Методическая статья

3D цельнозерновой сердца Инфаркт Анализ тканей

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54974

⸱

12 апреля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Division Heart and Lungs, University Medical Center Utrecht, 2MIRA Institute, University Twente

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает новый метод для сравнения 3D цельной сердечной ткани миокарда с МРТ. Она предназначено для точной оценки интрамиокардиальных инъекций в пограничной зоне инфаркта хронической модели свиньи инфаркт миокарда.

Аннотация

Сердечные регенеративные терапии направлены на защиту и ремонт травмированного сердца у пациентов с ишемической болезнью сердца. Вводя стволовые клетки или другие биологические препараты, которые повышают ангио- или васкулогенез в пограничной зону инфаркта (IBZ), тканевая перфузия улучшается, и миокард может быть защищена от дальнейшего повреждения. Для достижения максимального терапевтического эффекта, он выдвинул гипотезу о том, что регенеративное вещество лучше всего поставлено на IBZ. Это требует точных инъекций и привел к разработке новых методов инъекций. Для проверки этих новых методов, мы разработали протокол проверки на основе анализа ткани миокарда. Этот протокол включает в себя целое сердце обработки ткани миокарда, которая позволяет подробный двумерный (2D) и трехмерной (3D) анализ сердечной анатомии и интрамиокардиальных инъекций. В свинью, инфаркт миокарда был создан 90-минутной окклюзии левой передней нисходящей коронарной артерии. Четыре недели спустя, микстЮр гидрогель с суперпарамагнитными частицами оксида железа (SPIOs) и флуоресцентными шариками вводили в IBZ с использованием минимально-инвазивным эндокардом подхода. 1 ч после процедуры инъекции, свинья была умерщвлены, и сердце вырезали и помещали в агарозе (агар). После затвердевания агара, были проведены магнитно-резонансная томография (МРТ), нарезка сердца и визуализация флуоресценции. После того, как изображение после обработки, 3D-анализ был проведен для оценки точности ориентации IBZ. Этот протокол обеспечивает структурированный и воспроизводимый метод для оценки точности ориентации интрамиокардиальных инъекций в IBZ. Протокол может быть легко использован, когда обработка рубцовой ткани и / или проверки точности впрыска всего сердца желательно.

Введение

Ишемическая болезнь сердца является ведущей в мире причина смерти в течение последних десятилетий 1. Острое лечение после инфаркта миокарда является восстановление кровотока в миокарде с помощью чрескожного коронарного вмешательства или коронарного шунтирования. В тяжелых инфарктов, большая площадь миокарда шрамы, и эти случаи часто приводят к ишемической сердечной недостаточности (СН) 2. Современные варианты лечения ВЧ внимание профилактике и сохранению функции сердца для пациентов с СН, но не на регенерацию.

В течение последнего десятилетия, сердечная регенеративная терапия была исследована как вариант лечения для HF 3. Эта терапия стремится поставлять биопрепараты, такие как стволовые клетки или факторы роста, непосредственно травмированный миокард , чтобы вызвать реваскуляризации, защиту кардиомиоцитов, дифференцировку и рост 4. Для оптимальнойтерапевтический эффект, она выдвинута гипотеза о том , что биологическое должен быть введен в зону инфаркта границы (IBZ) для облегчения хорошей тканевой перфузии для выживания биологического и для оптимального эффекта в целевой зоне 5, 6. Несколько методы были разработаны , чтобы выполнить идентификацию и визуализацию IBZ , чтобы направлять интрамиокардиальную инъекцию 7, 8, 9, 10, 11. Помимо идентификации и визуализации IBZ, доставка также опирается на биоматериалов и нагнетательных катетеров, используемых. Для проверки точности впрыска методов доставки, требуется точный и воспроизводимый метод количественного определения.

Мы разработали протокол для целого сердца обработки ткани миокарда, который предлагает двумерный (2D) и трех-dimensioNAL (3D) изображения, которые могут быть использованы для качественного и количественного анализа целей. Протокол охватывает процесс встраивания и анализ цифрового изображения. В данной работе мы демонстрируем протокол для оценки точности ориентации интрамиокардиальных инъекций в IBZ в большом свиных модель хронического инфаркта миокарда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперимент в естественных условиях был проведен в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных , подготовленных Институтом лабораторных исследований животных. Эксперимент был одобрен Комитетом местного Эксперименты на животных путем.

