Методическая статья

Пептид происхождения Метод к транспорту генов и белков через клеточные и органелл барьеры в растений

13.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54972

⸱

16 декабря 2016 г.

 ,  , 
1Enzyme Research Team, RIKEN Center for Sustainable Resource Science

В этой статье

Краткое содержание

Существующие методы модификации растений имеют ограниченную применимость. Предложенная здесь новая технология, основанная на пептидах, обещает простоту и эффективность во внедрении экзогенного белка или генов в желаемые внутриклеточные компартменты интактных растений.

Аннотация

Способность вводить экзогенные белки и экспрессировать (или подавлять) специфические гены в растениях обеспечивает мощный инструмент для фундаментальных исследований, а также для новых применений в области биотехнологии растений. Жизнеспособные методы, которые в настоящее время существуют для переноса белка или гена в растительные клетки, а именно агробактерии и бомбардировка микроснарядами, имеют недостатки в виде низкой частоты трансформации, ограниченного диапазона хозяев или высокой стоимости оборудования и микроносителей. В следующем протоколе описан простой и универсальный метод, в котором используются рационально разработанные пептиды в качестве агентов доставки различных грузов на основе нуклеиновых кислот и белков в растения. Пептиды выбраны в качестве инструментов для разработки системы из-за их биоразлагаемости, уменьшенного размера, разнообразных и настраиваемых свойств, а также способности получать внутриклеточный/органеллярный доступ. Описана подготовка, характеризация и применение оптимизированных рецептур для каждого типа из широкого спектра доставляемых грузов (плазмидная ДНК, двухцепочечная ДНК или РНК, белок). Также обсуждаются критические шаги в рамках протокола, возможные модификации и существующие ограничения метода.

Введение

Генная инженерия растений обычно используется для передачи полезных признаков растениям. В последние годы эта технология применяется для преобразования заводов в биофабрики для производства фармацевтически важных и коммерчески ценных белков, многие из которых не могут быть химически синтезированы и очень дорогостоящи в производстве с использованием животных или микробныхсистем. Путем введения новых генов можно манипулировать собственным метаболизмом растения для производства различных биофармацевтических препаратов, таких как антитела, метаболические ферменты, гормоны, антигены или вакцина.

Устоявшиеся технологии переноса генов для растений включают в себя доставку агробактерий 3, бомбардировку микроснарядами с покрытием из ДНК (биолистика)4 и электропорацию5 или обработку протопластов полиэтиленгликолем6. Методов, требующих применения протопластов, обычно избегают, потому что они отнимают много времени, громоздки и дают противоречивые результаты7. В результате, практически вся работа по модификации растений в настоящее время использует либо агробактерии, либо микроснаряды для переноса генов. Метод «Агробактерия» используется более широко, но не применим ко многим экономически значимым видам растений. Между тем, бомбардировка микроснарядами более универсальна из-за широкого спектра восприимчивых растений, но требует специализированного оборудования и часто вызывает серьезное повреждение тканей. Кроме того, эти методы включают в себя либо случайный (биолистический), либо сложный (агробактерии) механизм доставки и имеют переменную скорость трансформации8. Следовательно, требуется новая технология трансформации завода, которая была бы простой, но эффективной и применимой к различным типам заводов.

В настоящее время растения подвергаются генетической модификации в первую очередь путем доставки экзогенной ДНК, кодирующей желаемый признак, а не путем прямой доставки целевого белка. Более высокая стабильность ДНК по сравнению с белками является основным преимуществом; тем не менее, потенциальные проблемы, связанные с доставкой ДНК, включают случайное встраивание экзогенной ДНК в геном растения и непреднамеренную передачу генов устойчивости к антибиотикам патогенным бактериям посредством горизонтальногопереноса генов9. Для целей редактирования генома возможность редактирования геномов растений без введения чужеродной ДНК в клетки может обойти регуляторные проблемы, связанные с генетически модифицированными растениями. Таким образом, альтернативная безДНК-стратегия модификации растений путем прямой доставки белка сможет удовлетворить эти потребности.

