Методическая статья

Эффективный метод для выделения высокоочищенного РНК из семян для использования в количественном анализе Транскриптом

DOI:

10.3791/55008

⸱

11 января 2017 г.

 ,  , 
1Laboratory of Biological Diversity, Department of Evolutionary Biology and Biodiversity, National Institute for Basic Biology, 2Department of Basic Biology, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies), 3Department of Cell Biology, National Institute for Basic Biology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нам удалось разработать метод выделения РНК из семян растений, содержащих большое количество масел, белков и полифенолов, которые оказывают ингибирующее действие на выделение РНК высокой чистоты. Наш метод подходит для мониторинга экспрессии генов с низким уровнем транскриптов в семенах.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Семена растений накапливают большое количество запасов, содержащих биоразлагаемые органические вещества. Люди полагаются на запасы семян для хранения пищи и в качестве промышленных материалов. Профили экспрессии генов являются мощными инструментами для исследования метаболической регуляции в растительных клетках. Поэтому для селекции сельскохозяйственных культур необходимы подробные и точные профили экспрессии генов во время развития семян. Приобретение высокоочищенной РНК имеет важное значение для производства этих профилей. Необходимы эффективные методы выделения высокоочищенной РНК из семян. В данной работе мы описываем метод выделения РНК из семян, содержащих большое количество масел, белков и полифенолов, которые оказывают ингибирующее действие на выделение РНК высокой чистоты. Наш метод позволяет получать высокоочищенную РНК из семян без использования фенола, хлороформа или дополнительных процессов для очистки РНК. Этот метод применим к арабидопсису, рапсу и семенам сои. Наш метод будет полезен для мониторинга паттернов экспрессии транскриптов низкого уровня в развивающихся и зрелых семенах.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растения производят семена, которые дают начало следующему поколению. Семена скапливаются большие объемы запасов хранения, таких как масла, углеводов и белков, для пост-герминативных роста. Люди используют семенные запасы хранения в качестве источника питания и кормов для животных, и, таким образом, семена растений являются одним из основных поставщиков пищевого органического вещества по всему миру. Увеличение урожайности семян является важной задачей в растительном науке.

Поскольку запасы хранения семян являются коммерчески ценным источником пищевых и промышленных материалов, молекулярные механизмы , лежащие в основе регуляции метаболизма этих запасов были широко исследованы 1-6. Далее выяснении эти механизмы будут полезны для повышения урожайности семян сельскохозяйственных культур. Семена развиваются в растительных яичниках после оплодотворения, и они созревают через ряд стадий развития 1,6,7. Дальнейшее развитие понимания молекулярного механизма, лежащего семян требует подробное, Точные профили экспрессии генов из ряда развивающихся семенах будет производиться. Тем не менее, высокие количества масла, белков, углеводов и полифенолов в семенах растений, делают его трудно выделить высокоочищенного РНК, что исключает возможность точного профилирование экспрессии генов.

Здесь мы вводим эффективный метод выделения РНК из семян масличных культур, содержащих большое количество масел, белков и полифенолов. Используя этот метод, исследователи смогут подготовить высокоочищенного РНК. Такая РНК будет полезна для мониторинга изменений в транскрипционные ключевых генов, контролирующих метаболический регулирование запасов хранения семян в развивающихся и зрелых семян масличных культур.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выделение тотальной РНК из семян растений

  1. Подготовьте наборы буферов, спиновые колонки, 1,5 и 2,0 мл полипропиленовые трубы и нуклеазы 1,5 мл полипропиленовые трубы.
  2. Добавить 1% (вес / об) молекулярной биологии класса поливинилпирролидона (далее именуемые как PVP) в буфере для лизиса клеток для экстракции РНК и вортексе. Инкубировать в течение 20 мин при 25 ° С до полного растворения. После 20-минутной инкубации, смешать буфер осторожно поворачивая трубку вверх дном, чтобы предотвратить образование пузырьков. Хранить при комнатной температуре (15-25 ° C) перед использованием.
  3. Урожай фруктов из Резуховидка Таля растений и место в 1,5 мл полипропиленовые пробирки на льду. Место фрукты на алюминиевые пластины выдерживают при температуре 4 ° С и изолируют семена из плодов с помощью стереомикроскопа.
    1. Поместите выделенные семена (около 200 семян) в 1,5 мл полипропиленовые пробирки, которые были сохранены в алюминиевой стойке на льду и сразу же поместить пробирки в жидком пitrogen.
  4. Удалите трубки из жидкого азота и вернуть их в алюминиевой стойке на льду. Добавьте 100 мкл буфера, содержащего 1% PVP и центрифуги в течение 1 мин при 1000 х г при температуре 4 ° С.
  5. Однородный образец с пестиком из нержавеющей стали с использованием мотор-шлифовальной машины в течение 60 с, держа трубку в алюминиевой стойке на льду.
  6. Добавить 550 мкл буфера, содержащего 1% PVP, смешайте буфер осторожно поворачивая трубку вверх дном, и инкубируют в течение 10 мин при 25 ° С.
  7. Центрифуга в течение 5 мин при 8000 х г при 25 ° С и передачи 550 мкл супернатанта к новой 1,5 мл полипропиленовую трубку.
  8. Центрифуга в течение 5 мин при 10000 х г при 25 ° С и передачи 450 мкл супернатанта к новой 1,5 мл полипропиленовую трубку.
  9. Используйте супернатант в качестве клеточного лизата для экстракции РНК. Далее следуйте процедуре, описанной в инструкции изготовителя в коммерчески доступного набора.
  10. ЭлюируйтеРНК с использованием минимального объема буфера для элюции, чтобы обеспечить достаточно высокую концентрацию РНК для мониторинга паттерны экспрессии транскриптов низкого уровня. Хранить РНК в глубоком морозильнике до использования.

2. Проверка качества РНК

  1. Разморозить тотальной РНК, перемешать путем осторожного постукивания, и поместите трубку в алюминиевой стойке на льду.
  2. Измерение концентрации РНК, соотношение A260 / A280 и A260 соотношение / A230 с использованием микрообъем спектрофотометра.
  3. Развести тотальную РНК в РНКазу воде до конечной концентрации 70 нг / мкл.

3. обратной транскрипцией тотальной РНК из семян

  1. Оттепель тотальной РНК и буферных наборов из коммерческого набора. Держите ферменты из комплекта на льду после осторожного постукивания. Подготовка нуклеазы 0,2 мл полипропиленовые трубы.
  2. Добавьте 5 мкл тотальной РНК, 1 мкл олиго дТ праймера (50 мкМ) и 1 мкМ случайных 6-меров (50 мкМ) в 0,2 мл полипропиленоваяЛене трубки на льду.
  3. Выдержите в течение 15 мин при 37 ° С и помещают на лед.
  4. Далее следуйте процедуре, описанной в инструкции изготовителя в обратном наборе транскрипции-ПЦР.
  5. Поместите продукты обратной транскрипции на льду перед использованием.

4. Количественный анализ в реальном времени ПЦР

  1. Построить плазмид, несущих последовательности гена-мишени с использованием протокола производителя.
  2. Отрегулируйте концентрации до 100-500,000 копий / мкл для ДНК-матриц для стандартных кривых.
  3. Разбавьте растворы кДНК (1: 100) с дистиллированной водой.
  4. Добавьте 2 мкл разбавленных растворов кДНК и плазмид для стандартных кривых к основной смеси из количественного ПЦР в реальном времени набора.
  5. Установка ПЦР в реальном времени с использованием следующих условий: езда на велосипеде 95 ° C в течение 30 с, а затем 40 циклов при 95 ° С в течение 5 с и 60 ° С в течение 35 сек.
  6. Анализ числа копий в соответствии с мужчинойинструкции ufacturer для реального времени системы ПЦР.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сначала мы исследовали оптимальную концентрацию PVP с использованием Arabidopsis зрелых семян. Общую РНК выделяли из приблизительно 1000 семян в соответствии с протоколом, описанным выше, с использованием буфера для лизиса клеток, содержащего 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% или 2,0% PVP. После гомогенизации и центрифугирования супернатант собирали, избегая при этом слой масла и семян мусора (рисунок 1А).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

профили экспрессии генов способствуют нашему пониманию физиологии растений; Поэтому, методами выделения специфической РНК, были разработаны для каждого образца состояния 9-12. Мы исследовали процессы, которые были заторможены в процессе выделения РНК из семян и обнаружили, что РНК-связывание с кремнеземных мембран была сильно тормозится. Большое количество масел, белков и полифенолов ингибируют выделения РНК. Мы модифицировали процесс экстракции РНК для удаления этих соединений с раствором для лизиса до проце...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим сотрудников фонда функциональной геномики и спектрографирование и биоимиджинга фонда, NIBB Основные научно-исследовательских учреждений, а также модель исследовательского фонда растений, NIBB центр биоресурсов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RNeasy Plant Mini KitQIAGEN74904
поливинилпирролидонSigma-AldrichP5288-100G
ГОМОГЕНИЗАТОР S-303КАК ОДИН1-1133-02
NanoDrop LiteThermo ScientificND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT Набор реактивов (Perfect Real Time)TAKARARR037A
KAPA SYBR Набор для быстрой количественной ПЦРKapa biosystemsKK4601

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
  2. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).
  3. Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
  4. Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
  5. Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
  6. Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
  7. Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
  8. Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
  9. Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
  10. Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
  11. Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
  12. Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PVPArabidopsis

Похожие статьи