Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Идентификация внутриклеточных сигнальных событий, наведенных в жизнеспособные клетки при взаимодействии с соседними сотами Проходят апоптотической гибели клеток

8.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54980

⸱

27 декабря 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Section of Nephrology, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Section of Nephrology, Department of Medicine, Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania, 4Division of Rheumatology, Department of Medicine, Research Institute of the McGill University Health Centre, 5Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois at Chicago

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для определения внутриклеточных сигнальных событий, индуцированных в жизнеспособных клетках физическим взаимодействием с соседними мертвыми или умирающими клетками. Протокол фокусируется на сигнальных событиях, индуцированных рецептор-опосредованным распознаванием мертвых клеток, в отличие от их фагоцитарного поглощения или высвобождения растворимых медиаторов.

Аннотация

Клетки умирают путем апоптоза, также упоминается как регулируемом гибель клеток, приобретают несколько новых видов деятельности, которые позволяют им влиять на функцию смежных живых клеток. Жизнедеятельности, такие как выживание, пролиферации, роста и дифференцировки, являются одними из многих клеточных функций, модулированных апоптотических клеток. Способность распознавать и реагировать на апоптотических клеток, как представляется, является универсальным свойством всех клеток, независимо от происхождения или органа происхождения. Тем не менее, разнообразие и сложность ответа на апоптозе мандатов, которые большое внимание быть приняты в рассекает сигнальных событий и путей, ответственных за какой-либо конкретного результата. В частности, необходимо проводить различие между множеством механизмов, с помощью которых апоптотических клеток могут влиять на внутриклеточные сигнальные пути в пределах жизнеспособных иммунокомпетентных клеток, в том числе: признание рецептор-опосредованного апоптоза клетки, высвобождение растворимых медиаторов апоптоза клетки, и / или зацепление фагоcytic оборудование. Здесь мы приводим протокол для определения внутриклеточных событий сигнализации, которые индуцируются в жизнеспособных иммунокомпетентных клеток после их воздействия апоптотических клеток. Одним из основных преимуществ протокола заключается в том внимании, он платит рассечения механизма, с помощью которого апоптотических клеток модулировать сигнальных событий внутри отвечающих клеток. В то время как протокол является специфичным для условно увековеченную мыши почки проксимальной линии трубчатых элементов (BU.MPT клетки), он легко адаптируется к клеточных линий, которые не являются эпителиальные происхождения и / или полученный из материалов, отличных от почек органов. Использование мертвых клеток в качестве стимула вводит несколько уникальных факторов, которые могут препятствовать обнаружению внутриклеточных сигнальных событий. Эти проблемы, а также стратегии, чтобы максимально уменьшить или обойти их, обсуждаются в рамках протокола. Применение этого протокола должно помочь нашей расширяющейся знания широкого влияния, что мертвые или умирающие клетки оказывают на их живых соседей, как в здоровье и в diseaсе.

Введение

Апоптоз, или регулируемая гибель клеток 1, способствует существенным образом на содержание и развитие тканей. Рассматриваемый наиболее просто, допускает апоптозом возрасте, поврежденные или лишние клетки должны быть устранены без вреда для окружающих тканей 2,3. Вклад апоптоза в гомеостазе ткани, однако, значительно более динамичным и разнообразным. Клетки умирают путем апоптоза приобретают несколько новых видов деятельности, как секретируется и связанную с клетками, которые позволяют им влиять на функцию смежных живых клеток 4-10. Более ранние исследования были сосредоточены на способности апоптотических клеток для подавления воспаления 11-16, но апоптотических клеток также модулировать широкий спектр клеточных функций, включая такие жизнедеятельности как выживание 4,9,10, пролиферации, дифференцировки 4,9,10 17, миграция 18, и рост 19. Более того, эти эффекты не ограничиваются профессиональными фагоцитами, как макрофагс, но распространяется на практически всех типов и линий клеток, в том числе традиционно не-фагоцитирующих клеток, таких как эпителиальные и эндотелиальные клетки 7,9,10,18-21.

Конкретный ответ соседних живых клеток после воздействия апоптотических клеток зависит от множества факторов, которые имеют отношение к обоим жизнеспособных клеток и реагирующих самих апоптотических клеток. Например, несмотря на то воздействие апоптотических клеток ингибирует пролиферацию обоих мышиных макрофагов и почечных проксимальных канальцев эпителиальных клеток (PTECs), эти два типа клеток резко отличаются по их реакции на выживание в апоптотических клеток 4,6,9,10. Апоптотических клеток способствуют выживанию макрофагов, но индуцирует апоптоз в PTECs 4,6,9,10. Следует отметить, что реакция на апоптотических клеток может отличаться даже среди отвечающих клеток к той же линии, в зависимости от органа , Отвечающий клетки происхождения 10 (например, почек PTECs против молочных желез эпителиальныеклетки) или состояние активации 22 (например, нейтрофилы). И наоборот, апоптотических клеток может вызывать различные реакции в той же самой клетке в зависимости от характера Апоптические стимула 10,23 или стадию апоптоза 10,14.

