Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

затравочный

7.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55013

⸱

12 января 2017 г.

 ,  ,  , 
1Laboratoire d'écologie et d'épidémioloigie parasitaire, Institut de biologie, Université de Neuchâtel, 2Merkle Lab, Department of Entomology, Pennsylvania State University

В этой статье

Краткое содержание

С помощью инокуляции шариками, описанный метод позволяет стимулировать реакцию меланизации комаров в циркуляционной системе гемолимфы. Количество меланина, покрывающего бусины, может быть измерено после вскрытия как мера иммунного ответа.

Аннотация

Стимуляция иммунного ответа является распространенным инструментом в беспозвоночными исследований с целью изучения эффективности и механизмов иммунитета. Эта стимуляция основана на введении непатогенных частиц в насекомых, так как частицы будут обнаружены иммунной системой и будет индуцировать образование иммунных эффекторов. Мы сосредоточимся на стимуляции реакции меланизации в комара Anopheles gambiae. Результаты ответа меланизации в капсулой инородных частиц и паразитов с темным слоем меланина. Чтобы стимулировать этот ответ, комары заражают с бисером в грудной полости с использованием микрокапиллярных стеклянных трубок. Затем, после того, как 24 часов, комары рассечены, чтобы получить шарики. Степень меланизации борта измеряется с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Бусинки не имеют патогенного воздействия паразитов, или их способности уклоняться или подавлять иммунный ответ. Эти инъекции являются способом колбыповторно иммунной эффективности и влияния иммунных раздражений на других черт истории жизни, такие, как плодовитость или долговечность. Это не совсем так же, как непосредственно изучает паразита и хозяина взаимодействий, но это интересный инструмент для изучения иммунитета и его эволюционной экологии.

Введение

Насекомые полагаются на иммунные ответы , чтобы защитить себя от паразитов и патогенных микроорганизмов 1 - 3 , которые нарушают через их кутикулу или их эпителия средней кишки 4. В комаров, эти реакции являются эффективными против бактерий, вирусов 5 6, 7 филяриатозных нематод и паразитов малярии 1,8,9. В комаров, ключевой иммунный ответ является герметизация инородных частиц с меланином 10 - 12. Эта герметизация может произойти в кишке или в гемолимфе циркуляционная система 10 - 12. Этот ответ меланизации является результатом про-фенолоксидазы каскад 10 - 12, и это может привести к гибели паразитов или их фагоцитоз. У взрослых комаров, где количество форменных клеток ограничено, меланизации является гуморальный ответ, как и против плазмодия паразитов или филяриатозных нематод 7.В некоторых других насекомых, то есть непосредственно Гемоциты клетки , которые собираются вокруг паразита melanize их 7. Кроме того, меланин также имеет важное значение для ряда других физиологических процессов , как производство яиц и кутикулы заживления ран 7.

Стимуляция иммунных реакций используется в качестве инструмента для изучения иммунитета насекомых в нескольких сельского хозяйства и общественного здравоохранения модельных систем 13 - 18. Он используется в Anopheles gambiae комары, основной вектор малярии в Африке, чтобы изучить паразита и хозяина взаимодействий 14 - 16,19. Эти методы основаны на способности насекомых обнаружить паразитов с их рецепторами распознавания образов (PRR) 2. Комары могут также обнаружить другие молекулы, мешающие их биологии, таких как патоген-ассоциированных молекулярных моделей (PAMPs), или обнаружить свои собственные поврежденные клетки вследствие высвобождения коллагена и нуклеиновых кислот. Иммунной клетки комаровs такие как гемоцитах используются для обнаружения 20 - 23. Основные иммунные сигнальные пути являются Imd, Toll, JAK / STAT 24, и вмешательство рибонуклеиновой кислоты (RNAi) 25,26. Оба Toll и пути IMD влияют на реакцию меланизации и взаимодействовать с про-фенолоксидазы каскад 10 - 12.

Стандартный инструмент, используемый для стимуляции реакции меланизации является прививка комара с небольшим бусинки в гемолимфе грудной полости. Степень меланина инкапсулирования затем может быть измерено 19 после извлечения бусинку через рассечение комара. В большинстве исследований, только один шарик был введен в комара 15,16,27, но инъекции больше бусин можно с целью изучения пределов ответа меланизации 19. Эти шарики вводят с использованием раствора для инъекций (физиологический сыворотки), чтобы ограничить нарушение москитной физиологии ивысыхание комаров 15,16,27. Краситель добавляют к этому раствору, чтобы облегчить выбор шарик. Это то же самое для решения рассечение , используемого для извлечения шарика 15,16,27.

