Method Article

Развитие прямого Pulp-укупорки модель для оценки пульпозного ранозаживляющим и Репаративная дентина Формирование у мышей

DOI:

10.3791/54973

⸱

January 12th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Shapiro Family Laboratory of Viral Oncology and Aging Research, The UCLA School of Dentistry, 2UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, 3David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы опишем метод шаг за шагом выполнения прямых пульпы на мышах зубов для оценки пульпарного заживления раны и формирования репаративного дентина в естественных условиях.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зубная пульпа - это жизненно важный орган зуба, полностью защищенный эмалью и дентином. Когда пульпа подвергается воздействию из-за кариесогенных или ятрогенных повреждений, ее часто закрывают биосовместимыми материалами, чтобы ускорить заживление пульпозной раны. Конечная цель состоит в том, чтобы регенерировать репаративный дентин, физический барьер, который функционирует как «биологическое уплотнение» и защищает подлежащую ткань пульпы. Несмотря на то, что эта процедура прямого удаления пульпы уже давно используется в стоматологии, молекулярный механизм заживления пульпозной раны и образования репаративного дентина до сих пор плохо изучен. Чтобы индуцировать репаративный дентин, укупорка пульпы была проведена экспериментально у крупных животных, но в меньшей степени у мышей, предположительно из-за их небольших размеров и вытекающих из этого технических трудностей. Здесь мы представляем подробный, пошаговый метод выполнения процедуры укупорки пульпы у мышей, включая подготовку полости, подобной полости класса I, размещение материалов для укупорки пульпы и процедуру реставрации с использованием стоматологического композита. Наша модель мышей с крышкой пульпы будет играть важную роль в исследовании фундаментальных молекулярных механизмов заживления пульпозной раны в контексте репаративного дентина in vivo, позволяя использовать трансгенных или нокаутных мышей, которые широко доступны в исследовательском сообществе.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кариес зубов является одним из наиболее распространенных заболеваний полости рта и основной причиной хирургических вмешательств в зубные ряды почти у всех людей1,2. Прогноз хирургических вмешательств и реставраций зуба во многом зависит от правильной реакции пульпы и успешного заживления раны. Действительно, кариес, который проникает глубоко через эмаль и дентин, часто приводит к обнажению подлежащей пульпы, которая часто «закрыта» стоматологическими материалами, такими как гидроксид кальция (Ca(OH)2) или гидравлические кальциево-силикатные цементы (HCSC), включая минеральные триоксидные агрегаты (MTA). Конечной целью такой процедуры укупорки пульпы является ускорение заживления пульпозной раны путем регенерации репаративного дентина, физического барьера, который функционирует как «биологическое уплотнение» для защиты подлежащей пульпы ткани и увеличения продолжительности жизни зуба и общего здоровья полости рта. Тем не менее, основной механизм заживления пульпозной раны и образования репаративного дентина до конца не изучен.

Чтобы лучше понять механизмы заживления пульпозной раны и образования репаративного дентина in vivo, ранее использовали несколько животных, включая обезьян, собак и свиней3-5. Среди них часто используются крысы, потому что они относительно меньше по размеру по сравнению с другими животными, но их зубы достаточно велики, чтобы выполнять прямое закрытие пульпы безкаких-либо технических трудностей. Эти животные модели являются идеальной альтернативой исследованиям на людях для изучения реакций пульпы и образования репаративного дентина. Тем не менее, их использование ограничено наблюдательными исследованиями на клеточном уровне, и они едва ли дают механистическое понимание во время образования репаративного дентина на молекулярном уровне.

