условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этика заявление: письменное информированное согласие было получено от всех участвующих доноров крови Центрального института переливания крови и отдела иммунологические, Инсбрук, Австрия. Использование обезличенных образцов оставшимися в научных целях было одобрено Комитетом по этике Медицинского Университета Инсбрука мимо.

1. Обогащение мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)

  1. Концентрация МНПК центрифугированием.
    1. Открыть пакет крови и раздвоение кровь в стерильные 50 мл центрифужные пробирки, в зависимости от количества крови, полученной.
    2. При необходимости, отрегулировать громкость до 50 мл на каждую пробирку со стерильной Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (D-PBS).
    3. Место труб в центрифугу и вращать их при 400 х г в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) без тормоза.
    4. Откачать верхний слой, содержащий плазму и тромбоциты, используя стерильный 10 мл серологические пипетки, оставляя boundarу слоя ненарушенных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если аутологичной плазмы вместо FCS используется в дополнение к культуральной среды, плазма должна быть собрана и термоинактивировали на этом этапе.
    5. Сбор мононуклеарных клеток (пограничные слои) из двух 50 мл центрифужные пробирки и переносят их в одну стерильный 50 мл трубки с помощью стерильной 10 мл серологические пипетки.
    6. Отрегулируйте громкость до 50 мл на каждую пробирку с использованием стерильной D-PBS.
    7. Место труб в центрифугу и вращать их со скоростью 400 мкг в течение 15 мин при комнатной температуре без тормоза.
    8. Откачать верхний слой, содержащий плазму и тромбоциты, используя стерильный 10 мл серологические пипетки, в результате чего пограничный слой нетронутой.
    9. Сбор мононуклеарных клеток (пограничные слои) из центрифужные пробирки по 50 мл и переносят их на две стерильные 50 мл пробирки для сбора с использованием стерильного 10 мл серологические пипетки.
    10. Отрегулируйте громкость до 50 мл на каждую пробирку со стерильным D-PBS.
  2. разделениеМНПК путем центрифугирования в градиенте плотности (рис 1).
    1. Подготовьте четыре 50 мл пробирки и пипетки 15 мл градиента плотности среды в каждую пробирку.
    2. Возьмите 25 мл объединенном клеток / крови из коллекторной трубки (этап 1.1.10) и тщательно наложения градиента плотности среды.
    3. Место труб в центрифугу и вращать их со скоростью 700 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре без тормоза.
  3. Сбор и очистка МНПК.
    1. Откачать верхний слой, содержащий плазму и тромбоциты, используя стерильный 10 мл серологические пипетки, оставляя слой РВМС без помех.
    2. Соберите интерфазу РВМС из всех трубок и объединить клетки в двух стерильных 50 мл пробирки с помощью стерильной 25 мл серологические пипетки.
    3. Отрегулируйте громкость до 50 мл на каждую пробирку со стерильным D-PBS. Место труб в центрифугу и вращать их при 400 х г в течение 15 мин при 4 ° C с тормозом.
    4. Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливатьКлетки в стерильном D-PBS. Объединяют клетки с обеих трубок и регулировать объем до 50 мл стерильной D-PBS.
    5. Место труб в центрифугу и вращать их при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.
    6. Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливать клетки в стерильном D-PBS. Настройка громкости до 50 мл стерильной D-PBS и 50 мкл в 1,5 мл пробирку, содержащую 450 мкл D-PBS.
    7. Вихревой 1,5 мл трубки энергично и подсчета клеток в камере Neubauer или любой другой инструмент подсчета клеток.
    8. Поместите 50 мл пробирки в центрифугу и вращать их при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.