Здесь мы представляем систему на основе пептидов, первоначально разработанную для генной терапии человека10-14, для адресной доставки экзогенных генов или белков в интактные растения. Пептиды способны защищать ДНК от деградации нуклеаз и могут опосредуть перенос генов через клеточные, а также органеллярные мембраны15-17. Они также обладают разнообразными и настраиваемыми свойствами, помимо того, что являются нецитотоксическими18-20. Что еще более важно, с помощью пептидов гены могут быть точно нацелены на внутриклеточные органеллы, такие как митохондрии21 или пластиды (хлоропласты)22 для экспрессии – задача, недостижимая с помощью биолистической или агробактериальной трансформации. В зависимости от типа груза, эта новая технология модификации растений может быть использована для доставки белков23 и либо экспрессии (плазмида21,24 или двухцепочечная ДНК25), либо подавления (двухцепочечная РНК26) специфических генов внутри растения, в его цитозольном пространстве24-26 или в пределах конкретного органеллярного компартмента21. Разработанные пептиды-носители состоят из катионного домена в форме полилизина (K8) или полилизин-ко-гистидина (KH)9 для связывания и/или конденсации отрицательно заряженных грузов, который конъюгирован с последовательностями, проникающими в клетки (пептид BP100) или транзитными митохондриями (пептид Cytcox).

Протокол

1. Подготовка на основе пептидов рецептур

  1. Подготовка исходных растворов каждого пептида следующим образом : (КН) 9 -BP100 (1 мг / мл или 800 нМ), Cytcox- (КН) 9 (1 мг / мл), BP100 (1 мг / мл) и (BP100) 2 К 8 (70 мкМ). Взвешивают необходимое количество каждого пептида в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и добавьте автоклавированы сверхчистой воды для растворения пептида. Хорошо перемешайте повторным пипетированием до тех пор, пока не будет получен прозрачный раствор.
  2. Усиливаются и очищают плазмиды ДНК (плазмидной), двухцепочечной ДНК (дц) и двухцепочечной РНК (дцРНК) в соответствии со стандартными методиками молекулярных. В 1,5 мл микропробирок, делают маточные растворы с концентрацией 1 мг / мл (PDNA и дцДНК) или 400 нм (дцРНК).
  3. Подготовка белка маточного раствора с концентрацией 7 мкМ, растворением 1 мг белка (например., Алкогольдегидрогеназы, АДГ) порошка в 1 мл раствора карбоната натрия (0,1 М, рН 9). Добавьте белок с Fluorescent зонды, такие как родамина В (RhB) в соответствии со стандартными протоколами, с тем чтобы микроскопическую визуализацию белка, доставляемые в клетки.
  4. Объединяют соответствующие компоненты в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
    1. Для получения пептида-PDNA рецептуры нацеливание цитоплазму, добавьте 6,4 мкл (KH) 9 -BP100 (1 мг / мл) до 20 мкл плазмидной (1 мг / мл) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C. Добавить 773,6 мкл автоклавного сверхчистой воды для разбавления раствора до конечного объема 800 мкл. Используйте пДНК конструкцию , предназначенный для ядерной экспрессии (P35S-RLuc-TNOs, таблица 1).
    2. Для получения пептида-PDNA Препараты нацеливание митохондрии, добавляют 6,6 мкл Cytcox- (KH) 9 (1 мг / мл) до 20 мкл плазмидной (1 мг / мл) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° С и затем добавляют 2,4 мкл BP100 (1 мг / мл). Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при температуре 256; С в течение еще 15 мин. Добавить 771 мкл автоклавного сверхчистой воды для разбавления раствора до конечного объема 800 мкл. Используйте пДНК конструкцию , предназначенный для митохондриальной выражения (pDONR-COX2: rluc, таблица 1).
    3. Для составов пептид-дцДНК, добавляют 5,1 мкл (KH) 9 -BP100 (1 мг / мл) до 8 мкл двухцепочечной ДНК (1 мг / мл) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C. Добавить 786,9 мкл автоклавного сверхчистой воды для разбавления раствора до конечного объема 800 мкл.
    4. Для составов пептид-дцРНК, добавляют 50 мкл (KH) 9 -BP100 (800 нм) до 50 мкл дцРНК (400 нМ) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C. Добавьте 700 мкл РНКазы воды, чтобы разбавить раствор до конечного объема 800 мкл.
    5. Для составов пептид-белок, добавить 16 мкл (BP100) 2 K 8 (70 мкМ) до 16 мкл АДГ (7 мкм) и смешатьхорошо пипеткой. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C. Добавить 768 мкл автоклавного сверхчистой воды для разбавления раствора до конечного объема 800 мкл.
  5. Разрешить Препараты для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C.