1. Подготовка и внедрение инъекционными Solution

  1. Подготовьте инъекционный гель.
    1. Подготовить 1 мл уреидо-пиримидинона (UPy) гель в соответствии с ранее описанными протоколами 12, 13.
    2. Добавить суперпарамагнитных частицы оксида железа (SPIOs) к раствору, чтобы получить концентрацию 15 мкг / мл и перемешивали смесь в течение 5 мин для равномерного распределения.
    3. Добавьте флуоресцентные микрошарик к раствору, чтобы получить концентрацию 10000 бусин / мл и перемешивали смесь в течение 5 мин для равномерного распределения.
    4. Хранить полученную смесь при комнатной температуре в темном помещении. Теплый и вихревым или размешать тон раствор незадолго до процедуры инъекции.
  2. Приготовьте раствор вложенности.
    1. Начну с водопроводной водой при комнатной температуре и добавляют агарозов (агар) до концентрации 4% масс.
    2. Медленно нагревать раствор до температуры кипения с использованием микроволновой печи и часто перемешивают во время нагревания. При достижении точки кипения, хранить и держать агар раствора выше 70 ° С в течение 2 ч, чтобы захваченный воздух к поверхности.
    3. Разрешить агар не остыть при комнатной температуре до температуры в диапазоне от 50 до 60 & deg; С до времени внедрения.

Процедура 2. Инъекции

  1. Выполните премедикацию (антиаритмические агент, анти-тромбоциты терапию и обезболивающую), анестезию, венозный доступ и интубацию, как описано выше 14.
  2. Выполнение инъекции с использованием катетера интрамиокардиальной инъекции (таблица материалов). Для каждой инъекции, 0.2 мл смеси вводят в один болюс с постоянной скоростью приблизительно 0,3 мл / мин с использованием устройства для инъекций. Поместите инъекции в различных положениях вдоль IBZ 12.
  3. Администрирование 0,2 мл / кг (1,0 ммоль / мл) в гадолиний-контрастный агент на основе 15 мин до эвтаназии животных.
  4. Администрирование 20 мл 7,5% хлорида калия внутривенно эвтаназии животных.
  5. Безопасный медиастинальная доступ в соответствии с протоколом шаги 8.2 - 8.3, как описано Koudstaal и соавт. 14. Обрежьте нижнюю полую вену 5 см от правого предсердия и удалить вытекания крови с всасывающим устройством. Акцизный сердце и промыть его с 0,9% физиологическим раствором при комнатной температуре.

3. Порядок Встраивание

  1. Подготовьте сердце.
    1. Удалить перикард из сердца, сохраняя предсердия и желудочки нетронутыми. Рассеките восходящую аорту ± 1 см выше аортального клапана с использованием Клинкенберганожницы. Обрежьте нижнюю полую вену ± 1 см от предсердия, и сделать то же самое для легочных вен.
    2. Шовная верхушку сердца к нижней части пластикового контейнера встраивания (17 х 15 х 15 см, Ш х Г х В ) с помощью 2-0 шва , чтобы предотвратить плавучесть сердца во время погружения (Рисунок 1А).
    3. Шовный оставшуюся часть аорты на краях контейнера с использованием 2-0, убедившись , что сердце центрируется и не касаясь стенок контейнера (Фиг.1В).