Последние технические достижения в области генной инженерии предоставили бесценные и незаменимые исследовательские инструменты - мыши, которые содержат ген, который либо сверхэкспрессируется, либо удаляется, - которые играют важную роль в изучении молекулярных механизмов заболеваний человека in vivo. В научном сообществе постоянно растет количество различных штаммов трансгенных или нокаутных мышей, которые стратегически индуцируются клеточно-специфическим образом. Таким образом, изучение заживления пульпозной раны и регенерации репаративного дентина у этих мышей значительно помогло бы ускорить наше понимание этих процессов на молекулярном уровне. Тем не менее, использование мышей значительно ограничено, так как выполнение процедуры капирования пульпы на зубе мыши технически сложно из-за его миниатюрного размера. Здесь мы представляем наш воспроизводимый метод выполнения прямого укупорки пульпы у мышей для оценки заживления пульпозной раны и образования репаративного дентина in vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мыши были приобретены у Jackson Laboratory и хранятся в патогена вивария в UCLA Отдел лабораторных животных медицины (DLAM). Эксперименты проводились в соответствии с утвержденными институциональными руководствами Исследовательского комитета канцлера животных (ARC # 2016-037).

1. Мышь обезболиванием

  1. Используйте восемь-недельных самок мышей C57 / НД6 (п = 3).
  2. Обезболить мышей с использованием растворов (5 мг / кг веса мыши) кетамином (80-120 мг / кг веса мыши) / ксилазина и управлять внутрибрюшинно (IP) в дозе 10 мл / кг.
  3. Приготовьте кетамином (80 - 120 мг / кг) / ксилазином (5 мг / кг) растворы и вводить их внутрибрюшинно (IP) в дозе 10 мл / кг.
  4. Убедитесь, что мыши полностью под наркозом, выполняя носок щепотку.

2. Целлюлозно-укупорки Процедура

  1. Поместите держатель рот в рот мыши.
  2. Закрепите держатель рта на стол таким образом, чтобы онОбъявление обращена вверх.
  3. Поместите микроскоп (10x) в верхней части рта, так что первый верхнечелюстной молярной полностью виден.
  4. Используя ¼ круглый бур в высокоскоростном наконечнике при 200000 оборотов в минуту, удалите эмаль часть зуба в середине, пока мякоть не видна через прозрачный дентин. Не подвергать мякоть с бором.
  5. Использование # 15 эндодонтического K-файл (диаметр 150 мкм), перфорировать через дентина и подвергать мякоть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание следует соблюдать осторожность, чтобы дентин мусор не получает проталкивается в пульпе. Этого можно избежать путем поворота K-файл ежеквартально, а затем потянув K-файл из.
  6. Смешайте MTA стерильной H 2 O в соответствии с инструкциями изготовителя. Доставка и поместите АПС на открытую пульпу с наконечником исследователя. Используйте обратную сторону точки бумаги (штраф), чтобы упаковать АПС в обнаженную пульпу Осторожным нарезании резьбы. Чем толще сторона точки бумаги является плоской, и, следовательно, позволяетдля надлежащего конденсации МТА в обнаженную пульпу.
  7. Протравите зуб за 15 сек путем размещения 35% травильного фосфорной кислоты, где она просто покрывает зуб. Соблюдайте особую осторожность, чтобы ограничить размещение травителя, так как это может вызвать раздражение тканей десны.
    Примечание: травителя приходит в шприц и используется для придания шероховатости поверхности зубов таким образом, что зубные клеи могут протекать в посредничать микромеханическую склеивание на зуб. Поскольку они являются вязкими, он может быть самодостаточным путем применения небольших количеств непосредственно на зуб.
  8. Используйте отрицательное-давление всасывания для удаления травителя. Используйте ватный шарик , который слегка смоченную H 2 O , чтобы удалить остатки травителя. Повторите этот шаг до тех пор, пока травитель полностью удаляется из зуба.
  9. Использование воздуха тряпку сжатый, осторожно высушить зуб.
  10. Примените стоматологические клеи, используя тыльную точки бумаги.
  11. Сделать клеевой слой тонкий с помощью сжатого воздуха в течение 3 сек.
  12. СЮр стоматологические клеи для 20 с помощью отверждения света блок.
  13. Поместите текучий композит в небольших количествах на зуб, который был ограничен с МТА. Используйте кончик исследователя течь композита в пазы зуба.
  14. Отверждение композита в течение 30 с с использованием свето- полимеризационное полимеризоваться его. Убедитесь, что композит полностью вылечить и трудно с помощью проводника.