Учитывая несходство и сложность ответа на апоптотических клеток, большое внимание должно быть принято в рассекает сигнальных событий и путей, ответственных за какой-либо конкретного результата. Во- первых, ответы , требующие непосредственного физического взаимодействия между жизнеспособными и апоптотических клеток следует отличать от тех , вызываемое растворимых медиаторов выпущенных или генерируемых апоптического ячейкой 3,6-10. Если требуется физическое взаимодействие, то дальнейшая дифференциация должна быть выполнена. Сигнальных событий может зависеть от распознавания рецептора-опосредованного апоптоза клетки, независимо от последующего охвате, или на фагоцитарную поглощение, независимо от специфического рецептора, который связывает клеток путем апоптоза 3-7,9,10,19. В последнем случае, ответ не является специфическим для апоптотических клеток, и могут быть вызваны любым фагоцитарной материала 4,6.

Важность этих различий может быть вновь оценены контрастные реакции макрофагов и PTECs почек. Для обоих типов клеток, воздействие апоптотических клеток изменяет активность киназы про выживание Akt. Модуляция зависит от физического взаимодействия, так как разделение реагирования и апоптотических клеток путем поликарбонатную мембрану 0,4 мкм ликвидирует реакцию 4,9,10,19. Тем не менее, реакция PTECs является рецептор-опосредованного и не зависит от фагоцитоза, в то время как реакция макрофагов управляется фагоцитоза 4,9,10,19. Этот вывод подтверждается тем фактом , что воздействие латексных шариков, нейтральный фагоцитарной стимул, не оказывает никакого влияния на активность Akt в PTECs, но имитирует эффект апоптотических клеток в макрофагах 4,9.

"> Несмотря на то, менее хорошо изучены, клетки гибнут некроз, или случайной гибели клеток 1, также модулировать функцию рядом жизнеспособных клеток 3-10,19. Как и апоптотических клеток, некротические клетки проявляют свое действие с помощью различных механизмов, в частности, утечки внутриклеточного содержимого через их разрыва клеточной мембраны 3,5,6,9,24. Многие клетки, в том числе PTECs и макрофагами, обладают различными неконкурентных рецепторы клетки умирают некрозом 5,9. Взаимодействие этих рецепторов вызывает сигнальные события, часто противоположные тем , индуцированный зацепление рецепторов для апоптотических клеток 4-10,19. Например, в PTECs, некротические клетки увеличивают фосфорилирование Akt, в то время как апоптотических клеток уменьшают фосфорилирование 9,10,19.

Здесь мы опишем протокол для идентификации внутриклеточных сигнальных событий, индуцированные в жизнеспособных PTECs почек через признание опосредованного рецепторами соседних апоптотических PTECs 9,10,19. В то время как протокол является специфичным для условно иммортализованной клеточной линии PTEC известный как клетки BU.MPT 9,10,19,25,26, он легко адаптируется к клеточных линий , которые не являются эпителиальные происхождения и / или полученный из материалов, отличных органов почки. Важно отметить, что использование апоптотических клеток в качестве клеточного стимула создает определенные трудности, присущие экспериментальные нет с растворимыми лигандами. Наиболее важным из них является то, что апоптотических клеток должны быть добавлены в виде суспензии, а не в качестве решения. Эти трудности, а также стратегии, чтобы максимально уменьшить или обойти их, обсуждаются в рамках протокола. Почти все из методов, описанных в протоколе просты и стандарт клеточной культуре. Преимущество этого протокола заключается в его внимании к нескольким механизмам, с помощью которых апоптотических клеток модулировать трансдукцию сигнала в пределах отвечающих клеток. Эти механизмы включают связывание через поверхностные детерминанты или преодоление молекул со специфическими рецепторами на реветствующий клеток, высвобождение растворимых медиаторов, и / или привлечение фагоцитарной машин. Отмершие клетки включены во всех экспериментах, чтобы гарантировать, что результаты являются специфическими для режима гибели клеток, а не обобщенный ответ на мертвых клеток. Тщательный подход, в соответствии с рекомендациями в этом протоколе, имеет решающее значение для нашего понимания постоянно расширяющемся влиянии, которое умирающие клетки оказывают на их живых соседей, как в здоровье и болезни.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