Преимущество инокулируя насекомых с непатогенных раздражители является способность сосредоточиться на непосредственном воздействии на иммунный ответ. Там нет осложняющие эффекты , вызванные паразитами патогенности 28, иммуносупрессии 29 - 31, или иммунной уклонения от 31 - 34. Кроме того, последствия раздражений на других черт истории жизни, таких как долговечность или плодовитости, также могут быть изучены. Таким образом, исследователи , изучающие эволюционной экологии может потребоваться такие инструменты 2,35,36. Например, иммуно-вызов шмели имеют сокращенную продолжительность жизни при голодании. Подобные негативные эффекты иммунных раздражений и развертываний наблюдались в различных моделях беспозвоночных, что часто приводит к короткойэр продолжительность жизни или менее репродуктивный успех 13,27,37. Такие исследования могут проводиться в различных средах 2,4,38. Стимулирующие иммунитет также представляет интерес для тех , сосредоточив внимание непосредственно на иммунопатологии 39,40.

Этот протокол основан на инокуляции бусинок с комарами, чтобы стимулировать реакцию меланизации и непосредственно измерить количество меланина. Это позволяет количественное и качественное исследование реакции меланизации в различных экспериментальных условиях. Такой инструмент может быть распространен на стимуляцию других иммунных реакций, таких как антибактериальное ответ на убитых нагреванием бактерий 41. Она также может быть проведено во многих экологических условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Физиологический раствор для инъекций и Вскрытие

  1. Приготовьте солевой раствор путем добавления NaCl, KCl и CaCl 2 в дистиллированной воде , чтобы получить 1,3 мМ NaCl, 0,5 мМ KCl, 0,2 мМ и CaCl 2 при рН = 6,8.
  2. Добавить 1 мл раствора 0,1 зеленого% метилового эфира в 99 мл физиологического раствора для окрашивания прозрачных бусин. Это 0,001% метиловым зеленым "раствор для инъекций".
  3. Затем добавляют 5 мл раствора 0,1 зеленого% метилового эфира в 45 мл физиологического раствора. Это 0,01% метиловым зеленым "рассечение раствор" в 10 раз больше концентрируется в метиловым зеленым, чтобы облегчить окрашивание шариков и их наблюдение во время вскрытия.
    Примечание: Фильтр стерилизовать буфер, если это необходимо.

2. капиллярного Приготовление

  1. Тепло-выдвижные микрокапиллярных стеклянные трубки , чтобы получить очень тонкий кончик немного больше , чем наименьшее гранул (φ = 40 мкм) 42.
  2. Открыть иdjust каждый капилляр, разбив наконечник с помощью пинцета или путем распиливания наконечник прочь.

3. Mosquito Разведение

  1. Задний A. gambiae при 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% относительной влажности и 12:12 ч света: с темного цикла. Держите взрослых самок и дать им доступ к 10% -ного раствора сахара.

4. Выбор из бисера с капилляра

  1. Налейте 0,009 г отрицательно заряженных гранул (40-120 мкм в диаметре) в чашке Петри 5 см и добавить 5 мл раствора для инъекций 30 мин заранее.
    Примечание: Цель состоит в том, чтобы краситель цвет бусинки, чтобы сделать выбор шарик для инъекций легче. Автоклав бусы, если они не приходят в стерильную банку.
  2. Использование вмонтирован капилляр в капиллярной пипеткой колбой, визуально выбирать наименьший шарик в 0,1 мкл физиологического раствора под бинокулярным микроскопом.
    Примечание: Когда инокуляции несколько бусин одновременно, выбрать три бусинки от общего объема 0,1 мкл.

