Экспериментальный и конечные элементы протокол по расследованию транспорта нейтральных и заряженных растворенных веществ через суставной хрящ

Краткое содержание

Мы предлагаем протокол исследовать перенос заряженных и незаряженных молекул через суставного хряща с помощью недавно разработанных экспериментальных и численных методов.

Аннотация

Остеоартроз (ОА) является изнурительным заболеванием, которое связанно с дегенерацией суставного хряща и субхондральной костью. Дегенерации суставного хряща ухудшает свою функцию несущей , по существу , как он испытывает огромную химическую деградацию, т.е. протеогликанов и коллаген потери разрушения фибрилл. Одним из перспективных способов, чтобы исследовать механизмы химического повреждения во время ОА, чтобы выставить образцы хряща к внешнему растворенного вещества и контролировать диффузию молекул. Степень повреждение хряща (т.е. концентрации и конфигурация основных макромолекул) связана с коллизионной потерей энергии внешних растворенных веществ при перемещении через суставной хрящ создает различные характеристики диффузии по сравнению со здоровым хрящом. В этом исследовании мы вводим протокол, который состоит из нескольких этапов и основан на ранее разработанной экспериментальной микро-C14px; "> omputed Т omography (микро-КТ) и моделирование конечных элементов Перенос заряженных и незаряженных йодированных молекул сначала записываются с использованием микро-КТ, которая сопровождается применением двухфазного-растворенное вещество и многофазные конечные модели элемента для получения коэффициентов диффузии. и фиксированной плотности заряда по хрящевых зон.

Введение

Молекулярный транспорт играет важную роль в гомеостазе Артикуляционных суставов, доставка терапевтических средств в суставном хрящ и контрастное усилением хрящ изображения ^{1, 2, 3.} Такие факторы, как интеграция хрящевой и интактность, растворенное вещество заряд и размер, а также осмоляльность и концентрация ванны в контакте с хрящом может повлиять на скорости транспортировки ^{4, 5, 6.} Перенос растворенных веществ, либо нейтральных или заряженного, может быть разным между суставными зонами хряща, так как каждая зона состоит из различных концентраций и ориентаций основных внеклеточных матричных молекул, а именно протеогликаны (PGS) и коллаген типа II , ^{1, 7, 8, 9,}деваха = "Xref"> ^{10, 11.} Что еще более важно, перенос заряженных растворенных веществ может быть в значительной степени зависят от концентрации протеогликанов , содержащих отрицательные заряды в пределах фиксированных внеклеточного матрикса , который увеличивает через суставной хрящ ^{8, 9.} Эти параметры особенно фиксированная плотность заряда (FCD), ориентация коллагеновых фибрилл и изменений содержания воды через хрящ может подвергаться изменениям, как остеоартрит (ОА) прогрессирует, тем самым показывая важность изучения диффузии через хрящ.

В текущем исследовании, протокол , основанный на ранее установленных экспериментальных и расчетных исследований ^{6, 8, 9} Предлагается точно исследовать диффузию при различных граничных условиях с использованием нейтральных и заряженных растворенные в конечномерном ванной модели диффузии. Tон предложил методы состоят из микро-компьютерная томография (микро-КТ) системы, включая хрящи и конечную баню при поддержке передовым двухфазным-растворенным веществом и многофазными моделями конечных элементов. Эти модели позволяют получить коэффициенты диффузии нейтральных и заряженных молекул, а также FCDs в различных зонах суставного хряща. Используя эти модели, можно получить лучшее представление о поведении диффундирующих нейтральных и заряженных молекул, которые могут быть использованы для изучения взаимодействия между хрящом и перекрывающей конечной ванной.

Протокол

Примечание: Протокол , представленный здесь , заимствован из экспериментальных и расчетных процедур последних научных статей ^{6, 8, 9.} Протокол показан на фиг.1.

В трупные материалы были собраны с разрешения ветеринарного факультета Утрехтского университета.

