Метод для измерения Метаболизм в отсортированном субпопуляции сложных сообществ клеток с использованием стабильных изотопов Tracing

Краткое содержание

В этой статье описывается метод изучения клеточного метаболизма в сложных сообществах нескольких типов клеток, использующий комбинацию отслеживания стабильных изотопов, сортировки клеток для выделения конкретных типов клеток и масс-спектрометрии.

Аннотация

Типы клеток млекопитающих демонстрируют специализированный метаболизм, и есть достаточно доказательств того, что различные сосуществующие типы клеток участвуют в метаболическом сотрудничестве. Более того, даже культуры одного типа клеток могут содержать клетки в различных метаболических состояниях, такие как клетки покоя или циклические клетки. Методы измерения метаболической активности таких субпопуляций являются ценными инструментами для понимания клеточного метаболизма. Сложные клеточные популяции чаще всего разделяются с помощью клеточного сортировщика, а субпопуляции, выделенные этим методом, могут быть проанализированы методами метаболомики. Однако проблема с этим подходом заключается в том, что процедура сортировки клеток подвергает клетки стрессам, которые могут нарушить их метаболизм.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы пришли к выводу, что массовые распределения изотопомеров (MIDs) метаболитов из клеток, культивируемых с помощью питательных веществ, меченных стабильными изотопами, вероятно, будут более стабильными, чем абсолютные концентрации метаболитов, потому что MIDs формируются в течение более длительных временных масштабов и должны меньше зависеть от кратковременного воздействия условий сортировки клеток. Здесь мы описываем метод, основанный на этом принципе, сочетающий сортировку клеток с жидкостной хроматографией и масс-спектрометрией высокого разрешения (LC-HRMS). Процедура включает в себя анализ трех типов образцов: (1) экстракты метаболитов, полученные непосредственно из сложной популяции; (2) экстракты «фиктивно отсортированных» клеток пропускаются через прибор для сортировки клеток без гейтирования какой-либо конкретной популяции; и (3) выдержки из фактически отсортированных популяций. Фиктивно отсортированные ячейки сравниваются с прямой экстракцией, чтобы убедиться, что MID действительно не изменяются в результате самой процедуры сортировки клеток, прежде чем анализировать фактические отсортированные популяции. Мы приводим примеры результатов из клеток HeLa, отсортированных в соответствии с фазой клеточного цикла, которые показывают изменения в метаболизме нуклеотидов.

Введение

Высшие организмы содержат сложные сообщества различных типов клеток, которые взаимодействуют, чтобы вызвать более сложных функций. Например, опухоли содержат не только раковые клетки, но также и фибробласты, клетки , которые составляют кровеносные сосуды, и часто иммунной клетки инфильтратах ^1; Кровь содержит сложную смесь десятков подвидов клеток иммунной системы ^2; и даже культивируемые клеточные линии могут состоять из нескольких субпопуляций, таких как полостную и базальных подтипов клеток рака молочной железы ^3. Более того, различные типы клеток, которые сосуществуют могут проявлять метаболическую "сотрудничество". Например, в головном мозге, астроциты , как полагают , для превращения глюкозы в лактат, который затем "кормили" на нейроны , которые окисляют этот субстрат ^4; Т - лимфоциты , в некоторых контекстах , зависящих от соседних дендритных клеток в качестве источника цистеина ^5; и раковые клетки могут взаимодействовать с AssoФибробласты в лем, связанных опухолей ^6. Чтобы понять метаболическую поведение таких систем, необходимо отделить и измерить метаболической активности различных типов клеток, присутствующих.

До сих пор наиболее широко используемый метод для разделения типов клеток является флуоресценция активированных сортировки клеток. Этот метод широко применим, при условии, что тип клеток или состояние интереса может быть "меченый" с использованием флуоресцентных антител, экспрессию сконструированных флуоресцентные белки или другие красители. Одним из вариантов является изначально отдельных типов клеток через ячейку сортировщика, повторно культуры отдельные типы клеток , полученные, а затем проводить исследования метаболизма этих культур ^7. Тем не менее, это только осуществимо, если тип клеток или фенотип стабилен в условиях культивирования, и не могут захватывать переходное поведение, такие как состояния клеточного цикла, ни метаболического сотрудничества в совместных культурах. Для таких случаев, обмен веществ должно быть измерено непосредственно на такrted клетки. Это является сложной задачей , так как клетка процедуры сортировки подвергает клетки к стрессам , которые могут исказить их метаболизм ^8, и мы отдаем себе отчет лишь несколько исследований такой подход ^{9, 10.} В частности, мы обнаружили , что основные метаболиты , такие как аминокислоты могут вытечь из клеток , хранящихся в буфере сортировки клеток, таким образом , что измерения абсолютной метаболита изобилии перестают быть надежными ¹¹ (хотя относительное сравнение между отсортированных фракций все еще может быть ценным).

Чтобы обойти эти проблемы, мы обозначаем клетки со стабильными изотопами до сортировки, и сосредоточить внимание на MIDs в клеточных метаболитов, а не метаболит содержаний. Так как MIDs формируются в течение более длительных временных масштабах, они должны быть менее подвержены воздействию кратковременного воздействия условий сортировки. Мы количественно с помощью масс-мобильные интернет-устройства спектрометрии высокого разрешения полного сканирования, которое является достаточно чувствительным, чтобы обеспечить йата на сотни метаболитов, начиная с приблизительно 500 000 отсортированных клеток, требующих около 30-60 мин времени сортировки клеток. Сравнение между "издеваться" сортируется управления (клетки, передаваемые через клеточный сортер инструмента без стробирования какой-либо конкретной популяции) и экстракции метаболита непосредственно из культуры блюдо сделано, чтобы гарантировать, что наблюдаемые MIDs являются репрезентативными в исходной культуре. В зависимости от выбора стабильных изотопных индикаторов, различные метаболические пути могут быть изучены с помощью этого метода.

Протокол

1. метаболита Extraction

1. Извлечение из тарелки
   1. Культура клеток в 6-луночного планшета в трех повторах в стабильных изотопных маркированы культуральной среды + Диализованные добавки (сыворотки или другие добавки роста) до тех пор, пока клетки не станут 75% сплошности.
      Примечание: Здесь культуры HeLa клетки в течение 48 ч в среде RPMI , содержащей 40% U- ¹³ С-глюкозы и 70% U- ¹³ C, ¹⁵ N 2-глутамина и 5% FBS , диализуют (эмбриональной бычьей сыворотки). Диализовали FBS используется, чтобы избавиться от мелких метаболитов молекулярным весом, которые могут загрязнить меченого СМИ. Культивирование клеток в диализу добавки до начала реального эксперимента рекомендуется, чтобы обеспечить клетки растут, как правило, в среде. Добавки диализовали в 0,15 М растворе NaCl в течение ночи с помощью змеиной кожи диализной трубки.
   2. В день экстракции сброшенных культуральной среды, промыть лунки дважды промывали 500 мкл холодного HBSS и затем выбросить его.
      Примечание: Здесь используют HBSS, содержащий 40% U-13 С-глюкозой , так как он также в культуральной среде.
   3. Добавить 600 мкл 100% метанола предварительно охлаждены на сухом льду.
   4. Передача блюдо с сухим льдом и удаления клеточного материала с клеточным скребком.
   5. Тщательно пипеткой экстракты клеток в микроцентрифужных пробирку и хранить при температуре -80 ° С до масс-спектрометрического анализа.
2. Добыча фиктивных отсортированных клеток
   1. Культуры клеток в 100 мм блюдо в трех повторах в стабильных изотопов помечены медиакультуры + диализованных добавки.
      Примечание: Здесь культуры HeLa клетки в течение 48 ч в 100 мм чашку , так как большое число клеток (~ 4 х 10 ⁶⁾ необходимы для получения 500000 отсортированных клеток. требовалось Это число клеток экстракта HeLa для получения хорошего измерения метаболитов. Культуральные среды использовали среду RPMI , содержащей 40% U- ¹³ С-глюкозы и 70% U- ¹³ C, ¹⁵ N 2-глутамина и 5% диализовали ФБС.
   2. В день экстракции, сброшенных культуральной среды, промыть лунки WIth 1,5 мл теплой HBSS, а затем выбросить его.
   3. Отделить клетки путем добавления 1,5 мл трипсин / ЭДТА в течение 4 мин при 37 ° С. Выполните следующие действия в 4 ° С или на льду.
   4. Деактивировать трипсина путем добавления 3 мл ледяной HBSS (Hank сбалансированный солевой раствор) + диализированную добавки.
   5. Собирают клетки в 15 мл пробирку и центрифугируют при 750 х г в течение 3 мин.
   6. Ресуспендируют осадок в HBSS + диализу добавки + 1 мМ ЭДТА при концентрации 1-2 х 10 ⁶ клеток / мл, проходят через клеточные сита 40 мкм , чтобы получить отдельные клетки, и переносят в 5 мл пробирку.
   7. Сортировка клеток через клеточный сортер стробирования только для синглета, и центрифуга сортируется клетки при 750 мкг в течение 3 мин при 4 ° С.
      Примечание: Сортирование HeLa клетки со скоростью 1000 событий / сек, с давлением 27 фунтов на квадратный дюйм прибора, а также с помощью сопла 100 мкм. HeLa клетки большие, поэтому они должны быть отсортированы с медленной скоростью событий и большого сопла, чтобы получить как нетронутыми гранул, как это возможно. Держите клетки в холодных блоков throughouт сортировки, чтобы уменьшить метаболизм. Подробное описание процедуры сортировки описано ранее ^12.
   8. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 50 мкл охлажденного льдом дН ₂ O для получения гомогенной гранул перед добавлением метанола. Добавление холодного метанола непосредственно к осадку образует твердый осадок, который трудно ресуспендирования.
   9. Экстракт метаболитов путем добавления 540 мкл метанола хранить в сухом льду и держать выдержки при температуре -80 ° С до жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии высокого разрешения (LC-HRMS) анализа.
3. Выделение клеточного цикла отсортирован клеток
   1. Культуры клеток в 100 мм блюдо в трехкратном повторе в культуральной среде + диализуют добавок.
      Примечание: Здесь культура клетки HeLa , содержащие Geminin Fucci Green (MAG1-hGem) зонд ¹³ , который позволяет для сортировки G1 (отрицательной) и SG2M (положительных) клеток. Клетки могут культивироваться в стабильных изотопов отслеживания носителей вS длиной по мере необходимости. Здесь мы культивировали их в течение 46 часов в немаркированной средах, а затем мы перешли к RPMI , содержащую 40% U- ¹³ С-глюкозы и 70% U- ¹³ C, ¹⁵ N 2-Глютамин 2 часа до начала сортировки. Это было сделано для того, чтобы иметь возможность изучить фазы клеточного цикла, который требует короткого импульса маркировки.
   2. В день экстракции, сброшенных культуральной среды, промыть лунки 1,5 мл теплой HBSS, а затем выбросить его.
   3. Отделить клетки путем добавления 1,5 мл трипсин / ЭДТА в течение 4 мин при 37 ° С. Выполните следующие действия в 4 ° С или на льду.
   4. Деактивировать трипсина путем добавления 3 мл ледяной HBSS + диализовали добавки.
   5. Собирают клетки в 15 мл пробирку и центрифугируют при 750 х г в течение 3 мин.
   6. Ресуспендируют осадок в HBSS + диализу добавки + 1 мМ ЭДТА при концентрации 1-2 х 10 ⁶ клеток / мл, проходят через клеточные сита 40 мкм , чтобы получить отдельные клетки, и переносят в 5 мл пробирку.
   7. Сортировка клеток через клеточный сортер гтем создания из обломков и дублетов, а затем стробирования для клеточного маркера интерес, и центрифуга отсортирован клетки при 750 мкг в течение 3 мин при температуре 4 ° С.
      Примечание: Сортирование HeLa клетки со скоростью 1000 событий / сек, с давлением 27 фунтов на квадратный дюйм прибора, а также с помощью сопла 100 мкм. Хранить клетки в холодных блоках по всей сортировке, чтобы уменьшить скорость метаболизма.
   8. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 50 мкл охлажденного льдом дН ₂ O для получения гомогенной гранул перед добавлением метанола. Добавление холодного метанола непосредственно к осадку образует твердый осадок, который трудно ресуспендирования.
   9. Экстракт метаболиты путем добавления 540 мкл метанола, хранить в сухом льду и держать выдержки при температуре -80 ° C до проведения анализа LC-HRMS.

Анализ 2. Масс-спектрометрия

Примечание: Здесь мы опишем протокол для анализа клеточных экстрактов на системе LC-HRMS. Могут быть использованы любые методы метаболомики для анализа клеточных экстрактов. Полное сканированиеанализ может быть полезен для обнаружения широкого спектра метаболитов.