5. Комар Обращение с веществом и прививка

  1. Используя аспиратора насекомых, поместите каждый комар в 50 мл трубки.
  2. Холод каждый комар кратко, помещая трубку в колотый лед (2-5 мин).
  3. Поместите комара на правом боку под бинокулярным микроскопом.
  4. Под стереомикроскопа, прививают комара с капилляра, плотно пробивания левой части грудной полости кутикулы, а затем впрыска жидкости и закраиной.
    Примечание: Следите за тем, чтобы не повредить мышцы полета, держа капилляр, как перпендикулярно к комара, насколько это возможно.
  5. Удалить капилляр.
  6. Используя полулегком энтомологии щипцов, место каждая самка индивидуально в пластиковом стакане на 180 мл, покрытого москитной сеткой; дать им доступ к 10% -ного раствора сахара.
    Примечание: Требуется осторожность с раствором сахара, как комар может застрять на капли раствора сахара.

6. MosquitoВскрытие и бисера Фото

  1. Проверьте, если комары живы 24 часа после прививки. Если да, то проверить их состояние и держать только те комары, которые умеют летать.
  2. Зафиксировать эти комары при -20 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Они могут храниться в течение нескольких дней до нескольких месяцев, прежде чем рассечением, если это необходимо.
  3. Удалите крылья комары 'с помощью пинцета под бинокулярным микроскопом при увеличении 32Х. Закрепите крылья на предметные стекла с прозрачной лентой. Запишите код, используемый для каждого отдельного комара.
  4. Поместите стеклянные слайды в сканер и сканировать их в 1200 точек на дюйм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что код читается для каждого отдельного комара.
  5. На предметное стекло микроскопа и в рассечение растворе, используйте пинцет, чтобы отделить грудную клетку от головы и живота.
  6. Откройте грудную клетку с пинцетом для извлечения шариков.
    Примечание: шарики, которые не перемещаются в брюшной полости, не находятся в контакте друг с другом, и большинство из них свободно плавают в тон гемолимфы. Будьте осторожны, чтобы не сломать шарик с пинцетом, как не-melanized шарик может быть жестким, чтобы найти. Подождите от 1 до 5 мин для бусин, чтобы получить цвет.
  7. Передача бусины в капельке рассечение раствора на предметное стекло микроскопа, перед съемкой.
    Примечание: Нет необходимости мыть шарики.
  8. С помощью микроскопа, оборудованного камерой, возьмите цифровое изображение каждого шарика при стандартной установке освещения и 400X увеличения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не изменяйте освещение между различными изображениями для того чтобы включить их сравнение.

7. Анализ Фото: Шарик меланизации

  1. Откройте программное обеспечение для анализа изображений. Нажмите на кнопку "Файл" и затем на "открыть", чтобы найти шарик изображение.
  2. Нажмите на кнопку "анализировать". Нажмите на кнопку "набор измерений." Отметьте «среднее значение серого" окно в окно "Установка измерений".
  3. Нажмите на иконку круга инструмента выбора. Выберите шарик периметр; оставаться всторону борта и избежать светящихся ореолов вокруг него.
  4. Нажмите на меню "анализировать". Нажмите на "меры." Получают среднее значение серого и размер площади поперечного сечения валика.
    1. Для того, чтобы получить значение меланизации каждого борта, выполнить следующую операцию с помощью калькулятора или калькулятор программного обеспечения: "256 - среднее значение серого". Мера меланизации является значение от 0 до 256, при этом 0 соответствует совершенно белое изображение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Комары не все melanize бусинки точно так же, как и некоторые гранулы менее покрыты меланина , чем другие (рисунок 1). Действительно, некоторые шарики оставались синим из - за отсутствия меланизации, в то время как другие были полностью темным (рисунок 1). Величина меланизации была стандартизирована путем линейной интерполяции до значения в диапазоне от 0 (что соответствует голубой и unmelanized шарик) и 100 ( что соответствует темной и сильно melan...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот метод инъекции полезно, чтобы стимулировать и изучить реакцию меланизации в комаров. Например, здесь мы изучали влияние иммунной стимулов нагрузки.