2. Характеристика основе пептидов рецептур

  1. Передача каждого раствора (800 мкл) в кювету для динамического рассеяния света (DLS) анализа. Определить индекс гидродинамический диаметр и полидисперсности образованных комплексов с дзета Nanosizer, используя 633 нм He-Ne-лазера при 25 ° С с углом обнаружения обратного рассеяния 173 °.
  2. После измерения размера, передача каждого раствора (800 мкл) в сложенное капиллярной ячейки для измерения дзета-потенциала на параметры по умолчанию диэлектрической проницаемости, показатель преломления и вязкость воды при 25 ° С.
  3. Обратите внимание небольшой объем раствора комплекса, используемого для анализа DLS, методом атомно-силовой микроскопии (AFM). Депозит 10 мкл раствора комплекса на свеже открытой поверхности скола слюды листа и оставить слюду высохнуть на воздухе в течение ночи в закрытой пластиковой чашке Петри.
  4. Получения изображения комплексов в воздухе при 25 ° С с использованием кремниевого кантилевера с пружинной константой 1,3 Н / м в режиме 27,28 нарезание резьбы.

3. Проникновение листьев растений

  1. Используйте 3 - недельных почвы выращенных растений (Резуховидка Таля 24, Nicotiana benthamiana 24 или тополь 26). Трансфекцию по крайней мере 3 листьев, чтобы служить в качестве трех экземплярах для количественного определения экспрессии гена или белка доставки.
  2. Нагрузка 1 мл безыгольного пластиковый шприц с 100 мкл раствора комплекса для трансфекции одного листа. Поместите кончик шприца на абаксиальной поверхности листа.
  3. Нажмите наконечник шприца против листа слегка и нажмите на поршень шприца медленно в то время оказывая встречное давление с INDEX палец латексной перчатке с противоположной стороны. Успешное инфильтрации можно наблюдать, как растекание воды пропитанной области в листе. Этикетка проникших листья для облегчения идентификации.
  4. Выдержите трансфи- лист для оптимизированных длительностей следующие инфильтрации с пептидом-пДНК (12 ч), пептид-дц (12 ч), пептид-дсРНК - рецептур (9 48 ч) и пептид-белок (6 ч) при следующих условиях: 16 ч света / 8 ч темноты при 22 ° С для А. thaliana и тополя, или 24 ч постоянного света при 29 ° С для N. benthamiana.