1. Образец и ванна Приготовление

1. Высверлить цилиндрические остеохондральных пробки (диаметр 8,5 мм) от трупных лошадиных бедренных мыщелков с использованием заказной сверло (рисунок 1) во время распыления прохладного фосфатна-солевого буфер (PBS) , чтобы предотвратить перегрев и последующее повреждение хряща.
2. Термоусадочный в остеохондральных пробки с пластиковой усадкой рукава, чтобы свести к минимуму бокового распространения покрывающей ванны.
   1. Установите костно пробку с хрящом в гое изначально сверху внутри пластиковый усадки рукава и последующая продувка горячего воздуха к нему. Добавить мокрые кусочки хлопка на поверхности хряща для предотвращения связанных с жарой повреждения.
3. Подготовка конечно-ванны из заряженных (например, 650 мкл, 420 мМ, иоксаглат, молекулярная масса (ММ) = 1 269 Да, заряд = -1) и нейтрального (650 мкл, 420 мМ, иодиксанола, ММ = 1550 Да) растворенных веществ по отдельности.
4. Загрузить подготовленную конечно-ванну на поверхность хряща с помощью шприца и поместите пробковую пробку на обернутом образце , чтобы предотвратить испарение в ходе экспериментов при комнатной температуре (рис 2А). Для изучения нейтрального растворенного вещества транспорта, поместите Йодиксанол ванну и изучить отрицательно заряженную растворенное вещество транспорта места иоксаглатой ванны на поверхность хряща.

2. Работа с изображениями и обработка изображений

1. Поместите обернутые образцы, выделенные с пробкой пробкой на заказ держателя прикреплен к моторизованной стадии микро-КТ. Место тон образец так, чтобы поверхность хряща, покрытый раствор контрастного агента, обращен вверх.
2. Сканирование с помощью микро-КТ (размер воксела 40 × 40 × 40 мкм ^3, время сканирования 2 мин, напряжение трубки 90 кВ и ток трубки 180 мкИ) в поле зрения , состоящее из хряща, субхондральной пластинки, а конечномер ванна в нескольких временных точках вплоть до равновесного состояния (48 ч) достигается (фиг.2А). Равновесное состояние достигается, когда значение концентрации не изменяется с течением времени.
3. Регистрация 3D - изображений в различные моменты времени на основе исходного изображения , чтобы облегчить позиционирование области интереса (ROI) с помощью программного обеспечения производителя (например, анализ).
4. Преобразование 3D-реконструкция микро-КТ изображения в 2D Tagged Image File Format (TIFF) стек перед их обработкой с использованием программного обеспечения производителя.
5. В мировом масштабе сегмент (ImageJ> Adjust> Порог) хрящ от субхондральной кости и надлежа ванну в программном обеспечении.
6. Получить среднее значение серого хряща в различные моменты времени (ImageJ> Анализ> Измерение) с использованием сгенерированной маски хряща на предыдущей стадии.
7. Учитывая начальную концентрацию ванны и начальную концентрацию контрастного агента в хряще, использует линейный калибровочный кривой, чтобы преобразовать средние значения серых к фактической концентрации растворенных веществ. Предыдущие данные подтверждают тот факт, что значения серых поддерживать линейную зависимость с концентрацией контрастных агентов.
8. Участок концентрации растворенных веществ в сравнении экспериментальных точек времени.

3. вычислительного моделирования

Примечание: Диффузия в этой задаче предполагается провести в 1D (вдоль оси), что соответствует экспериментальному граничному условию. Таким образом, геометрия может быть произвольно создана.

