Методическая статья

Вазодилатацию изолированных судов и Изоляция внеклеточного матрикса мышей Плотно кожи

DOI:

10.3791/55036

⸱

24 марта 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 2Clement J. Zablocki Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Surgery, Division of Pediatric Surgery, Children's Research Institute, 4Department of Orthopedic Surgery, Medical College of Wisconsin, 5Deptarment of Anesthesiology, Clement J Zblocki Veteran Affairs Medical Center, 6Department of Medicine, Division of Cardiology, Medical College of Wisconsin

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем выделение сердечного внеклеточного матрикса у контрольных мышей C57Bl/6J, мышей с плотной кожей и мышей с плотной кожей, обработанных ингибирующим пептидом IRF5. Мы также описываем исследования вазодилатации изолированных сосудов от C57Bl/6J, мышей с плотной кожей и мышей с плотной кожей, получавших ингибиторный пептид IRF5.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Регуляторный фактор интерферона 5 (IRF5) имеет решающее значение для клеток, чтобы определить, реагируют ли они провоспалительным или противовоспалительным образом. Способность IRF5 переключать клетки с одного пути на другой очень привлекательна в качестве терапевтической мишени. Мы разработали ложный пептид IRF5D с помощью программного обеспечения для молекулярного моделирования малых молекул и пептидов.

IRF5D ингибировал IRF5, уменьшал изменения во внеклеточном матриксе и улучшал эндотелиальную вазодилатацию у мышей с плотной кожей (Tsk/+). Kd IRF5D для рекомбинантного IRF5 составляет 3,72 ± 0,74 x 10-6 М, что определено в экспериментах по связыванию с использованием экспериментов по интерферометрии биослоя. Пролиферация и апоптоз эндотелиальных клеток (ЭК) не изменялись при увеличении концентраций IRF5D (от 0 до 100 мкг/мл, 24 ч). Мышей типа тск/+ проводили лечение IRF5D (1 мг/кг/сут подкожно, 21 день). Экспрессия IRF5 и ICAM снижалась после лечения IRF5D. Функция эндотелия была улучшена, что оценивалось путем вазодилатации лицевых артерий у мышей типа Tsk/+, получавших IRF5D, по сравнению с мышами типа Tsk/+ без лечения IRF5D. В качестве транскрипционного фактора IRF5 перемещается из цитозоля в ядро. Транслокацию оценивали с помощью иммуногистохимии на сердечных миоцитах, культивируемых на различных внеклеточных матрицах сердца. Лечение IRF5D мышей Tsk/+ приводило к уменьшению количества IRF5-положительных ядер по сравнению с животными без лечения IRF5D (50 мкг/мл, 24 ч). Эти результаты демонстрируют важную роль, которую IRF5 играет в воспалении и фиброзе у мышей типа Tsk/+.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Регулирование роста клеток и гибели клеток иммунных реакций занимает центральное место в роли фактора транскрипции семейства интерферона регуляторных факторов. Irf5 выделяется как решающее значение для регуляции иммунных реакций между 1-го типа, воспалительного ответа, способствующего и типа 2, ремонт иммунный ответ таргетирования ткани. Irf5 является ключевым фактором при раке 1 и аутоиммунитета 2, 3, 4, 5.

Мышь плотно кожи (Tsk / +) является моделью для фиброза ткани и склеродермии вследствие мутации дублирования в гене фибриллин-1. Эта мутация приводит к сильной кожи и увеличение соединительной ткани. Эти мыши развивают воспаление миокарда, фиброза и , наконец , сердечной недостаточности 5, 6, 7,> 8, 9. Склеродермия является аутоиммунным фиброзных расстройством , поражающим около 150 000 пациентов в Соединенных Штатах 6. Признаки этого заболевания являются фиброз внутренних органов , включая сердце 7, 8, 9, 10, 11.