Примечание: В этом протоколе двух или более клеточных линий или первичных клеточных культур, независимо друг от друга получают в конкретных условиях. Эти препараты включают апоптозе (Протокол 1), некротических клеток (Протокол 2) и здоровых иммунокомпетентных клеток (протокол 3). После самостоятельной подготовки, в апоптозе или некротические клетки добавляются к иммунокомпетентных клеток и полученную в результате трансдукции сигнала отслеживается (Протоколы 4, 5 и 6).

  1. Подготовка питательных сред и реактивов
    1. Приготовьте 500 мл культуральной среды А (для использования при выращивании клеток в разрешающих условиях, см раздел 1.2) путем объединения следующих: 1x Дульбекко Модифицированный орла Средний (DMEM), содержащей 4,5 г / л глюкозы, 584 мг / л ʟ-глутамина, 110 мг / л пирувата натрия, 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина, 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и 10 единиц / мл интерферона-гамма (IFN-gamma).
    2. Приготовьте 500 мл культуральной среды B (для использования КНан сыворотки голодающих клеток при непермиссивной условиях, смотрите раздел 1.2), исключив FBS и IFN-gamma из рецепта культуральной среды А. Для того, чтобы вырастить клетки под непермиссивной условиях (до сывороточного голодания), добавьте 10% об / V FBS в культуральной среде B.
    3. Готовят 0,4% (об / об) параформальдегида, рН 7,2, в фосфатном буферном растворе 1x Дульбекко (DPBS) с 4% акций параформальдегидом для фиксации мертвых клеток.
      Примечание: параформальдегид является токсичным, а также соответствующие следует проявлять осторожность при его использовании.
  2. Культура BU.MPT клетки
    1. Оттепель из жидкого азота один флакон клеток BU.MPT.
      Примечание: BU.MPT представляет собой проксимальный линия трубчатой ​​эпителиальные клетки мыши почки (PTEC), полученный из трансгенной мыши, несущей чувствительный к температуре (Ts) мутации (tsA58) крупного опухолевого антигена SV40 (Тэг) под контролем мыши основной комплекс гистосовместимости (MHC) H-2K б класс I промоутер 25,26.
    2. Пластина клеток на стерильном polystyrена вакуум-газ с плазменной обработкой культуры тканей блюда (~ 5 × 10 6 клеток на чашку диаметром 100 мм).
    3. Рост клеток в разрешающих условиях в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2.
      Примечание: разрешающих условиях, которые определены в качестве культуры при 33 - 37 ° С в присутствии IFN-gamma, допускают устойчивое выражение tsA58-мутантным Тэг трансгена. В отличие от первичных культур мыши почек PTEC, которые не выживают более чем за один проход или два, BU.MPT культивируют в разрешающих услови х, могут быть пассировать до бесконечности.
      1. Прохождение клетки по крайней мере три раза после оттаивания, прежде чем использовать их в эксперименте.
        1. Пропусканием клеток, прибавляют 1 мл 0,05% трипсина на 100 мм чашку, и инкубировать в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 при 37 ° С в течение 5 мин. Нейтрализовать трипсина путем добавления 10 мл среды A. аспирата обособленные клетки, и разделить 1: 3 до 1: 5 в новые 100 мм стерильную полистирол вакуум-газ с плазменной обработкой TISSУЭ блюда культуры. Добавьте носитель, чтобы довести объем до в общей сложности 10 мл на 100 мм блюдо.
    4. При подготовке к экспериментального использования в качестве отвечающих клеток, роста клеток до слияния в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 под непермиссивные условиях (т.е. при 39 ° С в отсутствие IFN-gamma [среда В , содержащей 10% об / об ФБС]).
      Примечание: В непермиссивные условиях, экспрессия tsA58-мутантным Тэг трансгена подавляется> 95%, а BU.MPT клетки ведут себя как первичные культуры мыши почек PTEC.

2. Приготовление апоптотических BU.MPT клеток (Протокол 1)

Примечание: Этот протокол является специфическим для клеток BU.MPT в качестве источника апоптотических клеток, и стауроспорином как метод индукции апоптоза. В качестве альтернативы, другой клеточной линией, или первичной культуры клеток, может быть использован в качестве источника апоптотических клеток, с апоптозу, вызванному стандартизированной ProtocoLs для этого конкретного типа клеток и способ индукции апоптоза.