Важным шагом в этой процедуре является правильно прививать комара. Любое чрезмерное повреждение мышц полета или самого комара может предотвратить комара от кормления или может убить его перед рассечение. Второй шаг Ключ должен держать комаров на льду достаточно долго, чтобы выбить их, не убивая их. Небольшой контейнер облегчит и ускорит проц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование стало возможным благодаря финансированию Университета Невшателя. Мы хотели бы поблагодарить всех студентов, которые помогли в совершенствовании этой техники, а именно нашего коллегу Кевина Тивента. Мы также хотели бы поблагодарить членов Лаборатории Томаса за предоставленную им лабораторию. Мы хотели бы поблагодарить Джанет Типл за ее помощь в разведении комаров. Мы также хотели бы поблагодарить Лояля Холла в лаборатории профессора Тома Бейкера за его помощь в подготовке микрокапиллярных стеклянных пробирок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микрокапиллярные стеклянные пробирки GB120TF-10science-products.comGB120TF-10http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html
Microcaps Каппиллярная пипетка ЛампаDrumond1-000-9000
отрицательно заряженный Sephadex CM C-25 бусиныSigma-Aldrich, Steinheim, GermanyC25120 SIGMAнужно немного для запуска
Метиловый зеленыйSigma-Aldrich323829 ALDRICHтребуется немного для запуска
Software ImageJс открытым исходным кодомверсии 1.47f7 или более поздней