Характер исследования потребовал конструкцию ингибирующего пептида. Подход программного обеспечения был выбран более традиционный подход с использованием фагового дисплея. Подход программного обеспечения проще и займет меньше времени. Банк данных RCSB используется для идентификации соответствующих сайтов связывания 12. Для изучения взаимодействия недавно разработанного пептида с рекомбинантного белка и сосредоточиться на обязательных параметров, был использован метод, называемый бислоя интерферометрии. Бислоя интерферометрии является биосенсора на основе Techniqу.е, который определяет сродство к связыванию, ассоциацию и диссоциацию с использованием биосенсора и связывания образца. Биосенсор может быть флуоресцентно, люминесцентно, радиометрической и колориметрическим маркированы. Измерение основано на массовое добавление или истощение напоминающее ассоциацию и диссоциацию 13, 14. Цель данного исследования состояла в том, чтобы понять роль irf5 при воспалении миокарда и фиброз. Цель состояла в том, чтобы получить представление о роли irf5 в развитии фиброза тканей и склеродермии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета (протокол: AUA # 1517). Все исследования с участием мышей было проведено в соответствии с политикой PHS.

1. Конструкция Decoy пептидом

  1. Найти 3D структуру irf5 и основывать разработку на нем. Дизайн 17 меров, названный IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), где аспартат (D) замещен на серин (S), чтобы имитировать фосфорилирования в irf5 на 421 - 438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Анализ 3D сульфгидрильных групп и знаний о механизме irf5 в активации, то есть, серин фосфорилирования, предположил , что одна стратегия для таргетинга irf5 было создание приманку пептида. Смотри рисунок 1. Для того, чтобы определить лучший регион в 3D-структуры, использовать программное обеспечение для молекулярного моделирования для проектирования небольшой moleculэс и пептиды 15.
    Примечание: Важным шагом в этом процессе является наличие 3D-структуры белка-мишени и его возможных участков связывания. 3D структура irf5 точно представляет, как irf5 димеризуется после фосфорилирования. Замена аспартата для серина или треонина на внешний подряд. Пептид синтезирован отдельно, не будучи связаны с irf5.
  2. Репликация фосфо-домен просто путем замены D на S. На основе исходной последовательности (ELSWSADSIRLQISNPD, сделать новый пептид IRF5S с аминокислотной последовательности Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH 2 (IRF5D).

2. бислоя интерферометрии (BLI)

Примечание: Очистка рекомбинантного irf5 была на внешний подряд. 16

  1. Биотин метка irf5 в мольном соотношении 1: 1 биотина к лиганду с биотинилирования реагентом, включающим длинноцепочечные линкера. Длинная цепочка линкер обеспечит более активную и однородную Ligaй поверхности.
    1. Добавить 1 мл 2 мг / мл irf5 до 13 мкл 20 реагента биотин мМ или увеличить объемы, если это необходимо. Инкубируют на льду в течение 2 ч. После того, как маркировка, используют колонку обессоливание спиновый для удаления реакционной смеси из меченого белка.
  2. Выдержите биотин-меченого лиганда с биосенсоров в течение 15 мин. Избегайте чрезмерной маркировки и регулировать молярном соотношении 1: 1. После того, как маркировка, используют колонку обессоливание спиновый для удаления реакционной смеси из меченого белка.
  3. Выдержите биотин маркированы irf5 биосенсоров в течение 10 мин в различных концентрациях irf5-приманку пептида. Скорости ассоциации и диссоциации определяли , как описано 10, 17, 18.