  1. После прохода на диаметром 100 мм , стерильный полистирол плазмы вакуумной газ обработанные чашки с культурой ткани, растут BU.MPT клетки до слияния в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 в разрешающих условиях (т.е. при температуре 37 ° С в культуральной среде А в 10 мл на 100 мм блюдо), как описано в разделе 1.2.3.
  2. Полоскание приверженец клеточный монослой трижды культуральной средой B, используя 10 мл на полоскание.
  3. Индуцируют апоптоз путем инкубации клеток в культуральной среде В , содержащей стауроспорин, неселективный ингибитор протеинкиназы, при 1 мкг / мл в течение 3 ч в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 при 37 ° С .
  4. Аспирируйте стауроспорином содержащих среду, содержащую "плавающим" апоптотических клеток, которые оторваны от монослоя. Центрифуга эту среду в течение 10 мин при 500g, отбросить супернатант, промойте Таблетку три раза культуральной средой B, идобавить осадок обратно в клетки, собранные на следующей стадии, 2.5.
  5. Отделить оставшиеся прилипшие клетки из шагов 2.3 и 2.4 добавлением 5 мМ (этилендиаминтетрауксусной кислоты) ЭДТА в 1X Ca 2 + - и Mg 2+ -бесплатно DPBS в количестве 1 мл на чашку в течение 5 минут. Аспирируйте ЭДТА содержащих среду, содержащую отдельные апоптотических клеток, а также объединить отдельные клетки с «плавающих» апоптотических клеток из стадии 2.4 в стерильной 15 мл центрифужные пробирки полистирола.
  6. Промыть апоптотических клеток в три раза путем центрифугирования в течение 10 мин при 500g и ресуспендирования в 10 мл 1x Ca + 2 - и Mg + 2 -свободных DPBS на промывку.
  7. После последней промывки, приостановить апоптотических клеток в свежей культуральной среде В на ~ 5 × 10 6 клеток на мл перед использованием , чтобы стимулировать иммунокомпетентные клетки. В качестве альтернативы, зафиксировать промытые апоптотических клеток в 0,4% (об / об) параформальдегида в 1X ДЗФР в течение 30 мин, а затем промывают три раза с культуройсреда Б, перед суспендированием в культуральной среде B.
  8. В зависимости от обстоятельств, подтверждают индукции апоптоза с помощью проточной цитометрии с использованием отдельного препарата апоптотических клеток (или путем резервирования несколько ячеек для этой цели), как описано ранее 6,9,10,15.
    Примечание: Ранние апоптотических клетки имеют неповрежденные клеточные мембраны, и появляются в виде пропидийиодидом (PI) -отрицательные и аннексина V-положительные клетки уменьшение размеров клеток (относительно жизнеспособных клеток). Поздний апоптотических клетки имеют поврежденную клеточные мембраны, и появляются как PI-положительные и аннексина V-положительные клетки уменьшение размеров клеток. Использование текущего протокола, типичные препараты содержат ~~~HEAD=iobj 85% ранний апоптотических и ~ 15% поздних апоптотических клеток.
  9. Добавить апоптотических клеток в BU.MPT иммунокомпетентных клеток (протокол 3) при апоптозе-к-ответчиком соотношении клеток 1: 1, либо непосредственно, либо после фиксации апоптотических клеток в течение 30 мин с 0,4% (об / об) параформальдегида в 1X ДЗФР ,
    Примечание: фиксация клеток перед апоптотических стимуляции ответчиков должныне влияют на результаты, если Наблюдаемое сигнальных событий не обусловлены высвобождением растворимого медиатора (таблица 1).

3. Получение некротический BU.MPT клеток (Протокол 2)

Примечание: Этот протокол является специфическим для клеток BU.MPT в качестве источника некротических клеток и нагрева, как метод индукции некроза. В качестве альтернативы, другой клеточной линией, или первичной культуры клеток, может быть использован в качестве источника некротических клеток, с некрозом, индуцированной стандартизированными протоколами для этого конкретного типа клеток и методом индукции некроза.