3. Послеоперационное уход

  1. Администрирование карпрофен (5 мг / кг) подкожно (подкожно) сразу после процедуры целлюлозно-укупорки.
  2. Поместите мышей на грелку при низкой мощности, чтобы держать животных теплой, прежде чем они просыпаются.
  3. Вернуть мышей в виварии для жилищного строительства.

4. Тканевая закупок

  1. Через 5 - 6 недель, усыпить мышей путем смещения шейных позвонков при полном анестетика состоянии с изофлуран.
  2. Осторожно снимите верхнюю челюсть из основания черепа и поместить его в пробирку 50 мл. Закрепить entirе максилла, что содержит как целлюлозный вершины зуба и контралатеральной кэппированную зуб в 4% параформальдегид в PBS, рН 7,4, при 4 ° С в течение ночи, а затем хранить его в 70% -ном растворе этанола.
    Примечание: параформальдегид является токсичным и канцерогенным. Правильное использование параформальдегид следует контролировать, как описано в стандартных операционных процедур (СОП).
  3. Сканирование Максиллы мыши с помощью сканирования μCT. Для обеспечения Максиллы во время сканирования, завернуть образцы с марлей, смоченной 70% -ным этанолом и помещают их в культуре клеток трубки 15 мл.

5. μCT Сканирование

  1. Подготовка образцов для сканирования μCT. Если коротко, то завернуть образцы с марлей, смоченной 70% -ным этанолом и закрепить их в родовом 15-мл клеточной культуры коническую трубку. Установите трубки на этапе сканирования μCT, как указано в инструкции изготовителя.
  2. Установите источник рентгеновского излучения с током 145 мкА, напряжение 55 кВп, и временем экспозиции 200 мс.
  3. Выполните получение изображений с помощью сканера μCT с разрешением 20 мкм и с Al фильтром 0,5 мм.
  4. Реконструировать изображения и визуализировать его 11.
  5. После того, как μCT сканирование завершено, начинают декальцификацию с 5% ЭДТА и 4% сахарозы в PBS (рН 7,4) в течение 2-х недель.