3. Апоптоз и анализа пролиферации

  1. Анализ пролиферации с помощью bioreduction из тетразолии
    1. Администрируйте IRF5D разводили в PBS (1 мг /кг / сут, придать объем 20 мкл в 20 г мыши) подкожно с 27-го калибра иглы по стандартной методике scruffing или с помощью PBS в одиночку Tsk / + и C57BL / 6J мышей в течение 21 дней.
    2. Обезболить мышей с изофлуран (5%), а также выполнять шейки дислокации. Акцизный сердца от разрезав грудь вдоль грудины. Поднимите сердце с пинцетом и удалить сердце.
    3. Лизировать сердца с белком буфера для лизиса , содержащего 50 мМ Трис-HCl , рН 7,4, 0,5% NP-40, 250 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaF 10 и определения концентрации белка с помощью анализа Брэдфорда 19.
    4. Coat 96-луночные планшеты с C57BL / 6J сердечной матрицы выделен, как описано в разделе 7. Разведите PBS, подвешенный C57BL / 6J сердечную матрицу до концентрации 20 мкг / мл и добавляют 30 мкл C57BL / 6J сердечными в каждую лунку. Пусть отстояться в течение ночи при 37 ° С в инкубаторе.
    5. Культура клеток пупочной вены человека с использованием 500 мл эндотелиальной базальной мEdia с 0,4% экстракта бычьего мозга, 0,1% аскорбиновой кислоты, 0,1% гидрокортизона, 0,1% человеческого эпидермального фактора роста, 2% фетальной телячьей сыворотки и 0,1% гентамицина / амфотерицин В, добавленной к нему. Культуры клеток на 96 - луночные планшеты при 5% CO 2 и 95% воздуха в помещении с плотностью 25000 клеток на лунку. Стимулируют с возрастающими концентрациями IRF5D между 0 - 100 мкг / мл в среде (объемы были от 0 до 50 мкл / мл).
    6. Определить пролиферацию клеток после трех дней и оценить различия в оптической плотности на микропланшет-ридером. Реакция является bioreduction тетразолия соединения MTS. НАДФН или НАДН вырабатывается ферментов дегидрогеназы в метаболически активных клетках.
    7. По мере того как соединение тетразолия MTS хранится в замороженном состоянии при -20 ° С, оттаивают соединение медленно в течение приблизительно 90 минут при комнатной температуре. Пипетка по 20 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета и добавляют 100 мкл культуральной среды на него. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение от 1 до 4 ч в Хумиdified, 5% CO 2 камеры.
    8. Измерить оптическую плотность при длине волны 490 нм.
  2. Апоптоз анализа с помощью активности каспазы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная установка такая же, как и выше 3.1.1 3.1.5.
    1. Стимулируют клеток с возрастающими концентрациями IRF5D между 0 - 100 мкг / мл в среду.
    2. Добавить зеленый обнаружение на субстрат каспазы 3/7 в КЧС и инкубировать ее в течение 30 мин при 37 ° С. Оценка флуоресценции на планшет-ридере одновременно с длиной волны поглощения / испускания 502/530 нм. Выполните эксперименты в трех экземплярах.
      Примечание: зеленый флуоресцентный агент представляет собой пептид, четыре аминокислоты, связанный со связывающим красителем нуклеиновых кислот. Этот реагент становится люминесцентная при расщеплении после каспазы 3 и 7 активации. Эта измеряют флуоресценцию. Преимуществом является сокращение стадий промывки.