2. Выделение моноцитов с помощью анти-CD14 человека магнитных частиц

  1. Маркировку МНПК с магнитными частицами.
    1. Отрегулируйте концентрацию РВМС до 8 × 10 7 клеток / мл с использованием буфера изоляции.
    2. Вихревые магнитные частицы CD14 против человеческого thoroughlу и добавить 50 мкл частиц на каждые 1 × 10 7 МНПК.
    3. Смешайте суспензии клеток-частиц тщательно и инкубировать ее при комнатной температуре в течение 30 мин.
  2. Разделение положительных и отрицательных фракций.
    1. Отрегулируйте объем до 12 мл с использованием буфера изоляции.
    2. Подготовьте шесть стерильных круглым дном пробирки и пипетки 2 мл клеточной суспензии частиц в каждую пробирку.
    3. Немедленно поместить пробирки на магните. Выдержите их в течение 10 мин при комнатной температуре.
    4. Держите трубки на магнит и осторожно оттянуть супернатант. Супернатант содержит негативную фракцию.
    5. Снимите трубку от магнита и добавьте 2 мл буфера изоляции.
    6. Аккуратно повторно приостанавливать клетки пипетированием вверх и вниз.
    7. Поместите трубки обратно на магнит. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
    8. Держите трубки на магнит и осторожно оттянуть супернатант. Супернатант содержит негативную фракцию.
    9. Удалить труб из магнита и добавляют 2 мл буфера изоляции в каждую пробирку. Аккуратно повторно приостанавливать клетки пипетированием вверх и вниз.
    10. Перенести положительную фракцию в стерильный 50 мл трубки и регулировать громкость до 50 мл с помощью стерильного D-PBS.