  1. После прохода на диаметром 100 мм , стерильный полистирол плазмы вакуумной газ обработанные чашки с культурой ткани, растут BU.MPT клетки до слияния в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 в разрешающих условиях (т.е. при температуре 37 ° С в культуральной среде А в 10 мл на чашку), как описано в разделе 1.2.3.
  2. Полоскание приверженец клеточный монослой трижды культуральной средой B, используя10 мл на прополоскать.
  3. Открепления клеток путем добавления 5 мМ ЭДТА в 1X Ca + 2 - и Mg + 2 -свободных DPBS в количестве 1 мл на чашку в течение 5 минут. Аспирируйте ЭДТА содержащих среду, содержащую отдельные клетки, и добавить клеточной суспензии в стерильный 15 мл центрифужные пробирки полистирола.
  4. Промыть клетки три раза центрифугированием в течение 10 мин при 500g и ресуспендирования в 10 мл Ca + 2 - и Mg + 2 -свободных DPBS на промывку.
  5. После последней промывки, суспендирования клеток в свежей культуральной среде В на ~ 5 × 10 6 клеток на мл.
  6. Индуцируют некроз нагреванием клеток до 70 ° С в течение 45 мин на водяной бане, осторожно встряхивая клеточной суспензии через каждые 10 мин.
  7. Инкубируйте клетки в течение 2 ч в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 при 37 ° С. Аккуратно вихрь клеточной суспензии через каждые 15 мин.
  8. В зависимости от обстоятельств, подтверждают индукцию некроза с помощью проточной цитометрии с использованием отдельного препарата пеcrotic клетки (или путем резервирования несколько ячеек для этой цели), как описано ранее , 6,9,10,15.
    Примечание: некротические клетки разрушают клеточные мембраны, и появляются как PI-положительных клеток увеличенного размера клеток (относительно жизнеспособных клеток). Использование текущего протокола, типичные препараты содержат ≥ 95% некротических клеток. В качестве альтернативы, индукция некроза и потере целостности мембраны может быть подтверждена с помощью окрашивания трипановым синим.

4. Получение BU.MPT иммунокомпетентных клеток (протокол 3)

Примечание: Этот протокол является специфическим для клеток BU.MPT в качестве источника иммунокомпетентных клеток. В качестве альтернативы, другой клеточной линией, или первичной культуры клеток, могут быть использованы в качестве иммунокомпетентных клеток. До начала экспериментального использования успокоенность может быть вызван в течение ночи с помощью стандартных протоколов в лаборатории.

  1. Рост клеток BU.MPT в стерильной 100 мм чашки для культивирования тканей в разрешающих условиях в культуральной среде А в 10 мл на чашку, пока они не достигнут ~85% Стечение.
  2. Отберите культуральной среды A, и Прополощите клетки трижды культуральной средой B со скоростью 10 мл в полоскании. Сыворотка истощени клеток в течение ночи в течение 18 до 24 ч в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 под непермиссивные условиях (т.е. при 39 ° С в культуральной среде B со скоростью 10 мл на чашку), как описано в разделе 1.2 .4, для того, чтобы вызвать состояние покоя. В качестве альтернативы, роста клеток в культуральной среде B плюс 10% (об / об) FBS при 39 ° С в течение одного дня, прежде чем в сыворотке крови голодающих клеток в течение ночи в культуральной среде B без FBS.
  3. Добавьте описание отдельной тканевой культуры блюдо из сливающихся BU.MPT клеток для каждого экспериментального состояния.
  4. Включите следующие шесть условий: стимулирование жизнеспособных BU.MPT реагирующих с коэффициентом либо носителем или эпидермального роста (EGF) в течение 15 мин после их выдержки в течение 30 мин с использованием либо без каких-либо клеток, апоптотических клеток или некротических клеток.
    Примечание: Воздействие мертвые клетки могут либо стимулировать или подавлять уровень активности ГИвэн сигнализации молекулу. Стимуляция лучше всего обнаруживается выше низкого исходного уровня (например, отсутствие EGF), в то время как ингибирование лучше всего обнаруживается с высоким исходным уровнем (например, наличие EGF). Так как эффект стимуляции с мертвыми клетками априори неизвестна, рекомендуется проводить все исследования как в отсутствие , так и при наличии EGF.

5. Стимулирование иммунокомпетентных клеток с апоптотических и некротических клеток (Протокол 4)