4. Оценка эффективности трансфекции

  1. Акцизный весь трансфи- лист мелких растений (например., A. thaliana) или раздел 1 см 2 инфильтрированного области для более крупных растений (например., Н. benthamiana).
  2. Для экспериментов с трансфекцией с использованием Renilla люциферазы (Rluc) репортер вектор, определить transfectioп эффективность количественно с использованием набора Rluc анализа.
    1. Поместите каждую вырезанную лист или лист в секцию трубки микроцентрифужных 1,5 мл. Добавьте 100 мкл 1 × Rluc пробирной лизирующего буфера на пробирку. Таким же образом, готовить лизаты не-трансфецировали листьев контрольных (в трех повторах).
    2. Измельчите лист, используя гомогенизацию пестиком и инкубировать результирующую лизат при температуре 25 ° С в течение 6 - 10 ч.
    3. Центрифуга лизат при 12,470 × г в микроцентрифуге в течение 1 мин. Передача 20 мкл очищенного лизата в лунку в 96-луночный микропланшет, а также использовать оставшийся объем для количественного определения общей концентрации белка с использованием набора для анализа BCA Protein в соответствии с протоколом производителя.
    4. Добавьте 100 мкл 1 × Rluc пробирной субстрата (разводили с использованием Rluc буфером для анализа) в скважину и перемешать с помощью медленного пипеткой. Поместите планшет в планшет-ридере многомодового и начать измерение.
    5. Вычтите фоновое свечение (среднее значение такого нетн-трансфицировали трех экземплярах) от люминесценции каждого экспериментального образца. Рассчитать отношение фотолюминесценции (относительных световых единицах, RLU) на количество белка (мг).
  3. Для экспериментов с трансфекцией с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) репортер вектора или флуоресцентно меченого белка (например., АДГ-RhB), наблюдать флуоресценцию с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
    1. Обрежьте края целого листа (для облегчения удаления воздушных прослоек), в то время как секционная лист может быть использован как таковой. Извлекают поршень из шприца 10 мл и поместить каждую вырезанную листьев или листьев участок в шприце.
    2. Заменить плунжер и толкать его осторожно на дно шприца без дробления листа. Draw воду в шприц до тех пор, пока не будет приблизительно наполовину заполнена.
    3. Направить шприц вверх и нажать на поршень, чтобы удалить воздух из шприца через наконечник. Накройте кончик шприца и потяните поршень вниз медленно, чтобы удалить воздух из LEAе. Повторите эту процедуру несколько раз, пока лист не появится полупрозрачная.
    4. Покройте поверхность предметного стекла микроскопа с помощью клейкой ленты. Вырежьте квадратную область на ленте достаточно большой, чтобы вместить образец листа с помощью ножа, и кожура квадратный кусок ленты от пинцетом, чтобы создать образец камеры. Лента будет служить в качестве прокладки между предметным и покровным.
    5. Поместите лист в камере с абаксиальной поверхностью, обращенной вверх, и заполнить оставшуюся площадь камеры с водой. Печать листа внутри камеры с покровным стеклом и закрепить края покровного стекла с помощью клейкой ленты.
    6. Осмотрите образец листа с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии под объективом 40х или иммерсионный объектив 63X воды. GFP или RhB флуоресценции могут быть визуализированы при возбуждении длины волны 488 нм или 555 нм, соответственно.

Результаты

Массив кислот и белков грузов нуклеиновых были успешно внедрены в различных растений с использованием разработанных пептидов в качестве векторов доставки. Электростатическое взаимодействие между катионными пептидами и отрицательно заряженных грузов привело к образованию комплексов трансфекции , которые могут быть непосредственно инфильтрации в листьях растений с помощью безыгольного шприца (Рисунок 1). Оптимизированные рецептуры (эмпирически определенные в этих исследованиях 21,23-26) для трансфекции клеток растений, перечислены в таблице 1, где представлен каждый тип широкого спектра поставляемых грузов (пДНК, дцДНК, дцРНК и белок). Средние диаметры всех пептидных на основе рецептур в диапазоне приблизительно от 150 - 300 нм. На основе анализа DLS, все составы показаны относительно низкие полидисперсность размера, что указывает, что агрегаты, образованные пептид-грузовой имеют равномерное распределение по размерам. Морфологиякомплексов между пептидом и пДНК (Рисунок 2А) или белка (рис 2В), на слюду, были обследованы с помощью атомно - силовой микроскопии. Однородные шаровидные комплексы наблюдались для обоих пептидных-пДНК и пептид-белковых комбинаций, в согласии с данными измерений DLS. С точки зрения дзета - потенциала комплексов (таблица 1), pDNA- и дц-полученные комплексы были чистые заряды отрицательной поверхности в то время как дсРНК на основе комплексов была почти нейтральной поверхностный заряд. Пептид-белковых комплексов, с другой стороны, были положительно заряженными.