1. Построение моделей хрящ несколько зон на основе конечно-ванны: 1) хрящ, состоящие из поверхностного зоны (20% от общей толщины хряща), средняя зона (50% от общей толщины хряща) и глубокая зона (30% от общей толщины хряща) ¹² и 2) конечно-ванна в FEBio ^{13, 14} (фигура 2В).
2. Назначают механические и физические свойства различных зон хряща и ванны в FEBio. Предполагалось, модуль Юнга (10 МПа), чтобы быть достаточно высоким, чтобы противостоять осмотическое давление, оказываемое вышележащей ванну и, следовательно, защищает хрящ от чрезмерных деформаций.
   1. Используйте гидравлическую проницаемость 10 ^-3 мм ⁴ / N и коэффициент Пуассона 0. Использование коэффициента диффузии растворенного вещества фактической ванн при моделировании ^{8, 9.}
3. Генерация сетки (8-узла трилинейной шестигранные элементы) и уточнить его вблизи границ (фигура 2В)класс = "внешние ссылки"> ^{8, 9.}
4. Двухфазный-растворенное вещество модель
   1. Применить начальную концентрацию растворенного вещества в ванне и эффективного давления, соответствующего ему. Посмотрите на описание эффективного давления в ^{9, 15.}
   2. Запуск модели в переходном режиме, чтобы получить концентрацию растворенного вещества в зависимости от времени в соответствии с заданными коэффициентами диффузии в разных зонах хряща.
5. Multiphasic модель
   Примечание: электрическое колебание между ванной и тканью может быть обойдено путем добавления два одновалентных противоионов как к ванне и ткани.
   1. Для стационарных моделей: использовать те же самые эффективные давления жидкости и концентрацию в хряще и вышележащой ванне при одновременном повышении FCD до желаемой величины.
   2. Для переходных моделей: создать хорошо перемешиваемой конечную ванну, сохраняя коэффициент диффузии растворенного вещества в ванне достаточно высокой. впрыскиватьрастворенное вещество из интерфейса ванны воздуха в ванну, чтобы достичь желаемой величины концентрации.
   3. Переходный: удалить предписанную концентрацию растворенного вещества граничного условие в предыдущем шаге и вернуться коэффициентом диффузии конечной бани до его фактического коэффициента диффузии.
   4. Запустите модель, чтобы получить кривые концентрации растворенного вещества-время на основе применяемых FCDs и коэффициентах диффузии в различных зонах хряща.
6. Интерфейс FEBio-MATLAB
   1. Разработка кода MATLAB для автоматического выполнения моделирования в FEBio и участок кривых концентрация-время (интерфейс FEBio-MATLAB) ^{8, 9.}
   2. Изменение коэффициентов диффузии и FCDs в хрящевых зон с использованием интерфейса FEBio-MATLAB. Запуск модели в FEBio и извлечения растворенных веществ кривые концентрация-время ^{8, 9.}
   3. Сравните кривые концентрации времени получены растворенного вещества с экспериментальнымданных и получить наборы коэффициентов диффузии и FCDs в различных зонах хряща на основе минимальной среднеквадратичной ошибки (СКО) ^{8, 9.}

Рисунок 1: Экспериментальная установка. A) процедура экстракции образца с использованием заказных сверл. Б) Процедура Микро-КТ для контроля процесса диффузии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Схема.А) Экспериментальный дизайн. Б) многозонная вычислительная модель , состоящая из конечных ванн, поверхностных, средних и глубоких зон хряща и связанные с сеткой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Результаты

Представительные результаты , приведенные здесь, взяты из предыдущих научных работ ^{6, 8, 9, 16.}

В ОА, суставной хрящ претерпевает значительные изменения , что наиболее важно GAG потери и коллагена фибрилл повреждения ^{17, 18,}

Обсуждение

Мы представили экспериментальный протокол в сочетании с процедурой конечных элементов моделирования для изучения диффузии заряженных и нейтральных растворов через суставной хрящ. По нашим последним исследованиям, предлагаемые модели могут точно описать перенос как нейтрального (двухфазного-растворенного вещества) и отрицательно заряженные (многофазные) растворенные через различные зоны суставного хряща ^{8, 9.} Широко распространено мнение , что суставной хрящ стан...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Hexabrix	Guerbet	15HX005D	Отрицательно заряженное контрастное вещество
Visipaque	GE healthcare	12570511	Nuetral контрастное вещество
PBS (фосфатно-солевой буфер)	Life technologies	10010023	Medium
micro-CT	Perkin Elmer		Мониторинг диффузии
Осмометр с температурой замерзания	Advanced приборы		Измерение осмоляльности раствора