  1. Отберите культуральной среды B из предварительно меченных блюд в состоянии покоя (сывороточный голодали) BU.MPT иммунокомпетентных клеток (протокол 3).
    Примечание: После ночной культуры при непермиссивной условиях, BU.MPT клетки должны вести себя как первичные культуры почек мыши PTEC.
  2. За 100 мм чашку, добавляют 2 мл одного из следующих действий: В культуральной среды (без клеток); апоптическая суспензии клеток в ~ 5 × 10 6 клеток на мл в культуральной среде B (Протокол 1); или некротической клеточной суспензии при ~ 5 × 10 6 клеток на мл Iп культуральной среды B (Протокол 2).
    1. Распределить 2 мл суспензии мертвых клеток равномерно по 100 мм блюдо, и сохранить время для них, чтобы обосноваться к минимуму. Для достижения этой цели, распределить тайника клеточной суспензии по капле с широким наконечником пипетки по всей поверхности Ответчик клеточных блюд. Использование объема 2 мл в качестве компромисса между минимизации времени отстаивания и избежать образования комков мертвых клеток.
      Примечание: использование суспензии мертвых клеток в качестве стимула влечет за собой ряд специальных соображений, которые описаны ниже более подробно (таблица 2 и обсуждение).
    2. Достижения отношения мертвых-к-ответчику клеток ~ 1: 1 путем добавления 2 мл мертвых клеток при ~ 5 × 10 6 клеток на мл в мм чашку сливающийся 100, который содержит ~ 10 х 10 6 клеток. С другой стороны, для того, чтобы установить зависимость от дозы каких-либо наблюдаемых сигнальных событий, варьировать соотношение умерших к иммунокомпетентных клеток непрерывно прогрессирующим разведением в культеЮр среда В мертвых клеточных суспензий, приготовленных в Протоколами 1 и 2.
  3. Аккуратно водоворот посуду, а затем инкубировать при температуре 37 ° С в увлажненной 5% (об / об) CO 2 атмосферы.
  4. Через 30 мин, стимулируют иммунокомпетентные клетки получены либо носителем или 50 нМ EGF, в соответствии с предварительной маркировки чашки для культивирования.
  5. Инкубировать в течение 15 мин при 37 ° С в увлажненной 5% (об / об) CO 2 атмосферы.
  6. Смывают мертвые клетки путем добавления 5 мл охлажденного льдом 1x ДЗФР, закрученной блюдо, и аспирационного моющей жидкости. Повторите три раза.
  7. Сразу же место посуду Ответчик клетки на льду для дальнейшей обработки.
  8. Приготовьте лизаты клеток
    1. Подготовка буфера для лизиса клеток, содержащий следующее: 1 × Трис-солевой буферный раствор (TBS), 10 мМ пирофосфата натрия, 0,5% вес / об дезоксихолата, 0,1% вес / об SDS, 10% глицерина и 25 мМ фторида натрия.
      1. Непосредственно перед лизису клетки, добавить следующее в точном порядке, указанном в IndКонцентрации льные: мини-ЭДТА свободной коктейль ингибиторов протеаз (1 таблетка на 10 мл буфера для лизиса), 10% (об / об) Тритона X-100, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ), 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), и 10 мМ ортованадат натрия.
    2. Добавьте 700 мкл охлажденного льдом буфера для лизиса клеток на 100 мм чашку свежеприготовленного стимулированных иммунокомпетентных клеток на льду с шага 5.7. Наскребать клетки с клеточным скребком и передавать лизат предварительно охлажденный 1,5 мл микропробирки. Поддерживать трубки на льду в течение 15 мин.
    3. Соникатные лизатов на льду с 10 импульсов 20 Гц, менее чем за одну секунду каждый по продолжительности. Избегайте создания пены на границе раздела газ / жидкость, так как это может привести к перегреву образцы. Полностью погрузить ультразвуковом зонд в микропробирки, содержащие лизаты перед переключением на ультразвукового и включите ультразвукового перед извлечением зонда из лизатов.
    4. Центрифуга при 20000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С, передавать супернатанты на свежий предварительно охлажденный микропробирок, И хранить при температуре -70 ° С.
    5. Выполнение гель - электрофореза и иммуноблоттинга на супернатантах лизатов, как было описано ранее 6,9,10,15.

6. Предотвращение прямого физического контакта между целями и ответчики Использование полупроницаемую поликарбонатную мембрану (Протокол 5)