Эффективности пептид-пДНК и рецептур пептид-дцДНК в опосредовании трансфекцию A. thaliana или N. benthamiana в качестве модельных систем растений оценивали количественно, а также качественно. Экспрессия гена анализа RLuc использовали для количественной оценки уровней экспрессии генов (таблица 1), поэтому для этого эксперимента плазмидной илидц, кодирующий ген RLuc должен быть использован для комплексообразования с соответствующими пептидами-носителями. Используя (KH) 9 -BP100 / рецептура пДНК, ядерно-направленной доставки и экспрессии плазмидной может быть достигнуто, после инкубационного периода продолжительностью в 12 часов, с предполагаемой RLU / мг значения приблизительно 1 × 10 5. Для митохондриальной-направленной доставки и экспрессии плазмидной, сочетание пептидов, Cytcox- (KH) 9 и BP100, требуется для образования комплекса. С тем же самым оптимизированным инкубационного периода в 12 часов, однако, намного более низкий уровень трансфекции (примерно 1 × 10 3 о.е. / мг) была достигнута. В то же время, требовалось подобное Инкубационный период (12 ч) и уровень экспрессии гена (приблизительно 1 × 10 3 RLU / мг) / регистрируются для комплексов дц на основе, а также сформулированы с использованием (KH) 9 -BP100 пептида. Качественные оценки экспрессии генов проводили путем прямого микроскопического наблюдения листьев, обработанных комплексов ДГОред использованием пДНК или дц, кодирующий ген GFP-репортер. В клетках , трансфицированных нецелевых пептид-пДНК комплексов, диффузный зеленую флуоресценцию , соответствующую экспрессию GFP отчетливо наблюдалась и нашел для локализации в цитоплазме (рис 3А). Четкие различия в характере локализации флуоресценции GFP были очевидны в клетках, внедренных с митохондриальных-мишенью пептид-пДНК комплексов. Здесь, точечное зеленая флуоресценция , которая локализуется с митохондриальной пятно было видно, что подтверждает специфичность экспрессии генов исключительно в митохондриальной отделении клеток (фиг.3В).

В случае препаратов пептид-белок, конъюгирование белка груза (АДГ) до флуорофор (RhB) позволит получать визуализацию поставляемого белка в внутриклеточное. В течение короткого инкубационного периода от 6 ч, был обнаружен белок АДГ-RhB (синий), которые будут распределены по всемуцитозоль и вакуоли проникших клеток (рис 3C). В то же время, быстрое и эффективное понижающая регуляция экспрессии генов может быть достигнуто в различных растениях с использованием составов пептид-дцРНК. В первом эксперименте, А. thaliana листьев пропитывали с пептидной-дсРНК комплексов , чтобы заставить замолчать ген халкон - синтазы (CHS) , ответственные за антоцианов (красный пигмент) биосинтеза в условиях засухи. Разница во внешности A. thaliana листьев при нормальных условиях (рис 3D, а) и засухи (рис 3D, б) при условии легкое средство для оценки CHS заглушающие с использованием оптимизированной рецептурой пептид-дсРНК (стрелка 1 указывает на пропитанную область). Во втором эксперименте, пептид-дцРНК комплексы проникали в листьях трансгенного A. thaliana , экспрессирующих желтого флуоресцентного белка (YFP). Явное снижение экспрессии YFP можно было увидеть в клетках эпидермиса 9 ч рОСТ-трансфекцию (рис 3E, F). Эффективность препарата в экспрессии гена понижающего регулирования в другой системе растений (тополь, 12 ч после трансфекции) была также проверена (рис 3G, H).