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схема и фотография Встраивание контейнера. (А) Схематический обзор процесса погружения. Сердце (красный) закреплено в контейнере (синий) с помощью наложения швов. После заполнения сердца раствора агара, пространство вокруг сердца заполнено. В заключение,две жесткие пластиковые трубы (желтые) расположены в контейнере, рядом, но не касаясь сердца, чтобы служить в качестве эталона при регистрации изображений. (В) Фотографии сердца , обеспеченном в контейнере вложения. Швы прижимаются к ободу емкости с использованием противомоскитных зажимов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Встраивание сердца в конечной диастолическом типе геометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предотвращение создания пузырьков воздуха необходимо. Если большие воздушные пузырьки присутствуют в растворе агара, держать агар при 40 ° С, что позволяет пузырьки воздуха к поверхности.
    1. Зажмите нижней полой вены с помощью москитных зажимов. Медленно вводит жидкий агар с помощью шприца 50 мл в правом предсердии через верхнюю полую вену, пока оба правое предсердие и желудочек не полностью заполнены.
    2. Хомут легочных вен с использованием Москитуплотнительные зажимы. Осторожно пройти агар заполненных 50-мл шприцев ретроградны через аортальные клапаны. Медленно вводит раствор в левом желудочке (ЛЖ) до левого желудочка и левого предсердия было полностью заполнены. После заполнения LV, зажим аорту, чтобы держать агар в ЛЖ.
    3. Влить оставшийся агар в контейнер, пока сердце не будет полностью покрыто. Поместите два жестких пластиковые трубы внутри контейнера вложения , чтобы служить в качестве опорных структур для последующей регистрации изображений (рис 1А). Убедитесь, что трубки не касаться стенок контейнера или сердца.
    4. Пусть агар затвердевать при 2 - 7 ° C.

4. Получение изображения

  1. Выполнение поперечной бывшей естественных условий МРТ сердца, внедренная в контейнере.
    1. Поместите контейнер со встроенным сердцем внутри головки катушки (таблица материалов).
    2. Угловыми ломтики параллельно нижней части контейнера. использованиета же ориентация и углы в каждой экс виво последовательности МРТ.
    3. Для визуализации миокарда, выполнить жидкости ослабленной обратной восстановления (FLAIR) последовательности со следующими параметрами: повторение раз [TR] / эхо времени [TE] = 10 с / 140 мс, флип угол = 90 °, размер пиксела = 0,5 х 0,5 мм, поле обзора FOV [] = 169 х 169 мм, 320 х 320 матрицы, а также 3-мм толщина среза.
    4. Для того, чтобы визуализировать инфаркт миокарда, выполнить позднюю-гадолиний расширенной (LGE), последовательность со следующими параметрами: [TR] / [ТЕ] = 5,53 мс / 1,69 мс, флип угол = 25 °, размер пиксела = 1,0 х 1,0 мм, [ FOV] = 169 х 169 мм, 176 176 матрицы, а также 3-мм толщина среза.
    5. Для того, чтобы визуализировать SPIOs, выполнить Т2 * -weighted градиент эхо последовательности со следующими параметрами: [TR] / [ТЕ] = 88,7 мс / 15 одинаково распределенных СПЭ с диапазоном 1,9 - 24,6 мс, флип угол = 15 °, пиксель размер = 0,5 х 0,5 мм, [FOV] = 169 х 169 мм, 320 х 320 матрицы, а также 3-мм толщина среза.
  2. Тканевые процеспеть
    1. Переверните контейнер вверх дном и позволить воздуху между агара и стенками контейнера для удаления твердого раствора агара, в том числе сердца, из контейнера. Удалите пластиковые стержни из твердого агара.
    2. Раздел агар блок, содержащий сердце в 5-мм кусочки от вершины к основанию сердца с помощью резки мяса. Хранить ангуляцию из разрезанных ломтиков такие же, как в полученных изображениях МРА путем разрезания параллельно нижнюю частью агара блока.
    3. Пятно агар ломтиков ( в том числе сердца) в течение 15 мин в 1% масс 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) , растворенного в 0,9% солевом растворе при 37 ° C, и сфотографировать ломтики с обеих сторон от перпендикулярного зрения (рис 2А). Затем, тщательно промыть ломтики в 0,9% солевом растворе.
      Примечание: В данном исследовании мы использовали установку цифровой зеркальной камеры с соответствующей линзы / объектива, штатив, и равномерное освещение. Тем не менее, фотографии служили только в качестве контроля для оценки области рубца,таким образом, мы могли бы использовать различные настройки.
  3. флуоресцентные изображения
    Примечание: В зависимости от возбуждения и излучения длин волн флуоресцентных микрогранул, выберите соответствующий блок фильтра и возбуждения лазеров (например, красные микросферы , используемые здесь , имеют возбуждения и эмиссии длинами волн 580 нм и 605 нм, соответственно, поэтому выбранный лазер возбуждения и полосовые фильтры были установлены на 532 нм, 580/30 нм и 610/30 нм, соответственно).
    1. Выберите флуоресцентной режим формирования изображения на сканере с переменным режимом. Установите фотоэлектронный умножитель до 430 В или эквивалентном и размер пикселя до 100 х 100 мкм. Выбор лазерного возбуждения (532 нм), ближе всего к длине волны возбуждения флуоресцентных микрогранул.
    2. Для первого блока фильтров, выберите полосовой фильтр (580/30 нм), который перекрывается с длиной волны излучения инжектированных бусин флуоресценции (канал 1). Выберите полосовой фильтр для блока второго фильтра (610/30) вне еДлина волны миссии (канал 2).
      Примечание: Второй блок фильтра служит в качестве отрицательного контроля и удаление автофлуоресценции при сохранении инъекции сайтов нетронутыми.
    3. Сканирование обоего сторон агаровых срезов в режиме флуоресценции лазерного сканера с переменным режимом с использованием двух каналов. Убедитесь, что каждый кусочек полностью сканируется, в том числе опорных отверстий.