6. обработка ткани и Окрашивание

  1. Встраивать декальцинированной ткани в парафин. Перед тем как вложение, обрезать верхнюю челюсть, сделав сагиттальный разрез непосредственно впереди первого моляра. В то время как вложение, расположить эту поверхность вниз, таким образом, что продольное сечение первого моляра является режущая поверхность.
  2. Используя микротом, подготовить 5 мкм толщиной слайды. Пульпа-укупорочные районы, как правило, совпадает с distopalatal (DP), корень, который может быть использован в качестве ориентира. Определить точную сферу интересов путем изучения гистологии под световым микроскопом и сравнивая изображения μCT.
  3. Для H & E окрашивания, deparaffinize и регидратации слайды с ксилолом (2 раза) и серийно разведенной этанолом (100% этанола в 2 раза, 95% этанола 2x и 70% этанола 1x).
  4. Промыть слайды с проточной водопроводной водой.
  5. Пятно с раствором гематоксилин в течение 2,5 мин и сполоснуть водой.
  6. Dip слайдов в 95% этаноле в течение 1 мин.
  7. Пятно раствором эозина в течение 1 мин и сполоснуть водой.
  8. Высушить с серийно разведенной этанолом (70% этанола 1x, 95% этанола 2x, и 100% этанола 3x) и ксилол (3x).
  9. Установите слайды с монтажным решением.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы показали процедуры шаг за шагом выполнить покрытие пульпы на мышах зубов. Одним из ключевых аспектов пульпы у мышей должна иметь соответствующее устройство. В связи с этим, имея микроскопа с 10 - кратным увеличением мощности является существенным (Фиг.1А). Чтобы создать класс-I-подобный препарат в зуб, мы использовали ¼ круглый заусенцев в электрической высокой скорости наконечник при 200000 оборотов в минуту (рис 1В). В качестве альтернативы, л...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящее время существует несколько различных экспериментальных моделей , доступных для проверки эффектов в естественных условиях стоматологических материалов, строительных лесов, или факторов роста на одонтогенного дифференциации зубных стволовых клеток пульпы (DPSCs) 13. Эти модели включают в себя внематочной аутологичной трансплантации DPSCs в орган, такой как капсулу почки или подкожное трансплантацию DPSCs в иммунодефицитом мышей с подмостей 14,15. Тем не менее, эти методы ограниче...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано R01DE023348 (RHK) из NIDCR / NIH и Научно-исследовательского гранта факультета (RHK) из Совета по научным исследованиям ученого Сената Лос-Анджелеса отделения Калифорнийского университета.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Стереомикроскоп BM-LEDMEIJI TechnoMicroscope 
Optima MCX-LED Bien Air Dental1700588-001Электромоторный двигатель
изофлуранHenry scheinhealth NDC 11695-0500-2
1/4 круглый борBrasseler001092T0
Эндодонтический K-файлRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
Paper pointHenry schein100-3941
Ultra-EtchUltradent product Inc.Кислотный травитель
OptiBond SoloPlusKerr29669Клеи
Coltolux LEDColtene/whaledent Inc.C7970100115Отверждаемый световой блок
Характеризация тонировкиBiscoT-14012Текучий композитный
SkyscanBreuker1275uCT сканер
MicromThermoHM355SMicrotome
Hematoxyline-1Thermo Scientific7221
Eosin-YThermo Scientific7111
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-16Монтажное решение
animal