  1. Приготовьте иммунокомпетентных клеток BU.MPT в соответствии с Протоколом 3, за одним исключением; роста клеток в стерильной культуре ткани полистирола обрабатывают кластеры 12-а.
  2. В отдельных скважинах, поместите проницаемую систему поддержки, содержащую поликарбонатную мембрану 0,4 мкм, чтобы предотвратить физическое взаимодействие между мертвыми и иммунокомпетентных клеток. Включают контрольные лунки без мембраны в том же эксперименте.
  3. Отберите культуральной среды B из экспериментальных скважин BU.MPT иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови голодали.
  4. Следуйте Протокол 4 для стимуляции иммунокомпетентных клеток с апоптотических или некротических клеток, со следующими изменениями:
    1. На лунку 1Кластер 2-, добавьте 0,1 мл одного из следующих действий: В культуральной среды (без клеток); апоптическая суспензии клеток в ~ 5 × 10 6 клеток на мл в культуральной среде B (Протокол 1); или некротической клеточной суспензии при ~ 5 × 10 6 клеток на мл в культуральной среде B (Протокол 2).
      Примечание: В качестве сливающийся лунку 12-луночного кластер содержит ~ 0,5 × 10 6 клеток, добавление 0,1 мл мертвых клеток при ~ 5 × 10 6 клеток на мл приводит к тупиковой к ответчику соотношение клеток ~ 1: 1.
    2. Для скважин, содержащих систему проницаемой поддержки, добавить мертвые клетки в верхней части 0,4 мкм поликарбонатную мембрану в проницаемой системе поддержки, так что нет никакого прямого физического взаимодействия между мертвыми и иммунокомпетентных клеток.

7. Ингибирование фагоцитоза с Цитохалазин D (Протокол № 6)

  1. Приготовьте иммунокомпетентных клеток BU.MPT в соответствии с Протоколом 3.
  2. Подготовьте цитоскелета ингибитор цитохалазин D в dimethил сульфоксид (ДМСО) в дозе 4 мг / мл (1000 ×). Добавить в предварительно меченных блюда из иммунокомпетентных клеток BU.MPT либо 10 мкл носителя (ДМСО) или 10 мкл цитохалазином D для достижения конечной концентрации 4 мкг / мл в 10 мл культуральной среды B.
    Примечание: При такой концентрации цитохалазином D, фагоцитоз клетками BU.MPT и макрофагальной клеточной линии ингибируется ≥90% 9,10.
  3. Инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С в увлажненной 5% (об / об) CO 2 атмосферы.
  4. Следуйте Протокол 4 для стимуляции иммунокомпетентных клеток с апоптотических или некротических клеток.
  5. В зависимости от обстоятельств, подтверждают ингибирование фагоцитоза мертвых клеток с помощью проточной цитометрии с использованием отдельного препарата мертвых и иммунокомпетентных клеток (или ячеек , зарезервированных для этой цели), как описано выше 9,10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1, мы предлагаем схему , изображающую сроки и важные шаги , связанные с подготовкой апоптотических клеток (Протокол 1) и некротических клеток (Протокол 2) и стимуляцию иммунокомпетентных клеток с суспензиями апоптотических и некротических клеток (Протокол 4).