5. Последующая обработка

Примечание: первый шаг в изображении после обработки является ручной сегментацией миокарда с использованием собственной разработкой сценариев для отслеживания эндо- и эпикардиальные границ, а также в местах инъекций. Это же как для МРТ и флуоресцентного сканирования.

  1. Сегмент миокард в МРТ.
    1. Сегментация эндокарда и эпикарда Лв Бордерс на изображение последовательности FLAIR МРТ.
    2. Скопируйте сегментацию LV с шага 5.1.1 к набору данных LGE-МРТ и сегмента рубца на последовательности LGE МРТ,
    3. Скопируйте сегментацию миокарда, начиная с шага 5.1.1 Т2 * -weighted набора данных и сегментировать отложений Spio в миокарде ЛЖ.
  2. Процесс флуоресценции изображений и выполнения сегментирования.
    1. Загрузите файлы, полученные от сканера переменного режима и сделать отдельное изображение каждого поперечного сечение среза сердца.
    2. Флип ломтики, которые были отсканированы в основания к вершине ориентации и сортировки флуоресцентных изображений в стеке для обоих каналов, которые ориентированы от вершины к основанию.
    3. Сегментация эндокарда и эпикарда Лв Бордерс на изображениях флуоресценции.
    4. Сегмент рубец вручную на изображении флуоресцентного и использовать LGE-МРТ и фотографии, чтобы подтвердить рубцовую морфологию.
    5. Вычтите стек изображения канала 2 из стека изображения канала 1, чтобы исключить автоматическую флуоресценцию. сегмент вручную флуоресцентное микросферическое осаждение и использовать T2 * изображения для подтверждения.
  3. Создаватьанатомически-правильное 3D геометрии, выполнить жесткую регистрацию срезов в стеке изображения на основании опорных структур (отверстий, созданных жестких трубок). Рассчитать и хранить прикладной сдвиг и поворот каждого изображения.
  4. Применить сохраненные преобразования для изображения стеки и сегментирования. Линейно интерполировать сегментирование обоего сторон ломтиков, чтобы восстановить первоначальную толщину среза и создать 3D модель данных.

6. Анализ

  1. Провести измерения 2D и / или 3D расстояния между центрами в местах инъекций и IBZ для оценки точности впрыска. Измерьте расстояние вдоль границы эндокарда сегментации ЛЖ. На фигуре 2C и 2F, пример измерений 2D и 3D обозначается красной линией.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ткань Встраивание

С помощью процесса погружения, была создана конечно-диастолический типа геометрии. Агар успешно приклеен к ткани сердца, что позволяет ткань , чтобы быть нарезан на желаемой ангуляции с равными срезами толщиной (рис 2A и 2C).