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dye, B., Thornton-Evans, G., Li, X., Iafolla, T. Dental caries and tooth loss in adults in the United States, 2011-2012. NCHS Data Brief. (197), 197(2015).
  2. Bagramian, R. A., Garcia-Godoy, F., Volpe, A. R. The global increase in dental caries. A pending public health crisis. Am J Dent. 22 (1), 3-8 (2009).
  3. Koliniotou-Koumpia, E., Tziafas, D. Pulpal responses following direct pulp capping of healthy dog teeth with dentine adhesive systems. J Dent. 33 (8), 639-647 (2005).
  4. Tarim, B., Hafez, A. A., Cox, C. F. Pulpal response to a resin-modified glass-ionomer material on nonexposed and exposed monkey pulps. Quintessence Int. 29 (8), 535-542 (1998).
  5. Tziafa, C., Koliniotou-Koumpia, E., Papadimitriou, S., Tziafas, D. Dentinogenic responses after direct pulp capping of miniature swine teeth with Biodentine. J Endod. 40 (12), 1967-1971 (2014).
  6. Dammaschke, T., Stratmann, U., Fischer, R. J., Sagheri, D., Schafer, E. A histologic investigation of direct pulp capping in rodents with dentin adhesives and calcium hydroxide. Quintessence Int. 41 (4), 62-71 (2010).
  7. Jegat, N., Septier, D., Veis, A., Poliard, A., Goldberg, M. Short-term effects of amelogenin gene splice products A+4 and A-4 implanted in the exposed rat molar pulp. Head Face Med. 3, 40(2007).
  8. Paterson, R. C., Radford, J. R., Watts, A. The response of the rat molar pulp of two proprietary calcium hydroxide preparations. Br Dent J. 151 (6), 184-186 (1981).
  9. Sela, J., Ulmansky, M. Reaction of normal and inflamed dental pulp to Calxyl and zinc oxide and eugenol in rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 30 (3), 425-430 (1970).
  10. Maurice, C. G., Schour, I. Experimental cavity preparations in the molar of the rat. J Dent Res. 34 (3), 429-434 (1955).
  11. Skyscan, N. V. NRecon user manual. , Available from: http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf (2011).
  12. Sohn, S., et al. The Role of ORAI1 in the Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J Dent Res. 94 (11), 1560-1567 (2015).
  13. Kim, S., Shin, S. J., Song, Y., Kim, E. In Vivo Experiments with Dental Pulp Stem Cells for Pulp-Dentin Complex Regeneration. Mediators Inflamm. 2015, 409347(2015).
  14. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  15. Yu, J., et al. Odontogenic capability: bone marrow stromal stem cells versus dental pulp stem cells. Biol Cell. 99 (8), 465-474 (2007).
  16. Zhu, X., et al. Transplantation of dental pulp stem cells and platelet-rich plasma for pulp regeneration. J Endod. 38 (12), 1604-1609 (2012).
  17. Iohara, K., et al. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res. 83 (8), 590-595 (2004).
  18. Saito, K., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Osteopontin Is Essential for Type I Collagen Secretion in Reparative Dentin. J Dent Res. , (2016).
  19. Hunter, D. J., et al. Wnt Acts as a Pro-Survival Signal to Enhance Dentin Regeneration. J Bone Miner Res. , (2015).
  20. Goldberg, M., Kulkarni, A. B., Young, M., Boskey, A. Dentin: structure, composition and mineralization. Front Biosci (Elite Ed). 3, 711-735 (2011).
  21. Nascimento, A. B., Fontana, U. F., Teixeira, H. M., Costa, C. A. Biocompatibility of a resin-modified glass-ionomer cement applied as pulp capping in human teeth). Am J Dent. 13 (1), 28-34 (2000).
  22. Bogen, G., Kim, J. S., Bakland, L. K. Direct pulp capping with mineral trioxide aggregate: an observational study. J Am Dent Assoc. 139 (3), 305-315 (2008).
  23. Miller, R. A., Nadon, N. L. Principles of animal use for gerontological research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 55 (3), 117-123 (2000).
  24. Shah, A., Song, M., Cao, Y., Kang, M. K., Kim, R. H. Osteoclasts are absent in pulpal and periapical inflammatory lesions. J Dent Res. 95, 1503(2016).
  25. Williams, D. W., et al. Impaired bone resorption and woven bone formation are associated with development of osteonecrosis of the jaw-like lesions by bisphosphonate and anti-receptor activator of NF-kappaB ligand antibody in mice). Am J Pathol. 184 (11), 3084-3093 (2014).
  26. McPherson, J. D., et al. A physical map of the human genome. Nature. 409 (6822), 934-941 (2001).
  27. Gregory, S. G., et al. A physical map of the mouse genome. Nature. 418 (6899), 743-750 (2002).
  28. Hilton, T. J. Keys to clinical success with pulp capping: a review of the literature. Oper Dent. 34 (5), 615-625 (2009).
  29. Holmdahl, R., Bockermann, R., Backlund, J., Yamada, H. The molecular pathogenesis of collagen-induced arthritis in mice--a model for rheumatoid arthritis. Ageing Res Rev. 1 (1), 135-147 (2002).
  30. Kalu, D. N., Chen, C. Ovariectomized murine model of postmenopausal calcium malabsorption. J Bone Miner Res. 14 (4), 593-601 (1999).
  31. Yokochi, T. A new experimental murine model for lipopolysaccharide-mediated lethal shock with lung injury. Innate Immun. 18 (2), 364-370 (2012).
  32. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Direct Pulp cappingPulpal Wound HealingReparative Dentin FormationMouse ModelCavity PreparationMTA PlacementDental CompositeMicro CT ScanHistological AnalysisDMP1 Staining

Related Articles