figure-results-1
Рисунок 1: Пептид основе Препараты для доставки нуклеиновых кислот и белков грузам в живых растений.
Разработанные пептиды-носители состоят из поликатионов, конъюгированных с клеточной проникающего или органелл последовательностей транзита. Поликатионы дают возможность связывания и / или конденсация отрицательно заряженных грузов, а также побег из эндосомный отсека следующие интернализации в клетки. Доставка грузов в клетки, а затем в специфических органеллах опосредуется клеток проникающего последовательностей и последовательностей органелл транзита, соответственно. Различные грузы, которые могут быть successfuLLY доставлены в растение включают нуклеиновые кислоты, такие как пДНК, дцДНК и дцРНК, а также модельные белки, такие как бычий сывороточный альбумин (БСА), алкогольдегидрогеназы (АДГ) и цитрин (вариант желтого флуоресцентного белка). Биоактивные молекулы способны образовывать комплексы с трансфекцию пептидных конъюгатов через электростатических взаимодействий, которые вводятся в листьях растений с помощью шприца инфильтрации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Морфология основе пептидов Рецептуры.
(A) AFM амплитуда изображения (KH) 9 -BP100 композиции / пДНК при N / P 0,5. (B) Высота AFM изображение (BP100) 2 K 8 / препарата АДГ при молярном ратиO 10. Воспроизводится с разрешения из опубликованных источников 23,24. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: микроскопическая оценка трансфекционного Efficiencies с оптимизированной пептидной основе рецептур.
(А) выражение цитозольного GFP (зеленый), четко отличать от хлоропластов автофлюоресценции (красный), наблюдалось в губчатой мезофильных клетках A. thaliana листьев инфильтрации (KH) 9 композиции -BP100 / пДНК (N / P 0,5; 12 ч ). (B) выражение GFP (зеленый) был обнаружен в митохондриях (красный) в эпидермальных клетках A. thaliana листьев инфильтрации Cytcox- (KH) 9 / BP100 композиции / пДНК (N / P 0,5 для каждого пептиде; 12 ч). Увеличенные изображения митохондрий с выражением GFP показаны в крайнем правом панели. (С) Поставка ADH-RHB (синий) в губчатую мезофильных клетках A. thaliana листьев опосредована (BP100) 2 К 8 при мольном соотношении пептид / белок , 10, визуализируются 6 ч после инфильтрации. (D) A. thaliana листьев до (а) и после (б) обработки (KH) 9 -BP100 / препарат дсРНК (мольное отношение 2; 48 ч), что привело к подавлению биосинтеза антоцианов. Аналогичный препарат , содержащий GFP5 дсРНК пропитывали в лист в качестве отрицательного контроля (с). Стрелки 1 и 3 показывают инфильтрированного область в то время как стрелки 2 и 4 указывают на не-инфильтрированного область внутри листа. (Е) А. thaliana листьев выражения желтого флуоресцентного белка (YFP) и (F) Уменьшенный YFP флуоресценции следующую инфильтрации (КН) 9 -BP100 / дсРНК рецептура (мольное отношение 2; 9 ч). (G) Трансгенные листьев тополя , выражающие желтый флуоресцентный белок (YFP) и (H) уменьшенная YFP флуоресценции следуя инфильтрация (KH) 9 -BP100 / дсРНК формулировка (мольное отношение 2, 12 ч). Воспроизводится с разрешения из опубликованных источников 21,23,24,26. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Изменение пептидом-к-ДНК (N / P) Соотношение и влияние на биофизические свойства комплексов.
С увеличением пептида с соотношением ДНК, составы на основе пептидов уменьшаются в размерах в то время как их дзета-потенциал значений перехода от отрицательного к положительному./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Таблица 1: Характеристика и оценка различных композиций на основе пептидов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.

figure-results-6
Таблица 2: Сравнение на основе пептидов и других существующих технологий ДНК для доставки интактных растений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.

Обсуждение

Критические шаги в рамках протокола, которые были определены эмпирически обсуждаются. С помощью шприца инфильтрации, препараты на основе пептидов, вводятся в воздушном пространстве внутри листа растения через устьица. Для того, чтобы обеспечить максимальное поглощение раствора, процесс инфильтрации следует проводить , когда растения в условиях, которые способствуют устьичным открытию то есть., При условии , с достаточным количеством воды и в течение светового периода. Что касается подготовки трансфекцию комплексов, для составов, которые включают комбинацию двух пептидов (для доставки ДНК митохондриальной-мишенью), последовательность для добавления каждого компонента имеет решающее значение и не должна быть перевернутой.

Есть много правдоподобных изменения в процедуре. Еще один вариант для инфильтрации клеток растений является использование вакуумной пропитки, которая способна ввести комплексное решение в целые растения и / или частичной тканей, включаяапикальные меристемы. Для этой альтернативной процедуры, рассаду погружают в раствор для трансфекции, а также на основании давления, создаваемого вакуума, пептид-грузовые комплексы вынуждены через устьица и в клетках растений (Yoshizumi, T., неопубликованные данные).

Кратковременная экспрессия гена, основанный на исследованиях с использованием животных клеток, было показано , что увеличение с более высокими концентрациями ДНК 29-31. Важно отметить , что отношение пептида к ДНК влияет на биофизические свойства (размер, поверхность заменяющим ) комплексов (рис 4), который влияет на эффективность трансфекции; следовательно, оптимальное соотношение должно поддерживаться даже с повышенной концентрацией ДНК.