3. Стимуляция изолированных моноцитов с IL-4 и GM-CSF

  1. Поместите пробирку в центрифугу и вращать его при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.
  2. Аспирата супернатант и повторно приостанавливать клетки в 50 мл D-PBS.
  3. 50 мкл в 1,5 мл пробирку, содержащую 450 мкл D-PBS. Vortex 1,5 мл трубки энергично и подсчета клеток в камере Neubauer или другого счета сотового инструмента.
  4. Поместите 50 мл пробирку в центрифугу и вращать его при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если отрицательная фракция, содержащая лимфоциты периферической крови (PBL,), также требуется, выполнить промывку и подсчета шагов похож на тшланг положительной фракции (шаги 3.1-3.5).
  5. Регулировка концентрации клеток до 1 × 10 6 / мл с помощью подогретого культуральной среды (RPMI 1640 , дополненной 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% L-глутамина раствор) и пипеткой 3 мл / лунку на 6-луночных планшетах.
    Примечание: При использовании инактивированной нагреванием аутологичной плазмы, заменить 10% FCS с 1-5% аутологичной плазмы, в соответствии с экспериментальной установки.
  6. Стимулируют моноцитов с рекомбинантного человеческого ИЛ-4 (250 ед / мл) и рекомбинантного человеческого GM-CSF (1000 ед / мл) с помощью пипетки цитокины непосредственно в культуральную среду. Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2.
  7. Повторно стимулируют клетки ИЛ-4 (250 ед / мл) и GM-CSF (1000 ед / мл) через 48 ч пипеткой цитокины непосредственно в культуральную среду.
    Примечание: Если есть какие-либо признаки подкисления, показанные индикатором рН в среде, заменить половину среды с подогретого культуральной среды.
  8. Урожай незрелых дендритных клеток на 5-й день в течениевниз по течению экспериментов пипетированием культивируемые клетки из 6-луночного планшета и в 50 мл центрифужные пробирки после пипеткой культуральной среды вверх и вниз несколько раз.
  9. Граф клеток и окрашивать образец изолированных моноцитов с анти-человеческим антителам против CD11b, CD11c, и, DC-SIGN / CD209, вместе с жизнеспособность клеток красителя. Для того, чтобы избежать неспецифического связывания антител во время окрашивания поверхности, настоятельно рекомендуется использование рецептора Fc блокирующих реагентов или бычий сывороточный альбумин (БСА) буферы.
  10. Анализ образца, используя жизнеспособность клеток краситель, в соответствии с протоколом производителя, выполняя проточной цитометрии для оценки чистоты и жизнеспособность генерируемых IDCS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После центрифугирования анти-свернувшейся крови , используя подушку сахарозы, одноядерные клетки периферической крови (РВМС) обогащены в интерфазе на верхней части градиента плотности среды (рисунок 1). После того , как МНПК отсасывают, анализ FACS выполняется для характеристики различных клеточных популяций в МНПК с использованием маркеров клональные (например, CD3 для Т - лимфоцитов, CD14 для моноцитов и CD19 для В - лимфоцитов). На фиг.2А пок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает генерацию моноцитов дендритные клетки (MDDCs) через изоляцию человеческих моноцитов из анти-свернувшейся крови с использованием магнитной наночастицы на основе анализа. В этом протоколе, этапы центрифугирования выполняют перед процедурой выделения клеток, что приводит к обогащению фракции РВМС. Хотя клетки теряются во время центрифугирования, чтобы перекрывать содержимое всего пакета крови на градиенте плотности среды, потребуется 200-300 мл градиента плотности среды, и, следовательно, не может с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить нашего техника Каролин Тернес, отдел гигиены и медицинской микробиологии, а также доктора Аннелиз Мюльбахер и доктора Пауля Хёртнагля, Центральный институт переливания крови и иммунологическое отделение, за их ценную помощь и поддержку в отношении этой рукописи. Мы благодарим Австрийский научный фонд за поддержку этой работы (P24598 DW, P25389 WP).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клон APC Мышь против человека CD19 HIB19BD Biosciences555415
Мышь APC Античеловеческий CD83 Клон HB15eBD Biosciences551073
BD Imag Античеловеческий CD14 Магнитные частицыBD Biosciences557769
BD ImagnetBD Biosciences552311
BSA (фракция альбумина V)Carl RothEG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-обработанные многолуночные планшетыCostar3506
Градиентная среда плотности: Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare Bio-Sciences17-5442-03
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер (D-PBS)Sigma-AldrichD8537
Falcon 10  мл Серологическая пипеткаCorning357551
Falcon 25  мл Серологическая пипеткаCorning357525
Falcon 50  мл Пробирка для центрифуги из полипропилена высокой прозрачностиCorning 352070
Трубки с круглым дном FalconCorning352054
FITC Мышь против человека CD3 Клон HIT3aBD Biosciences555339
Ghost Dye Violet 510 (реагент жизнеспособности клеток)Tonbo biosciences13-0870
GM-CSFMACS Miltenyi Biotec130-093-862
Термоинактивированная FBS (фетальная бычья сыворотка), одобренное ЕС происхождение (Южная Америка)Gibco10500-064
Hettich Rotanta 460RHettich---
IL-4 CCPromoKineC-61401
Изоляционный буфер: BD IMag Buffer (10x)BD Biosciences552362
раствор L-глутаминаSigma-AldrichG7513
Микроцентрифуга пробирки, 1,5 мл, SuperSpinVWR211-0015
PE Мышь Anti-Human CD14 Клон M5E2BD Biosciences555398
PE Мышь Anti-Human CD209 Клон DCN46BD Biosciences551265
RPMI-1640 средаSigma-AldrichR0883
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020

Ссылки

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  2. Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
  3. Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
  4. Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
  5. Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
  6. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
  7. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
  8. Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
  9. Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
  10. McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
  11. Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
  12. Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
  13. Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
  14. Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
  15. Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891(2010).
  16. Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).
  17. Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005(2015).
  18. Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
  19. Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение моноцитовдифференцировка дендритных клетокмагнитные частицы CD14центрифугирование в градиенте плотностиобогащение PBMCпроточная цитометрияинтерлейкин 4стимуляция GM-CSFнезрелые дендритные клеткипрезентация антигена
Поколение человеческих моноцитов дендритных клеток из цельной крови
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.