На рисунке 2, мы обеспечиваем репрезентативные результаты , показывающие эффект апоптотических клеток на фосфорилирование дву...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы предлагаем здесь протокол для определения характеристик внутриклеточных сигнальных событий, индуцированные в жизнеспособных клеток после их воздействия клеток, подвергающихся апоптозу, или другие формы клеточной гибели. Протокол подчеркивает несколько механизмов, с помощью которых воздействие апоптотических клеток могут модулировать внутриклеточные сигнальные пути в пределах жизнеспособных иммунокомпетентных клеток. Эти механизмы включают в себя: взаимодействие (через мостиковые молекулы или поверхностные детерминант...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана, полностью или частично, институциональными фондами от доктора Хосе А. Арруды и Секции нефрологии Университета Иллинойса в Чикаго (для J. S. L.); и финансированием от Департамента медицины Университета Макгилла и Научно-исследовательского института Центра здоровья Университета Макгилла (для J. R.)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Cell Crop materials
DMEM, 1x с [4,5 г/л] глюкозой, ʟ-глютамин и пируватнатрия Mediatech (Манассас, Вирджиния)10-013-CV
HyClone Fetal Clone II, фетальная бычья сывороткаGE Healthcare (Логан, Юта)SH30066.03добавить 10% (v/v)  в питательную среду
A Пенициллин-Стрептомицин-Глютамин, 100xLife Technologies (Grand Island, NY)10378-016добавить 100 единиц/мл в питательную среду A и B
γ-интерферон, мышиный рекомбинантный, из Escherichia coliCalbiochem, Millipore (Billerica, MA)407303добавить 10 единиц/мл в питательную среду
A Falcon посуды, обработанные полистироловой культурой тканей, непирогенныеCorning (Дарем, Северная Каролина)353003стерильные,
Полистирольные центрифужные пробирки Falcon диаметром 100 мм, коническое дноCorning (Дарем, Северная Каролина)352095стерильные, 15 мл
Trypsin-EDTA, 0,05%, GibcoFisher (Waltham, MA)25300062стерильные, 100 мл
NameCompanyCatalog>Комментарии
<сильно>Химические вещества и ингибиторы
Staurosporine, из Streptomyces sp.Sigma (Сент-Луис, Миссури)S4400использование при [1 μ г/мл] в течение 3 ч для индуцирования апоптоза
Эпидермальный фактор роста (EGF), [1 мг/мл]Millipore (Billerica, MA)EA140использовать при 50 нМ для стимуляции ответных клеток
UltraPure, 0,5 M EDTA, pH 8.0Life Technologies (Grand Island, NY)15575-038использовать 5 мМ для отделения адгезивных клеток
Trypan blue solution, 0,4%MP Biomedicals (Санта-Ана, Калифорния)91691049для окрашивания мертвых клеток
Параформальдегидный раствор, 4% в DPBSAffymetrix (Санта-Клара, Калифорния)19943использовать 0,4% (v/v) в 1x DPBS для фиксации
клеток фосфатно-солевой буфер Dulbecco (DPBS), 1x, GibcoLife Technologies (Grand Island, NY)14040133стоковый раствор
фосфатно-солевой буфер Dulbecco (DPBS), Ca2+- и Mg2+-free, 1x, GibcoLife Technologies (Grand Island, NY)14190367стоковый раствор
Cytochalasin D, 4 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО), из Zygosporium mansoniiSigma (Сент-Луис, Миссури)C8273использовать при [4 μ г/мл] для ингибирования фагоцитоза
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma (St. Louis, MO)D2650растворитель для цитохалазина D
[header]
Cell lysis buffer ingredients
Tris-buffered salt (TBS), 10x, pH 7.4BioRad (Hercules, CA)1706435для буфера для лизиса клеток
пирофосфатнатрияSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)22136810 мМ для буфера для лизиса клеток
Дезоксихолат натрияSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)D67500,5% w/v для буфера для лизиса клеток
Додецилсульфат натрия (SDS)Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)L3771 0,1% мас./об. для буфера для лизиса клеток
ГлицеринSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)G551610% для буфера для лизиса клеток
Фторид натрияSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)45002225 мМ для буфера для лизиса
клеток Complete mini без ЭДТА коктейль ингибиторов протеазыRoche Diagnostics (Индианаполис, Индиана)4693159001для буфера для лизиса клеток, 1 таблетка на 10 мл буфера
Triton X-100Sigma-Aldrich (Сент-Луис, MO)T878710% для буфера для лизиса клеток
Дитиотреитол (DTT)MP Biomedicals (Санта-Ана, Калифорния)11DTT000051 мМ для буфера для лизиса клеток
Фенилметансульфонилфторид (PMSF)MP Biomedicals (Санта-Ана, Калифорния)48002631 мМ для буфера для лизиса
клеток Ортовандат натрияMP Biomedicals (Санта-Ана, Калифорния)215966410 мМ для буфера
для лизиса клетокNameCompanyCatalog<strong>Комментарии
Equipment
Sorvall T6000B центрифугаDu Pont (Уилмингтон, Германия)T6000B
Салфетка Fisher, водяная баняFisher (Уолтем, Массачусетс)
Sonic Dismembrator (ультразвуковая система), модель 100Fisher (Waltham, MA)
Miscellaneous
Cell count chamber, NeubauerHawksley (Lancing, Sussex, UK)AC2000
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit IIMillipore (Billerica, MA)CBA059для окрашивания PI и Annexin V для определения стадии апоптоза
Микротрифугальные пробирки Eppendorf, 1,5 млSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)T9661
Transwell проницаемая подложка, 0,4 μ m поликарбонатная мембранаCorning (Corning, NY)3413стерильная, полистирол, культура тканей обработана
NameCompanyCatalogКомментарии
>Антитела
Фосфо-гликогенсинтаза киназа-3&альфа;/&бета; (GSK-3α/β) (Ser21/9), поликлональное антителоТехнология клеточной сигнализации9331кроличье поликлональное антитело
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) моноклональное антотело ( (14C10) )Технология клеточной сигнализации2118кролик моноклональное антитело

Ссылки

  1. Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
  2. Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
  3. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748(2013).
  4. Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
  5. Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
  6. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
  7. Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
  8. Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
  9. Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
  10. Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
  11. Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
  12. Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
  13. Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
  14. Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
  15. Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
  16. Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
  17. Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13(2010).
  18. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
  19. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
  20. Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
  21. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51(2009).
  22. Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
  23. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
  24. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
  25. Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
  26. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
  27. Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GSK3
Идентификация внутриклеточных сигнальных событий, наведенных в жизнеспособные клетки при взаимодействии с соседними сотами Проходят апоптотической гибели клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.