Одним из главных преимуществ в использовании пептидов, как ген / белок агента доставки является то, что его последовательность поддается настройке для выполнения требуемой функции. Например, митохондриальная-направляющий домен пептида-носителя описано в данном шпилькеу может быть заменен хлорпластического или пероксисом нацеливания последовательностей для локализации этих органелл. В то время как трансформация хлоропластов возможно в нескольких растений с использованием биолистики 32-34, ни Agrobacterium , ни биолистической метод может ввести гены в митохондрии или других органеллах , помимо ядра (таблица 2).

Там нет жестких ограничений хост-диапазона для пептидной основе трансфекции, в отличие от метода Agrobacterium -На (таблица 2). До сих пор, составы для трансфекции A. thaliana, Н. benthamiana и тополя были оптимизированы (таблица 1), но метод может быть применен для Nicotiana аЬасит, томатный сорт Микро-Том, рис (на основе предварительных экспериментов), и другие моно- и двудольных растений.

Пока еще не существует известное ограничение размера трансгена, когда пептиды используютs трансфекции векторов. В противоположность этому , большие молекулы ДНК было обнаружено, что снижает эффективность трансформации Agrobacterium опосредованной методов 35,36, а верхний предел размера для трансгенов приблизительно 200 кб было сообщено 37-39. Использование биолистики, с другой стороны, большие ДНК - фрагменты могут быть стриженый во время приготовления или доставки в растения 38. Хотя верхний предел не был определен для баллистической трансформации до сих пор, физические сдерживает были найдены , чтобы ограничить размер ДНК , которые могут быть переданы намного меньше , чем 150 кб 40. Основные преимущества использования системы на основе пептидов для переноса генов по сравнению с существующими подходами по принципу либо Agrobacterium или бомбардировки микрочастицами, рассмотренных выше, приведены в таблице 2.

существует несколько ограничений для этого метода в его нынешнем виде. Во-первых, направленную доставку пДНК к конкретным органелл, таких как МИТochondria, было доказано, возможно, с помощью простого сочетания ДНК-связывающих клеток, проникающих и органелл транзитных последовательностей хотя эффективность была низкой. экспрессии трансгена может быть обнаружена, с помощью конфокальной микроскопии, только в небольшой популяции митохондрий в клетках. Следовательно, дальнейшие модификации необходимы для: (I) повышения транслокацию более комплексов через клеточную / органоидного мембраны, и (II), улучшение диссоциации и передачи пДНК от пептида-носителя в целевую органеллы для экспрессии. Во-вторых, с помощью этой системы доставки ДНК, временной экспрессии экзогенных генов репортер был успешно достигнут в цитозольной и митохондриальной отделении клеток. Стабильное включение и экспрессия введенных генов в растении ядерном / органоидного генома еще не были установлены, однако, из-за отсутствия подходящих стратегий отбора.

Признавая, что есть области для улучшения или дальнейшего гАЗВИТИЕ, стратегия пептид, полученных описанным здесь остается простой и универсальный метод, который проложил путь для доставки различных грузов в различных видах растений.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить финансирование из Японии науки и технологии агентства Поисковое исследование перспективных технологий (JST-ERATO), в новых энергетических и промышленных технологий развития организации (NEDO), а также стратегической программы продвижения инноваций межведомственный (SIP), Япония ,