4. Оценка irf5 и ICAM-1 выражение в HearT

  1. Администрирование IRF5D разведенного в PBS (1 мг / кг / сут, впрыскивают объем 20 мкл в 20 г мыши) подкожно с иглой 27G с помощью стандартной методики scruffing или с помощью PBS в одиночку TSK / + и C57BL / 6J мышей один раз в день в течение 21 дней.
  2. Обезболить мышей с изофлуран (5%), а также выполнять шейки дислокации. Акцизный сердца от разрезав грудь вдоль грудины. Поднимите сердце с пинцетом и удалить сердце.
  3. Лизировать сердца с белком буфера для лизиса , содержащего 50 мМ Трис-HCl , рН 7,4, 0,5% NP-40, 250 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaF 10 и определения концентрации белка с помощью анализа Брэдфорда 19.
    1. Выполните вестерн-блот на лизатов сердец. Развести образцы до 25 мкг общего белка и объемом 40 мкл с помощью Laemmli буфера, содержащего 5% меркаптоэтанола. Запуск образцов на 4 - TGX геля 15% при 50 мВ в течение 5 мин. Увеличьте напряжение до 100 мВ в течение 1 ч, пока фронт красителя не закончится.
    2. Поместите гель в 1х буфере для переноса (25 мМ Трис, 190 мМ глицина, 20% метанола, доведения рН до 8,3, если это необходимо) и инкубируют в течение 10 - 15 мин.
    3. Соберите бутерброд передачи (губки, фильтр, гель, целлюлозной мембране, фильтр, губку). Убедитесь в отсутствии пузырьков в ловушке между ними. Блот должен быть сделан на катоде и геля на аноде. Передача в течение 1 ч в холодном помещении при 100 мА.
    4. На следующий день промойте пятно и затем блокируют фона в 5% обезжиренного сухого молока в течение 30 мин при комнатной температуре. Промыть Блот с Трис-солевом буферном растворе, содержащем 5% Tween три раза в течение 5 минут каждый.
    5. Выдержите в течение ночи с первичными антителами с использованием первичных поликлональных антител к irf5 или ICAM-1. Развести антитела в Трис-солевом буферном растворе в 1: 1000 разведении.
    6. Разведите вторичные антитела в Трис-солевом буфере и инкубировать блоттинга в течение 1 ч при комнатной температуре. Для получения вторичных антител, использование конъюгированных с пероксидазой хрена осла против мышиного Ig,G (1: 10000) и пероксидазы хрена осла против IgG козьего (1: 10000), соответственно.
    7. Применение хемилюминесценции к блоттинга после смешивания компонентов в соответствии с протоколом производителя и инкубировать в течение 3 мин к свечению полос, представляющих интерес. Выставляют кляксу на рентгеновской пленке. Используйте ImageJ для измерения плотности. Осуществить нормировку значений плотности в полосах 10 управления.

5. Оценка воспалительных клеток Числа после irf5 ингибирования

  1. Администрирование IRF5D разведенного в PBS (1 мг / кг / сутки) подкожно иглой 27G с помощью стандартной методики scruffing или с помощью PBS в одиночку Tsk / + и C57BL / 6J мышей в течение 21 дней.
  2. Обезболить мышей с изофлуран (5%), а также выполнять шейки дислокации. Акцизный сердца от разрезав грудь вдоль грудины. Поднимите сердце с пинцетом и удалить сердце. Мгновенного замораживания и не хранить вырезанные сердца до проведения анализа.
  3. Установите замороженные сердца на TISSдержатели УЭ, соответствующие криостата в использовании. Вырезать толщиной 10 мкм замороженных срезов на криостат для иммуногистохимии.
  4. Закрепить замороженные срезы 1% параформальдегидом в фосфатном буферном солевом растворе в течение 20 мин при комнатной температуре. Проницаемыми секции с 0,5% Triton-X 100 в PBS в течение 5 мин.
    Внимание: параформальдегид является регулируемым канцерогеном и нужно обращаться с осторожностью.
  5. Развести анти-CD64 кролика, а моноциты / макрофаги маркер 1: 200 в PBS. Нанести на неподвижных секциях и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С.
  6. Промыть слайдов в PBS в течение 5 мин три раза при комнатной температуре.
  7. Развести анти-крысиного Nimp, первичный маркер нейтрофилов 1: 200 в PBS. Нанести на неподвижных секциях и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С.
  8. Промыть слайды в течение 5 мин, трижды PBS при комнатной температуре.
  9. Развести вторичными антителами анти-кроличий Alexa 488 конъюгирован и анти-крыса Alexa 488 конъюгирован 1: 200 в PBS.
  10. Применение анти-кролик Alexa 488, конъюгированного и анти-крыса Alexa 488 конъюгированные вторичные антитела к разделам в течение 30 мин при 37 ° С, соответственно. Объем антител варьирует в зависимости от размера участка. Сумма должна покрывать раздел щедро. В большинстве случаев объем составляет от 100 до 200 мкл.
  11. С помощью 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) как окрашивающий ядра, в соотношении 1: 1000 разбавление в PBS. Добавить 1 мкл в 1 мл PBS и используют DAPI в последней стадии промывки. Добавить водный носитель монтажный к покровным и положил его на слайд.
  12. Проанализировать флуоресцентно меченных разделы с помощью конфокальной микроскопии с использованием объектива 40X масла. Использование возбуждения длинами волн 488 и длины волн излучения больше, чем 530 нм для CD64 и Nimp. DAPI возбуждалась с 360 нм и испускаемый при 460 нм в синий цвет. Отличить моноциты / макрофаги и нейтрофилы (n = 10 изображений в антитела, от 3-х различных мышей в каждой группе) их разной маркировки и сосчитать их. Экспресс данные в виде числа подсчитанных клеток.