СКАР и Injection-сайт Оценка

Для к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Всего-сердце 3D обработки ткани миокарда в соответствии с этим протоколом обеспечивает структурированный метод, который позволяет 3D-анализ миокарда, в IBZ и выполненные инъекций по отношению к сердечной анатомии. Объем наполнения сердца зависит от желаемого анализа. В данном исследовании для оценки точности впрыска, мы стремились заполнить сердце похожего на конечную диастолическую геометрию настолько близко, насколько это возможно. Для обеспечения этого, вершина LV крепится к нижней части контейнера, и LV заполнен ага...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Марлижн Янсен, Джойс Виссер и Martijn ван Nieuwburg за помощь при проведении экспериментов на животных. Мы очень признаем Martijn Froeling и Анк Вассинк за помощь с МРТ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% Солевой растворBraun
AgaroseRoche DiagnosticsНаучный многоцелевой агар
Биомолекулярный флуоресцентный сканер Typhoon 9410 GE Healthcare
Встраиваемый контейнерПластик, размеры 17 x 14,5 x 14 см
FluoSpheres Полистирольные микросферыInvitrogenF8834красный, 10 &; m
GadoliniumGadovist1,0 ммоль/мл
dS 32-канальная головка катушкаPhilipsИли аналогичная
MatlabMathworksДля обеспечения совместимости 2015a или новее
МясорезкаBerkel
Myostar инъекционный катетерBiosense Webster
Супер парамагнитные частицы оксида железаСинерем
Трифенил-тетразолия хлоридMerck
UPy-PEG10k
Vicryl 2-0Ethicon

Ссылки

  1. Nowbar, A. N., Howard, J. P., Ja Finegold,, Asaria, P., Francis, D. P. 2014 global geographic analysis of mortality from ischaemic heart disease by country, age and income: statistics from World Health Organisation and United Nations. Int J Cardiol. 174 (2), 293-298 (2014).
  2. Kannel, W. B., Belanger, A. J. Epidemiology of heart failure. Am Heart J. 121 (3), 951-957 (1991).
  3. Ibáñez, B., Heusch, G., Ovize, M., Van De Werf, F. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. J Am Coll Cardiol. 65 (14), 1454-1471 (2015).
  4. Bartunek, J., Vanderheyden, M., Hill, J., Terzic, A. Cells as biologics for cardiac repair in ischaemic heart failure. Heart. 96 (10), 792-800 (2010).
  5. Orlic, D., Kajstura, J., et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410 (6829), 701-705 (2001).
  6. Nguyen, P. K., Lan, F., Wang, Y., Wu, J. C. Imaging: Guiding the Clinical Translation of Cardiac Stem Cell Therapy. Circ Res. 109 (8), 962-979 (2011).
  7. Psaltis, P. J., Worthley, S. G. Endoventricular electromechanical mapping-the diagnostic and therapeutic utility of the NOGA XP Cardiac Navigation System. J Cardiovasc Transl Res. 2 (1), 48-62 (2009).
  8. Tomkowiak, M. T., Klein, A. J., et al. Targeted transendocardial therapeutic delivery guided by MRI-x-ray image fusion. Catheter Cardiovasc Interv. 78 (3), 468-478 (2011).
  9. Dauwe, D. F., Nuyens, D., et al. Three-dimensional rotational angiography fused with multimodal imaging modalities for targeted endomyocardial injections in the ischaemic heart. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 15 (8), 900-907 (2014).
  10. van Slochteren, F. J., van Es, R., et al. Multimodality infarct identification for optimal image-guided intramyocardial cell injections. Neth Heart J. 22 (11), 493-500 (2014).
  11. van Slochteren, F. J., van Es, R., et al. Three dimensional fusion of electromechanical mapping and magnetic resonance imaging for real-time navigation of intramyocardial cell injections in a porcine model of chronic myocardial infarction. Int J Cardiovasc Imaging. 32 (5), 833-843 (2016).
  12. Pape, aC. H., Bakker, M. H., et al. An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart. J Vis Exp. (100), (2015).
  13. Bastings, M. M. C., Koudstaal, S., et al. A fast pH-switchable and self-healing supramolecular hydrogel carrier for guided, local catheter injection in the infarcted myocardium. Adv Healthc Mater. 3 (1), 70-78 (2014).
  14. Koudstaal, S., Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs. J. Vis. Exp. (86), (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи