Метод для измерения Метаболизм в отсортированном субпопуляции сложных сообществ клеток с использованием стабильных изотопов Tracing

Summary

В этой статье описывается метод изучения клеточного метаболизма в сложных сообществах нескольких типов клеток, использующий комбинацию отслеживания стабильных изотопов, сортировки клеток для выделения конкретных типов клеток и масс-спектрометрии.

Abstract

Типы клеток млекопитающих демонстрируют специализированный метаболизм, и есть достаточно доказательств того, что различные сосуществующие типы клеток участвуют в метаболическом сотрудничестве. Более того, даже культуры одного типа клеток могут содержать клетки в различных метаболических состояниях, такие как клетки покоя или циклические клетки. Методы измерения метаболической активности таких субпопуляций являются ценными инструментами для понимания клеточного метаболизма. Сложные клеточные популяции чаще всего разделяются с помощью клеточного сортировщика, а субпопуляции, выделенные этим методом, могут быть проанализированы методами метаболомики. Однако проблема с этим подходом заключается в том, что процедура сортировки клеток подвергает клетки стрессам, которые могут нарушить их метаболизм.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы пришли к выводу, что массовые распределения изотопомеров (MIDs) метаболитов из клеток, культивируемых с помощью питательных веществ, меченных стабильными изотопами, вероятно, будут более стабильными, чем абсолютные концентрации метаболитов, потому что MIDs формируются в течение более длительных временных масштабов и должны меньше зависеть от кратковременного воздействия условий сортировки клеток. Здесь мы описываем метод, основанный на этом принципе, сочетающий сортировку клеток с жидкостной хроматографией и масс-спектрометрией высокого разрешения (LC-HRMS). Процедура включает в себя анализ трех типов образцов: (1) экстракты метаболитов, полученные непосредственно из сложной популяции; (2) экстракты «фиктивно отсортированных» клеток пропускаются через прибор для сортировки клеток без гейтирования какой-либо конкретной популяции; и (3) выдержки из фактически отсортированных популяций. Фиктивно отсортированные ячейки сравниваются с прямой экстракцией, чтобы убедиться, что MID действительно не изменяются в результате самой процедуры сортировки клеток, прежде чем анализировать фактические отсортированные популяции. Мы приводим примеры результатов из клеток HeLa, отсортированных в соответствии с фазой клеточного цикла, которые показывают изменения в метаболизме нуклеотидов.

Introduction

Высшие организмы содержат сложные сообщества различных типов клеток, которые взаимодействуют, чтобы вызвать более сложных функций. Например, опухоли содержат не только раковые клетки, но также и фибробласты, клетки , которые составляют кровеносные сосуды, и часто иммунной клетки инфильтратах ^1; Кровь содержит сложную смесь десятков подвидов клеток иммунной системы ^2; и даже культивируемые клеточные линии могут состоять из нескольких субпопуляций, таких как полостную и базальных подтипов клеток рака молочной железы ^3. Более того, различные типы клеток, которые сосуществуют могут проявлять метаболи....

Protocol

1. метаболита Extraction

1. Извлечение из тарелки
   1. Культура клеток в 6-луночного планшета в трех повторах в стабильных изотопных маркированы культуральной среды + Диализованные добавки (сыворотки или другие добавки роста) до тех пор, пока клетки не станут 75% сплошности.
      Примечание: Здесь культуры HeLa клетки в течение 48 ч в среде RPMI , содержащей 40% U- ¹³ С-глюкозы и 70% U- ¹³ C, ¹⁵ N 2-глутамина и 5% FBS , диализуют (эмбриональной бычьей сыворотки). Диализовали FBS используется, чтобы избавиться от мелких метаболитов молекулярным весом, которые могут загрязнить меченого СМИ. Культивирование к....

Results

В качестве примера, здесь мы опишем эксперимент следственную метаболизм клеток HeLa, отсортированный по фазе клеточного цикла. Для того, чтобы маркировать широкий диапазон центральных метаболитов на обоих атомов углерода и азота, мы культивировали клетки в течение 48 ч с использованием U- ¹³ C-глюкозу и U- ¹³ C, ¹⁵ N-глутамина в качестве изотопных индикаторов. Для того, чтобы получить насыщенные средние частоты для эксперимента проверки, мы здесь выбрали .......

Discussion

Наш метод основан на принципе, что MIDs в клеточных метаболитов отражает "историю" метаболической активности клетки. Это дает возможность исследовать метаболические деятельности в субпопуляции клеток, так как они имели место в сложном сообществе клеток, до процедуры сортировки клеток. В отличие от этого , площади пиков метаболитов заметно различается между экстрактами отсортированных клеток и прямой экстракции из культуральной чашке ^11. Отчасти это происходит потому , что различные хими.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H6648
INFLUX (inFlux v7 Sorter)	BD Biosciences
U-13C-глюкоза	Кембриджские изотопы	40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-глутамин	Кембриджские изотопы	CNLM-1275-H-0.1
Метанол (JT Baker), класс ВЭЖХ	VWR	BAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV Центробежные фильтры. Durapore PVDF 0.1 &; m	Millipore	UFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLC	Thermo Fisher научный
Q-Exactive Orbitrap Масс-спектрометр	Thermo Fisher научный
Merk-Sequant ZIC HILIC колонка (150 мм x 4,6  мм, 5 и микро; m)	Merck KGaA	1.50444.0001
Merk-Sequant ZIC HILIC защитная колонна (20 мм x 2,1 мм)	Merck KGaA
Ацетонитрил Optima LC-MS, янтарное стекло	Fisher Scientific	A955-212
Milli-Q вода	Millipore		Произведено с помощью системы Milli-Q Gradient
Myrsyra 99,5% Optima (муравьиная кислота)	Fisher Scientific	11423423
X100 Винтовой флакон 1,5 мл, 8-425 32x11,6 мм, янтарь, 100 единиц	Thermo Fisher scientific	10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Винтовые крышки)	Thermo Fisher Scientific	12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix	Sigma-Aldrich	MSCAL5	Калибровочный набор
SNAKESKIN 10K MWCO	Thermo Fisher scientific	88245
Mathematica v.10			Wolfram Research