6. Cell вазодилатации после irf5 ингибирования

  1. Обезболить C57BL / 6J управления и TSK / + мышей с и без пептида обработкой кетамина (80 - 100 мг / кг) / ксилазином (10 - 12,5 мг / кг) смеси. Вводят кетамин / ксилазин смесь внутрибрюшинно. Сдерживайте мышь вручную.
    1. Используйте 25 калибра или меньшую иглу. Вставьте иглу в нижнем правом квадранте живота. Извлеките поршень перед инъекцией, чтобы убедиться, что игла не входит в кровеносный сосуд или кишечника.
  2. После того, как достаточный уровень анестезии достигнут, закрепите мышь в положении лежа на спине, протрите мех с алкоголем пропитанной марлевым тампоном, и с помощью пары ножниц открыть грудной полости и удалить сердце.
    Примечание: Обескровливание будет усыпить мышь и сделать рассечение проще, путем снятия давления в сосудистой системе, таким образом сводя к минимуму кровотечение при резке кровеносных сосудов.
    1. Откройте USIN кожига ножницы, резать с боковой грудной клетки к челюстной кости с осторожностью, чтобы не мешать прилежащие ткани по направлению к передней части челюсти.
    2. Рассеките лицевой нерв артерии путем удаления мягких тканей вокруг него.
    3. Внимание: Не повредить судно или буксира на лицевой нерв артерии, сохраняя при этом обнаженную ткань , залитое в буфере MOPS (2,0 мМ CaCl 2 · 2H 2 O, 0,02 мМ ЭДТА, 5,0 мМ глюкозы, 4,7 мМ KCl, 1,17 мМ MgSO 4 · 7H 2 O, 3,0 мМ MOPS, 145 мМ NaCl, 1,2 мМ NaH 2 PO 4 · H 2 O, 2,0 мМ пировиноградной кислоты) , чтобы предотвратить высыхание. Выполнение под бинокулярным стерео трансфокатора рассекает микроскопом (увеличение в 3,5 раза до 45X) и источником света волоконно-оптического.
  3. Изолировать артерии лицевой нерв.
    1. Возьмитесь за лицевой нерв проксимально по отношению к первой развилке и дистальнее, где артерии будут сокращены. Обрежьте артерии от материнской артерии, наружной сонной артерии. Снимите лицевой нерв arteries от контрольных мышей, ТСК / + мышей с и без лечения IRF5D.
    2. В то время как все еще держа артерии в щипцами, вырезать две ветви сход лицевой нерв, что позволяет судну осторожно приподнял пока ни режиссерский окружающие ткани могут быть идентифицированы и разорваны.
    3. Продолжайте таким образом, пока раздвоение не будет достигнута резки обе дочерние артерии, чтобы освободить судно. Там нет необходимости зажимать сосуды перед вырезанием из-за давления в освобожденного сосудистую систему от удаления сердца. Поместите сосуд в буфере MOPS в то время как другой лицевой нерв артерии рассечена и изолированы.
    4. Иглу сосуды, связывая их на стеклянные пипетки с терминальным диаметром 125 - 175 мкм. Поджать стеклянные пипетки и буферные резервуары с буфером MOPS.
      Предупреждение: предотвращает образование воздушных пузырей от формирования в пипеток.
    5. Свяжите сосуды на пипеток с помощью офтальмологических наложения швов.
  4. Установите камер судна, на перевернутой triocular MICRoscope с приложением видеокамеры. Запуск видео с помощью системы измерения видео штангенциркулем для измерений на экране судов. 20
    1. Создайте давление их в двухстадийном процессе. Во-первых, с МОПС заполненных резервуаров на высоте выше сосуда, равным давлению 20 мм рт.ст., вручную открыть запорный кран клапаны в коллекторе линий судна. Осмотр судна на наличие признаков утечки вокруг связей и вниз по длине сосуда. Во-вторых, поднять резервуары до 60 мм ртутного столба и reinspect судна.
    2. После того, как давление на 60 мм рт.ст., позволяют сосуды для уравновешивания в течение 30 мин.
  5. Для оценки вазодилатации в ответ на ацетилхолин (10 -7 до 10 -4 м), preconstrict сосуд диаметром 50 - 75% от его максимального диаметра с использованием 1 - 3,0 х 10 -8 до 10 -7 м U46619. После выдерживания емкость для стабилизации в течение 6 мин, добавляют ацетилхолина в ванну в течение 2 мин шагов продолжительности, так чтоКонечные концентрации в ванне, 10 -7, 10 -6, 10 -5, 10 -4. Мера вазодилатацию во всех трех группах.