Ссылки

  1. Dong, Y., Aguilar, R., Xi, Z., Warr, E., Mongin, E., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to human and rodent Plasmodium parasite species. PLoS pathog. 2 (6), e52(2006).
  2. Sadd, B. M., Schmid-Hempel, P. PERSPECTIVE: Principles of ecological immunology. Evolutionary Appl. 2 (1), 113-121 (2008).
  3. Crompton, P. D., Moebius, J., et al. Malaria Immunity in Man and Mosquito: Insights into Unsolved Mysteries of a Deadly Infectious Disease*. Annu Rev Immuno. 32 (1), 157-187 (2014).
  4. Schmid-Hempel, P. EVOLUTIONARY ECOLOGY OF INSECT IMMUNE DEFENSES. Annu Rev Entomol. 50 (1), 529-551 (2005).
  5. Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by hemocytes of the mosquito Aedes aegypti. J parasito. 89 (1), 62-69 (2003).
  6. Carissimo, G., Pondeville, E., et al. Antiviral immunity of Anopheles gambiae is highly compartmentalized, with distinct roles for RNA interference and gut microbiota. PNAS. 112 (2), E176-E185 (2015).
  7. Christensen, B. M., Li, J., Chen, C. -C., Nappi, A. J. Melanization immune responses in mosquito vectors. Trends parasito. 21 (4), 192-199 (2005).
  8. Collins, F., Sakai, R., et al. Genetic selection of a Plasmodium-refractory strain of the malaria vector Anopheles gambiae. Science. 234 (4776), 607-610 (1986).
  9. Warr, E., Lambrechts, L., Koella, J. C., Bourgouin, C., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: Involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization. Insect Biochem Molec. 36 (10), 769-778 (2006).
  10. Fuchs, S., Behrends, V., Bundy, J. G., Crisanti, A., Nolan, T. Phenylalanine metabolism regulates reproduction and parasite melanization in the malaria mosquito. PloS one. 9 (1), e84865(2014).
  11. Cerenius, L., Söderhäll, K. The prophenoloxidase-activating system in invertebrates. Immuno Rev. 198, 116-126 (2004).
  12. Cerenius, L., Lee, B. L., Söderhäll, K. The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity. Trend Immuno. 29 (6), 263-271 (2008).
  13. Moret, Y., Schmid-Hempel, P. Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers. , Science. New York, N.Y. 1166-1168 (2000).
  14. Suwanchaichinda, C., Paskewitz, S. M. Effects of Larval Nutrition, Adult Body Size, and Adult Temperature on the Ability of Anopheles gambiae(Diptera: Culicidae) to Melanize Sephadex Beads. J Med Entomol. 35 (2), 157-161 (1998).
  15. Chun, J., Riehle, M., Paskewitz, S. M. Effect of Mosquito Age and Reproductive Status on Melanization of Sephadex Beads in Plasmodium-Refractory and -Susceptible Strains of Anopheles gambiae. J Invertebr Pathol. 66 (1), 11-17 (1995).
  16. Schwartz, A., Koella, J. C. Melanization of Plasmodium falciparum and C-25 Sephadex Beads by Field-Caught Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Southern Tanzania. J Med Entomol. 39 (1), 84-88 (2002).
  17. Zahedi, M., Denham, D. A., Ham, P. J. Encapsulation and melanization responses of Armigeres subalbatus against inoculated Sephadex beads. J Invertebr Pathol. 59 (3), 258-263 (1992).
  18. Laughton, A. M., Garcia, J. R., Altincicek, B., Strand, M. R., Gerardo, N. M. Characterisation of immune responses in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J insect physiol. 57 (6), 830-839 (2011).
  19. Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Koella, J. C. Overloading the immunity of the mosquito Anopheles gambiae with multiple immune challenges. Parasite Vector. 9 (1), 210(2016).
  20. Lazzaro, B. P., Rolff, J. Danger, Microbes, and Homeostasis. Science. 332 (6025), 43-44 (2011).
  21. Arrighi, R. B. G., Faye, I. Plasmodium falciparum GPI toxin: a common foe for man and mosquito. Acta trop. 114 (3), 162-165 (2010).
  22. Michel, K., Kafatos, F. C. Mosquito immunity against Plasmodium. Insect Biochem Molec. 35 (7), 677-689 (2005).
  23. Osta, M. A., Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics. J Exp Biol. 207 (15), 2551-2563 (2004).
  24. Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Comparative and functional genomics of the innate immune system in the malaria vector Anopheles gambiae. Immunol Rev. 198 (1), 127-148 (2004).
  25. Blair, C. D. Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission. Future microbiol. 6 (3), 265-277 (2011).
  26. Fragkoudis, R., Attarzadeh-Yazdi, G., Nash, A. A., Fazakerley, J. K., Kohl, A. Advances in dissecting mosquito innate immune responses to arbovirus infection. J Gen Virol. , (2009).
  27. Schwartz, A., Koella, J. C. The cost of immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti depends on immune activation. J evol biol. 17 (4), 834-840 (2004).
  28. Lambrechts, L., Vulule, J. M., Koella, J. C. Genetic correlation between melanization and antibaterial immune responses in a natural population of the malaria vector Anopheles gambiae. Evolution. 58 (10), 2377(2004).
  29. Boete, C., Paul, R. E. L., Koella, J. C. Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1548), 1611-1615 (2004).
  30. Sacks, D., Sher, A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. Nat immunol. 3 (11), 1041-1047 (2002).
  31. Zambrano-Villa, S., Rosales-Borjas, D., Carrero, J. C., Ortiz-Ortiz, L. How protozoan parasites evade the immune response. Trend Parasito. 18 (6), 272-278 (2002).
  32. Damian, R. T. Parasite immune evasion and exploitation: reflections and projections. Parasitology. 115, S169-S175 (1997).
  33. Schmid-Hempel, P. Parasite immune evasion: a momentous molecular war. Trend ecol evol. 23 (6), 318-326 (2008).
  34. Schmid-Hempel, P. Immune defence, parasite evasion strategies and their relevance for "macroscopic phenomena" such as virulence. P Roy Soc B-Biol Sci. 364 (1513), 85-98 (2009).
  35. Stearns, S. C., Koella, J. C. The evolution of phenotypic plasticity in life history traits- predictions of reaction norms for age and size at maturity. Evolution. 40 (5), 893-913 (1986).
  36. Stearns, S. C. Life-history tactics: a review of the ideas. Q rev biol. 51 (1), 3-47 (1976).
  37. Valtonen, T. M., Kleino, A., Ramet, M., Rantala, M. J. Starvation Reveals Maintenance Cost of Humoral Immunity. Evol Biol. 37 (1), 49-57 (2010).
  38. Sheldon, B. C., Verhulst, S. Ecological immunology: costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology. Trend Ecol Evo. 11 (8), 317-321 (1996).
  39. Graham, A. L., Allen, J. E., Read, A. F. Evolutionary causes and consequences of immunopathology. Annu Rev Ecol Evol S. 36, 373-397 (2005).
  40. Best, A., Long, G., White, A., Boots, M. The implications of immunopathology for parasite evolution. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1741), 3234-3240 (2012).
  41. Cator, L. J., George, J., et al. 34;Manipulation" without the parasite: altered feeding behaviour of mosquitoes is not dependent on infection with malaria parasites. P Roy Soc B-Biol Sci. 280 (1763), 20130711(2013).
  42. Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).
  43. Paskewitz, S., Riehle, M. A. Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads. Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Меланиновый ответинокуляция микросферамимикрокапиллярная инъекциягрудная полостьанализ изображенийсреднее значение серогораствор метилового зеленогодиссекция комараиммуностимуляция
затравочный
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.