1. Калибровка прибора с помощью масс-спектрометрии эталонного калибровочного смеси.
2. Оттаивания клеточные экстракты на льду в течение 30 мин и вортексе в течение 15 с.
3. Перенести 100 мкл клеточного экстракта в спиновый фильтр и центрифугировать в течение 10 мин при 13000 х г при температуре 4 ° С.
4. Вводят 12,5 мкл фильтрата на систему LC-HRMS.
5. Отдельные метаболиты, использующие цвиттерионная Гидрофильные Interaction жидкостной хроматографии (ZIC-HILIC) колонка (150 мм х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм), снабженными защитной колонки ZIC-HILIC (20 мм × 2,1 мм) с использованием градиента элюции 0,1% муравьиной кислоты в воде (растворитель) и ацетонитрил (растворитель B). Запустите градиентное элюирование при 20% растворителя А и увеличение до 80% в 17 мин. Поддерживать этот процент в течение 4 мин с расходом 400 мкл мин ^-1 и температуре колонки и поднос образца при температуре 23 ° С и 4 ° С, соответственно.
6. Используйте Instrument в сочетании с хроматографического разделения для обнаружения метаболитов, нагретую электрораспылением (H-ESI II) в положительных и отрицательных мод как источника ионизации, а также полный режим сканирования сбора при разрешающей способности масс-70000 Полная ширина половины максимума (FWHM) ( м / з 200).
7. Использование азота (чистота> 99,995%) для газа оболочки и вспомогательного газа при скорости потока 45 и 10 а.е. (в произвольных единицах) и заданной температуры испарителя при температуре 350 ° С, напряжение электроспрея при 4 кВ в положительном режиме и -3.5 кВ в отрицательном режиме.

3. Анализ данных

1. Выберите ряд метаболитов, для которых стандарты доступны и которые показывают хорошие качества пиков в образцах. Хорошие пики качества имеют высокое отношение сигнала к шуму. Важно, чтобы проверить качество пика и убедитесь, что не включают в себя ложные изотопы. Изотопные пики, которые различаются по форме и / или времени удерживания, вероятно, ложно.
2. Для получения изотопно-меченных образцов расчета масс изотополога (MI), фракции путем деления площади пика каждого инфаркта миокарда с общей суммой площадей пиков всех MIS.
3. Вычислить меченые фракции углерод / азот, обогащение ¹³ С и ¹⁵ N, соответственно,
   
   где N является общее число атомов углерода (или атомам азота, соответственно) в метаболит, и микширование ИН фракция х.
   Все расчеты могут быть выполнены с использованием языков программирования.

Результаты

В качестве примера, здесь мы опишем эксперимент следственную метаболизм клеток HeLa, отсортированный по фазе клеточного цикла. Для того, чтобы маркировать широкий диапазон центральных метаболитов на обоих атомов углерода и азота, мы культивировали клетки в течение 48 ч с использованием U- ¹³ C-глюкозу и U- ¹³ C, ¹⁵ N-глутамина в качестве изотопных индикаторов. Для того, чтобы получить насыщенные средние частоты для эксперимента проверки, мы здесь выбрали ...

Обсуждение

Наш метод основан на принципе, что MIDs в клеточных метаболитов отражает "историю" метаболической активности клетки. Это дает возможность исследовать метаболические деятельности в субпопуляции клеток, так как они имели место в сложном сообществе клеток, до процедуры сортировки клеток. В отличие от этого , площади пиков метаболитов заметно различается между экстрактами отсортированных клеток и прямой экстракции из культуральной чашке ^11. Отчасти это происходит потому , что различные хими...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
HBSS	Sigma	H6648
INFLUX (inFlux v7 Sorter)	BD Biosciences
U-13C-глюкоза	Кембриджские изотопы	40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-глутамин	Кембриджские изотопы	CNLM-1275-H-0.1
Метанол (JT Baker), класс ВЭЖХ	VWR	BAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV Центробежные фильтры. Durapore PVDF 0.1 &; m	Millipore	UFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLC	Thermo Fisher научный
Q-Exactive Orbitrap Масс-спектрометр	Thermo Fisher научный
Merk-Sequant ZIC HILIC колонка (150 мм x 4,6  мм, 5 и микро; m)	Merck KGaA	1.50444.0001
Merk-Sequant ZIC HILIC защитная колонна (20 мм x 2,1 мм)	Merck KGaA
Ацетонитрил Optima LC-MS, янтарное стекло	Fisher Scientific	A955-212
Milli-Q вода	Millipore		Произведено с помощью системы Milli-Q Gradient
Myrsyra 99,5% Optima (муравьиная кислота)	Fisher Scientific	11423423
X100 Винтовой флакон 1,5 мл, 8-425 32x11,6 мм, янтарь, 100 единиц	Thermo Fisher scientific	10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Винтовые крышки)	Thermo Fisher Scientific	12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix	Sigma-Aldrich	MSCAL5	Калибровочный набор
SNAKESKIN 10K MWCO	Thermo Fisher scientific	88245
Mathematica v.10			Wolfram Research