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
пептид (KH)9-BP100Специально синтезирован Институтом науки о мозге RIKENН/АПоследовательность: KHKHKHKHKHKHKHKH-
KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8 пептидСпециально синтезирован Институтом науки о мозге RIKENN/AПоследовательность: KKLFKKILKYLKKLFKKIL-
пептид KYLKKKKKKKKKK
BP100 пептидBP100Специально синтезирован Институтом науки о мозге RIKENН/АПоследовательность: пептид KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9Специально синтезирован Институтом науки о мозге RIKENН/АПоследовательность: MLSLRQSIRFFKKHKHKH-
KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS и P35S-RLuc-TNOSН/ДН/ДКодирует гены зеленого флуоресцентного белка и Renilla luciferase, соответственно, под контролем конститутивного промотора CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp и pDONR-cox2:rlucN/A/AКодирует гены зеленого флуоресцентного белка и Renilla luciferase, соответственно, под контролем митохондриально-специфического промотора cox2 (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (ПЦР-амплифицировано из pBI221-P35S-Rluc-TNOS)N/AN/A N/AКодирует гены зеленого флуоресцентного белка и Renilla luciferase, соответственно, под контролем конститутивного промотора CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNAN/A N/AДля РНК-интерференцированного подавления зеленого флуоресцентного белка (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNAN/AN/AДля РНК-интерференцированного подавления хальконсинтазы (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 мл и 10 мл пластиковых шприцевTERUMO CorporationSS-01T, SS-10ESZ
1,5 мл Микроцентрифужная пробиркаAS ONE Corporation151212
96-луночная плоскодонная пластинаAsahi Glass Co., Ltd.3860-096
Клейкая лентаSekisui Chemical Co., Ltd.No 835
АлкогольдегидрогеназаSigma-Aldrich Co., LLC.A-7011
Атомно-силовой микроскопSeiko Instruments Inc.SPI3800, SPA 300HV
Атомно-силовой микроскопHitachi High-Tech Science CorporationAFM5300E
набор для анализа белка BCAThermo Fisher Scientific Inc.23227
КонсольныйHitachi High-Tech Science CorporationK-A102001593
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопCarl ZeissLSM700
Cork BorerSigma-Aldrich Co., LLC.Z165220Для вырезания листьев на диски диаметром 1 см
CoverslipMatsunami Glass Ind., Ltd.C02261
КюветаSarstedt759116
Folded Capillaral CellMalvern Instruments, Ltd.
ЩипцыShimizu Akira Inc.Нержавеющий пенсет 150
Гомогенизация ПестикIeda Trading Corp.9993
МикаНиссин ЭМ Ко., Лтд.LC23Z
МикроцентрифугаBeckman CoulterBKA46472
Считыватель микропланшетовMolecular Devices CorporationSpectra MAX M3
Предметное стеклоMatsunami Glass Ind., Ltd.
Наконечники для пипетокEppendorf Research® plus3120000909
Наконечники для пипетокAS ONE Corporation2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Пластиковая чашка ПетриAS ONE Corporation1-7484-01
Набор для анализа Renilla Luciferase Набор для анализаPromega CorporationE2810
Родамин B ИзотиоцианатСигма-Олдрич Ко., ООО.
Вода без РНКазыQiagen129112
карбоната натрияWako Pure Chemical Industries, Ltd.199-01585
Хирургическое лезвие и ручкаFEATHER Safety Razor Co., Ltd.Нержавеющая сталь No14 (лезвие), No3L (ручка)
Колпачок с наконечником шприцаMusashi Engineering Inc.NC-3E
ВесыSartoriusCPA225D
Zeta PotentiometerMalvern Instruments, Ltd.Zetasizer Nano-ZS
NDTS1070S011120283924

Ссылки

  1. Altman, A., Hasegawa, P. M. Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , Academic Press. Cambridge, MA. (2011).
  2. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).
  3. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
  4. Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 327, 70-73 (1987).
  5. Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).
  6. Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 296, 72-74 (1982).
  7. Birch, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).
  8. Newell, C. A. Plant transformation technology. Developments and applications. Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).
  9. Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event? FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).
  10. Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. Engineering in Translational Medicine. Cai, W. , Springer. 667-689 (2014).
  11. Nitta, S., Numata, K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).
  12. Numata, K. Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials. Polym. J. 47, 537-545 (2015).
  13. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).
  14. Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).
  15. Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).
  16. Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells. ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).
  17. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).
  18. Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).
  19. Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery. Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).
  20. Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery. Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).
  21. Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers. Sci. Rep. 5, 7751(2015).
  22. Plant transformation method. Patent. , WO2015133652 A1 (2015).
  23. Ng, K. K., et al. Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides. PLoS ONE. 11, e0154081(2016).
  24. Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers. Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).
  25. Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes. Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).
  26. Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).
  27. Numata, K., et al. Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates. Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).
  28. Numata, K., et al. Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM. Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).
  29. Kawai, S., Nishizawa, M. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).
  30. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  31. Luo, D., Saltzman, W. M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface. Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).
  32. Boynton, J. E., et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science. 240, 1534-1538 (1988).
  33. Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. Plastid transformation. Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).
  34. Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).
  35. Liu, Y. G., et al. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).
  36. Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).
  37. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).
  38. Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Front. Plant Sci. 5, 379(2014).
  39. Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).
  40. Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). Transgenic Crops I. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи