Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Drosophila Подготовка и Продольная Визуализация сердца Функция In Vivo Использование оптической когерентной микроскопии (ОКМ)

10.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55002

⸱

12 декабря 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioengineering Program, Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering, Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Здесь описаны экспериментальные протоколы для подготовки дрозофилы на разных стадиях развития и выполнения продольной оптической визуализации сердцебиения дрозофилы с использованием специальной системы оптической когерентной микроскопии (OCM). Морфологические и динамические изменения сердца могут быть количественно охарактеризованы путем анализа структурных и функциональных параметров сердца по изображениям ОКМ.

Аннотация

Лонгитюдное исследование сердцебиения у мелких животных способствует пониманию структурных и функциональных изменений во время развития сердца. Было продемонстрировано, что оптическая когерентная микроскопия (OCM) способна визуализировать сердца мелких животных с высоким пространственным разрешением и сверхвысокой скоростью визуализации. Высокая контрастность изображения и неинвазивные свойства делают OCM идеальным для проведения продольных исследований без необходимости рассечения тканей или окрашивания. Дрозофила широко использовалась в качестве модельного организма в исследованиях развития сердца из-за большого количества ортологичных генов заболеваний человека, сходства молекулярных механизмов и генетических путей с позвоночными, короткого жизненного цикла и низкой стоимости культивирования. Здесь описаны экспериментальные протоколы подготовки дрозофилы и оптической визуализации сердцебиения с помощью специальной системы OCM на протяжении всего жизненного цикла образца. Следуя шагам, приведенным в этом отчете, можно получить поперечные изображения M-режима и 3D OCM для проведения продольных исследований морфологии и функции сердца дрозофилы. Также было показано, что изображения на лице и аксиальном сечении OCM, а также гистограммы частоты сердечных сокращений (ЧСС) и периода сердечной деятельности (CAP) для анализа структурных изменений сердца и количественной оценки динамики сердца во время метаморфоза дрозофилы в сочетании с видео, построенными с помощью изображений М-режима, для интуитивного отслеживания сердечной деятельности. Из-за генетического сходства между дрозофилами и позвоночными, лонгитюдное изучение морфологии и динамики сердца у плодовых мушек может помочь выявить истоки сердечных заболеваний человека. Протокол здесь обеспечит эффективный метод для проведения широкого спектра исследований для понимания механизмов сердечных заболеваний у людей.

Введение

Продольная исследование сердца у мелких животных способствует пониманию различных сопутствующих сердечно - сосудистых заболеваний человека, таких как дефекты врожденных пороков сердца , связанных с генными 1,2. В последние десятилетия, различных животных моделях, таких как 3,4 мыши, Xenopus 5,6, 7,8, данио птичьего 9 и Drosophila 10-16, были использованы для проведения человеческого сердца-разработок в области научных исследований. Модель мыши широко используется для изучения нормальных и ненормальных развития сердца и сердечные фенотипы дефектов из - за его сходства с человеческим 3,4 сердца. Эмбрион Хепориз особенно полезен при изучении развития сердца из - за его легкой обработки и частичной прозрачности 5,6. Прозрачность эмбриона и ранней личинки данио модели позволяет легко оптического наблюдения сердца 7,8 развития. Птичий модель является общим предметом исследований в области развития сердца becausе сердце может быть легко доступны после удаления скорлупу и морфологическое сходство птиц сердца для людей 9. Модель дрозофилы имеет ряд уникальных особенностей , которые делают его идеальным для выполнения продольных исследований сердца. Во- первых, сердечная трубка дрозофилы составляет ~ 200 мкм ниже дорсальной поверхности, которая обеспечивает удобство для оптического доступа и наблюдения сердца. Кроме того, многие молекулярные механизмы и генетические пути сохраняются между дрозофилы и позвоночных. В ортологи более 75% генов болезней человека были обнаружены у дрозофилы, которые сделали его широко используются в трансгенных исследованиях 11,13. Кроме того, он имеет короткий жизненный цикл и низкие затраты на техническое обслуживание, а также был широко используется в качестве модели образца для исследования биологии развития 14-16.

В предыдущих докладах описаны протоколы для мониторинга дрозофилы сердечной функции , такие , как онartbeat. Тем не менее, процедуры рассечение были необходимы 17,18. Оптическая визуализация обеспечивает эффективный способ для визуализации развития сердца у животных из-за его неинвазивный характер. Различные методы оптических изображений были применены при выполнении сердца исследовании на животных, таких , как двухфотонной микроскопии 19, конфокальной микроскопии 20,21, световой микроскопии листа 22 и оптической когерентной томографии (ОКТ) 16,23-26. Для сравнения, ОКТ способна обеспечить большую глубину изображения в маленьких сердцах животных без использования контрастных веществ, сохраняя при этом высокое разрешение и сверхвысокой скорости обработки изображений, которые являются важными для получения изображений живых животных. Кроме того, низкая стоимость разработки системы ОКТ популяризовал эту технику для оптической визуализации образцов. Октябре был успешно использован для продольного изучения дрозофилы. Использование Октябре, сердечная морфологическое и функциональное отображение было проведено для изучения структуры сердца, функные роли генов, а также механизмы сердечно-сосудистых дефектов у мутантных моделей во время развития сердца. Например, зависимое от возраста снижение функции сердца была подтверждена с понижающей регуляции ангиотензин-превращающего фермента , связанных с (ACER) гена у дрозофилы с ОСТ 27. Фенотипирование кардиомиопатии связанных генов была продемонстрирована в дрозофилы с помощью ОКТ 28-33. Исследования с использованием Октябре также выявили функциональную роль гена Sox5 человека в сердце Drosophila 34. По сравнению с ОКТ, ОСМ использует объектив с более высокой числовой апертурой для обеспечения лучшего поперечное разрешение. В прошлом, дисфункция сердца , вызванное глушителей в ортолог человека циркадный ген dCry / dClock был изучен с помощью системы пользовательских OCM 15,16, а также эффект с высоким содержанием жиров-диеты на кардиомиопатии у дрозофилы , чтобы понять ожирения индуцированного человека заболевания сердца. 15

Здесь йэкспериментальный протокол электронной обобщается для продольного изучения сердечных морфологических и функциональных изменений в дрозофилы на второй возрастной стадии (L2), третьей возрастной стадии (L3), куколки день 1 (PD1), куколки день 2 (PD2), куколки 3 -й день (PD3) , куколки 4 -й день (PD4), куколки день 5 (PD5) и взрослых (рис 1) с использованием OCM для облегчения изучения врожденных сердечных заболеваний человека , связанных с . Сердечные функциональные параметры, такие как HR и CAP количественно анализировали на разных стадиях развития, чтобы выявить сердечные особенности развития.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка системы OCM для оптической визуализации Drosophila16

  1. Выберите спектрометр и высокоскоростную камеру линейного сканирования с частотой кадров не менее 80 frame/sec, чтобы система OCM могла разрешить сердцебиение Drosophila.
  2. Используйте широкополосный источник света для обеспечения осевого разрешения 2 µm, необходимого для идентификации структуры сердца Drosophila.
  3. Используйте объектив 10X для получения высокого поперечного разрешения.
  4. Используйте стержневое зеркало с углом 45°, чтобы отразить световой пучок опорного плеча и создать кольцевой световой пучок плеча образца для увеличения глубины фокусировки в исследуемых объектах.
  5. Разработайте специальную компьютерную программу для управления системой OCM и проведения измерений.

2. Культивирование Drosophila

  1.  Стандартное приготовление корма для мух
    1. С помощью бумажного желоба поместите ~ 5 ml мгновенной формулы для Drosophila в полистирольную пробирку.
    2. Налейте в формулу ~ 8 ml воды для надлежащего насыщения корма.
    3. Для различных экспериментов добавляйте в стандартный корм для мух разные добавки. При приготовлении корма с all-trans-ретиналем (ATR) для эксперимента по оптогенетическому стимулированию35 используйте пипетку, чтобы отобрать 100 mM ATR и растворить его в ~ 8 ml воды для получения концентрации ATR 1 mM в корме. После равномерного перемешивания раствора влейте его в формулу и тщательно перемешайте.
    4. Для приготовления корма с высоким содержанием жиров для изучения нарушений сердечной функции, связанных с ожирением у Drosophila,10,15 смешайте ~10 ml формулы с 15 ml воды в стакане и нагревайте в течение 30 sec в микроволновой печи. Налейте немного органического кокосового масла первого холодного отжима в другой стакан и нагревайте его в течение 90 sec в микроволновой печи.
    5. Отоберите 7.5 ml кокосового масла и достаточно тщательно смешайте с приготовленной формулой, чтобы массово-объемное соотношение кокосового масла к корму составило ~ 30/100, затем отоберите ~ 2 ml смешанного корма и поместите его на дно пробирки.
    6. Подождите 1 min до полного насыщения среды. Осторожно уплотните корм плоской поверхностью, чтобы оптимизировать условия содержания Drosophila. Добавьте 6 - 8 гранул дрожжей в приготовленную формулу и заткните пробирку пробкой из ваты.
  2. Скрещивание и культивирование плодовых мушек
    1. Возьмите пробирку с приготовленным стандартным кормом для мух и удалите ватную пробку. Осторожно перенесите взрослых мух (самцов и самок) в пробирку и немедленно заткните ее ватой. Проверьте ватную пробку, чтобы убедиться в отсутствии зазоров между ватой и стенкой пробирки, чтобы предотвратить побег мух.
    2. Для скрещивания держите плодовых мушек в инкубаторе при 25 °C. Большинство генов активны, а клеточные белки синтезируются при 25 °C36-39.
    3. Извлеките пробирку из инкубатора через 8 дней и перенесите взрослых мух из пробирки, чтобы получить яйца одного возраста для экспериментального контроля.
    4. Продолжайте культивировать яйца в инкубаторе при 25 °C, что является стандартной температурой развития Drosophila с периодом развития 8.5 дней40,41.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Температура влияет на период развития (от яйца до взрослой особи) и уровень экспрессии различных генов.

3. Проведение оптической визуализации с помощью OCM

  1. Фиксация личинки мухи для оптической визуализации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Яйцо Drosophila вылупляется через 22–24 ч при 25 °C, превращаясь в личинку первого возраста (L1). Личинка второго возраста появляется спустя еще 24 ч. Самой крупной формой является личинка третьего возраста, которая линяет примерно через 24 ч. Структурные характеристики личинки позволяют различать стадии ее развития. Размер ротовых органов у личинок первого и второго возраста различается. Ротовые крючья личинки первого возраста очень малы и выглядят как две пары крошечных черных точек, тогда как ротовые крючья личинки второго возраста крупнее, а их структура выражена четче. Для идентификации второго и третьего возрастов обычно используют дыхальца. У личинки второго возраста передние дыхальца имеют булавовидную форму, тогда как у личинки третьего возраста они разветвлены. У личинки третьего возраста на кончике задних дыхалец начинает появляться темно-оранжевое кольцо.
    1. Наклейте кусочек двустороннего скотча на чистое предметное стекло микроскопа. Удалите пузырьки воздуха из-под скотча, чтобы избежать бликов при визуализации.
    2. Извлеките из инкубатора одну из пробирок с культивируемыми мухами на стадии личинки.
    3. Найдите личинку в среде, извлеките ее с помощью мягкой кисточки и поместите на чистую салфетку. Удалите остатки пищи, прилипшие к личинке, влажной мягкой кисточкой и просушите ее на салфетке.
    4. Перенесите очищенную муху на салфетку под объектив широкопольного микроскопа.
    5. Отрегулируйте фокус микроскопа, чтобы четко видеть муху. С помощью микроскопа определите стадию развития личинки по ее структурным характеристикам.
    6. С помощью мягкой кисточки расположите муху так, чтобы тело было выпрямлено, а дорсальная сторона была обращена вверх, для последующей фиксации на предметном стекле дорсальной стороной. Выполняйте этот шаг под микроскопом.
    7. Убедитесь, что личинка полностью сухая перед фиксацией на скотче. В противном случае личинка не будет прилипать к скотчу.
    8. Прижмите дорсальную сторону расположенной мухи к двустороннему скотчу на предметном стекле с умеренным усилием. Обратите внимание, что слишком сильное давление может убить муху, а слишком слабое приведет к ее смещению во время визуализации.
  2. Оптическая визуализация Drosophila на личиночных стадиях (L2 и L3) с помощью OCM
    ПРИМЕЧАНИЕ: На личиночных стадиях широкий просвет сердечной трубки располагается в сегментах от A5 до A8 (Рисунок 1). Для каждой личинки были получены поперечные изображения OCM в M-режиме (2D + время) в сегменте A7 сердечной трубки для облегчения анализа систолы и диастолы.
    1. Поместите зафиксированную личинку на регулируемый предметный столик системы OCM вдоль y-поперечного направления дорсальной стороной вверх под объектив. Для размещения личинки в предметном столике необходимо небольшое отверстие, чтобы избежать ее контакта с плоскостью столика.
    2. Отрегулируйте предметный столик, чтобы переместить сердечную трубку дрозофилы в фокальную плоскость сканирующего луча. Чтобы легко найти сегмент A7, найдите заднюю область сердечной трубки с помощью OCM-изображений поперечного сечения в реальном времени в программном обеспечении для сбора данных. Затем перемещайте столик вперед, пока не станет виден сегмент A7.
    3. Установите в ПО для сбора данных параметры: 100 A-сканов на B-скан (кадр), 100 B-сканов, напряжение сканера для охвата ~ 0.28 mm в x-поперечном направлении и 0 V в y-поперечном направлении. Нажмите кнопку «start» в программе, чтобы собрать данные о фоновом шуме для вычитания фона, перекрыв путь луча к образцу темной тканью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для вычитания фона можно использовать 3 из 100 кадров.
    4. Установите в ПО для сбора данных параметры: 128 A-сканов на B-скан, 4096 B-сканов, напряжение сканера для охвата ~ 0.28 mm в x-поперечном направлении и 0 V в y-поперечном направлении. Нажмите кнопку «start» в программе, чтобы получить поперечные M-mode изображения сегмента A7 сердечной трубки мухи в области 0.28 x 0.57 mm2 в течение примерно 30 сек.
    5. Во время процесса сохранения данных перекройте сканирующий луч темной тканью, чтобы избежать длительного воздействия света на сердце мухи.
    6. Повторите измерение 5 раз для получения надежных данных о функции сердца.
    7. Установите в ПО для сбора данных параметры: 400 A-сканов на B-скан, 800 B-сканов, напряжение сканера для охвата ~ 1.7 mm в x-поперечном направлении и ~ 4 mm в y-поперечном направлении. Перемещайте столик в обоих направлениях, чтобы убедиться, что вся муха попадает в область визуализации. Нажмите кнопку «start» в программе, чтобы получить один набор данных для трехмерной визуализации мухи. Примечание: 3D-структура мухи может быть визуализирована с помощью ПО Amira 3D.
    8. С помощью влажной мягкой кисточки увлажните исследуемую муху и осторожно снимите ее с предметного стекла. Переместите ее в отдельную пробирку для дальнейшего развития. Маркируйте пробирку для лонгитюдного исследования на последующих стадиях развития.
  3. Визуализация Drosophila на стадиях куколки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все мухи извлекались для визуализации с PD1 по PD5. Как показано на схеме личинки на Рисунке 1b, широкий просвет сохраняется в сегментах A5–A8 сердечной трубки до PD1. Начиная с PD2, между сегментами A1–A4 начинает развиваться коническая камера. Для получения однородных изображений и облегчения анализа сердца поперечные M-mode изображения получали из сегмента A7 на PD1 и из сегмента A1 после PD2, как отмечено на Рисунке 1b.
    1. Визуализация Drosophila на PD1
      ПРИМЕЧАНИЕ: На стадии PD1 Drosophila в течение короткого окна (0–1 ч) имеет белый пупарий. Это временное окно идеально подходит для оптической визуализации ранней куколки, так как высокая прозрачность обеспечивает лучшее проникновение света для OCM-визуализации.
      1. Поскольку при окукливании мухи находятся на стенках пробирки, извлеките куколку из индивидуальных пробирок для визуализации на PD1 с помощью влажной мягкой кисточки; если к телу прилипла пища, очистите куколку кисточкой.
      2. С помощью влажной кисточки зафиксируйте муху непосредственно на маленьком предметном стекле дорсальной стороной вверх (Рисунок 1a). Убедитесь, что предметное стекло достаточно мало, чтобы после завершения визуализации на этом этапе его можно было вернуть обратно в пробирку.
      3. Удалите излишки воды с боков тела мухи.
      4. Поместите предметное стекло на предметный столик системы OCM мухой вверх. Найдите четкое изображение сегмента A7 сердца мухи в реальном времени, используя ту же стратегию, что и при измерении личинки.
      5. Установите те же параметры ПО для сбора данных, что и в разделе 3.2, и запишите сердцебиения в сегменте A7 для получения поперечных M-mode и 3D-изображений.
      6. После визуализации с помощью пинцета поместите предметное стекло с куколкой обратно в пробирку для дальнейшего культивирования.
    2. Визуализация Drosophila на стадиях от PD2 до PD5
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку на стадиях развития куколки образец становится все более непрозрачным, глубина проникновения системы визуализации будет снижаться.
      1. С помощью пинцета осторожно извлеките из пробирки предметное стекло с зафиксированной мухой на стадии PD2 для визуализации. На PD2 оболочка образца становится желтоватой, а тело — менее прозрачным по сравнению с PD1 (Рисунок 1).
      2. Поместите стекло на предметный столик системы OCM.
      3. Отрегулируйте предметный столик, чтобы переместить муху в фокальную плоскость сканирующего луча системы OCM. Найдите передний конец сердечной трубки с помощью OCM-изображения поперечного сечения в реальном времени. Переместитесь примерно на 50 µm назад в заднем направлении, чтобы найти сегмент A1 сердечной трубки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе развития сердца (PD2) коническая камера будет очень мала и может не сокращаться.
      4. Соберите наборы данных поперечного M-mode из сегмента A1, а также 3D-данные, используя тот же метод, что и для предыдущих стадий развития.
      5. Осторожно верните стекло в пробирку для дальнейшего культивирования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: На PD3 цвет образца в оболочке темнее, чем на стадии PD2. На стадии PD4 внутри оболочки образцов можно наблюдать черные полосы. Некоторые мухи превратятся во взрослых особей на следующий день после этой стадии, другие перейдут в стадию PD5. На стадии PD5 черные полосы у мух видны еще отчетливее. Эти мухи станут взрослыми на следующий день.
  4. Визуализация Drosophila на взрослой стадии
    ПРИМЕЧАНИЕ: На взрослой стадии самок и самцов можно отличить по размеру тела и цвету нижней части брюшка. Взрослые самки крупнее, в то время как самцы меньше и имеют темный цвет в нижней части брюшка.
    1. Извлеките пробирку из инкубатора, когда муха разовьется во взрослую особь, и перенесите взрослую муху в пустой флакон объемом ~ 45 ml.
    2. Окуните абсорбирующий конец стержня (длиной ~ 1 cm, диаметром ~ 3 mm) в анестетик, поместите стержень во флакон и заткните горлышко пробирки пучком ваты так, чтобы конец с анестетиком находился прямо под ватой; анестезируйте муху в течение 3 мин. Продолжительность анестезии зависит от размера мухи и может составлять от 2.5 до 3.5 мин (например: для самца — 2.5 мин, для самки — 3 или 3.5 мин).
    3. Подготовьте предметное стекло с кусочком двустороннего скотча.
    4. С помощью мягкой кисточки переместите анестезированную муху на предметное стекло дорсальной стороной вверх.
    5. Разведите крылья с помощью пинцета и приклейте их к скотчу под микроскопом, чтобы зафиксировать муху и открыть область сердца для визуализации.
    6. Проведите визуализацию мухи, начиная с сегмента A1 сердца (Рисунок 1). В конце эксперимента муха может быть усыплена.

4. Анализ изображений16

  1. Разработайте программы на Matlab для преобразования 2D- и 3D-бинарных файлов, полученных с помощью программного обеспечения для сбора изображений, в файлы изображений.
  2. Используйте ImageJ для определения области сердечной трубки на поперечных изображениях в M-режиме и алгоритм «волшебной палочки» (magic wand) для создания маски области сердца для каждого поперечного изображения в M-режиме. Выполните сегментацию замаскированной области и используйте алгоритм поиска пиков для определения систолического и диастолического положений. Рассчитайте зависящие от времени изменения диаметра сердца по поперечным изображениям в M-режиме.
  3. На основании полученных значений диаметра сердца в зависимости от времени рассчитайте такие кардиологические параметры, как ЧСС (HR), период сердечной активности (CAP), конечный диастолический диаметр (EDD), конечный систолический диаметр (ESD), конечная диастолическая площадь (EDA) и конечная систолическая площадь (ESA). Рассчитайте фракционное укорочение (FS) с помощью Расчет формулы FS для определения процентной разницы; уравнение; образовательная математическая концепция.
  4. Используйте ImageJ для анализа 3D-изображений OCM с целью визуализации структурного развития сердца мухи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Продольная визуализация сердца проводилась с использованием линий плодовых мушек 24B-GAL4/+ при комнатной температуре с помощью OCM. Измерения выполнялись на стадиях L2, L3, а также с интервалом в 8 ч с PD1 по PD4 и в 1-й день взрослой стадии (AD1) для отслеживания процесса метаморфоза (Таблица 1). Личинки, ранние и поздние куколки, а также взрослые мушки были закреплены на предметных стеклах, как показано на Рисунке 1A. Особенности сегментации сердца личинок и взрослых мушек представлен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Учащенное сердцебиение дрозофилы с максимальной частотой сердечных сокращений около 400 уд/мин на личиночной и взрослой стадиях требует высокой скорости визуализации для разрешения диастол и систол сердца (не менее 80 кадров в секунду на основе опыта). Из-за небольшого размера камеры сердца и толщины стенки сердца в микронном масштабе (5 - 10 мкм) для разрешения структур сердечной трубки требуется высокое пространственное разрешение (лучше 2 мкм). В этом исследовании была разработана система OCM с высоким разреш...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с настоящим исследованием.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом стартапов Университета Лихай, NIH (R00EB010071 к C.Z., R15EB019704 к C.Z. и A.L., R03AR063271 к A.L., и R01AG014713 и R01MH060009 к R.E.T.), NSF (1455613 к C.Z. и A.L.), Cure Alzheimer's Fund (к R.E.T.) и Массачусетской больнице общего профиля (премия Исполнительного комитета по исследованиям для A.L.). M.C. и Y.M. была поддержана Национальной программой ключевых фундаментальных исследований Китая (Программа 973) в рамках гранта No 2014CB340404.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Индивидуальная система визуализации OCMРазработанная в нашей лаборатории
мой Temp Mini Digital IncubatorBenchmarkH2200-HC
Cover glassAmScope200PCS
Cotton BallRITE AID
Instant Drosophila FormulaCAROLINAformula 4-24
ДрожжиActiveDry
МикроскопSONYWILD M420
BrushLoew-Cornell245Bиспользуется для перемещения образцов
Программное обеспечение LabviewNational Instruments
ImageJНациональные институты здравоохранения
MatlabMathworks
TweezerWihaAA SAдля фиксации плодов крылья мухи
FlyNapCarolina Biological Supply Company4,224,898
Скотч Перманентная двусторонняя лента, 3 мСкотч
пипеткаFisherbrandMU18837
органическое экстра кокосовое маслоSpring Valley13183
Предметное стекло для микроскопаCapitolBrandM3504-E
Дрозофила ФлаконыSEOH8401SS
Все транс-ретинальныеSigma-Aldrich Co.Р2500

Ссылки

  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021(2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213(2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236(2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425(2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425(2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014(2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313(2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020(2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639(2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сердце Drosophilaвизуализация функции сердцапоперечный M-режим3D-ОКМ-визуализацияколичественное определение частоты сердечных сокращенийпериод сердечной активностиметаморфоз Drosophilaнеинвазивная визуализациялонгитюдное исследование
Drosophila Подготовка и Продольная Визуализация сердца Функция In Vivo Использование оптической когерентной микроскопии (ОКМ)
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.