7. Выделение сердечной внеклеточной матрицы

  1. Обезболить C57BL / 6J управления и TSK / + мышей с и без пептида лечения с изофлуран (5%), а также выполнять шейки дислокации. Акцизный сердца от разрезав грудь вдоль грудины. Поднимите сердце с пинцетом и удалить сердце.
  2. Положите удаленные сердца в химический стакан и добавляют 15 мл гипертонического 1% додецилсульфата натрия (SDS). Перемешивайте сердца в 1% растворе SDS в течение 18 ч при комнатной температуре, чтобы разрушить клетки, добавив мешалку до 1% раствора SDS и ввод мензурку на мешалке.
    Внимание: Имейте в виду, что внеклеточный матрикс распадется, если не слишком долго, в гипертоническом растворе. И наоборот, если сердца не перемешивается достаточно долго, в гипертоническом растворе, то клетки не будут должным образомраствориться и будет остатки клеток осталось в стакане.
  3. Промыть в течение 30 мин в 15 мл 0,5% Тритон Х-100. Затем промыть водой в течение 15 мин с 15 мл PBS. Decellularize каждое сердце в индивидуальном порядке.
  4. Оснастка замораживать внеклеточный матрикс в жидком азоте и powderize замороженный сердца внеклеточного матрикса с предварительно охлажденный ступки и пестика.
  5. Сделать суспензии пылевидного матрицы в PBS, содержащем 1% антибиотика. Объем добавлен в большинстве случаев составляет 300 мкл. Разрушать ультразвуком суспензии в течение 30 - 60 секунд на льду на высоких настройках.
    Примечание: Очень важно, что образец сохраняет холод. Имейте в виду, что подвеска очень вязкое из-за высоким содержанием белка гликановой содержания.
  6. Определение концентрации белка с использованием анализа Брэдфорда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что есть анти-биотических и противогрибковым в суспензии. Пенициллин / стрептомицин являются наиболее широко используемым и рекомендуется.

8. Оценка ядерной транслокации по Immunohistochemistгу

  1. Для покрытия посуды и горками используют конечной концентрации 20 мкг / мл сердечной внеклеточного матрикса в PBS. Пипеткой 500 мкл сердечной внеклеточного матрикса раствора в 100 мм чашку для покрытия и 150 мкл окончательного внеклеточного раствора матрицы на слайд.
  2. Inhibit irf5 путем добавления IRF5D в концентрации 50 мкг / мл в течение 24 ч к крысиным неонатальных кардиомиоцитов в культуре. Оставьте управление миоцитов культуры необработанной.
  3. Оценка оборота irf5 из цитоплазмы в ядро ​​с помощью иммунофлуоресценции и анализа с помощью конфокальной микроскопии. Определить зеленую маркировку для irf5, определить синий DAPI пятно для ядра
  4. Применить первичный анти-irf5 антитела. Первичные антитела использовали в разведении 1: 200 в PBS. Инкубируйте слайды в течение 30 мин при 37 ° С, а затем с тремя 5-минутных промывок. Вторичное антитело было Alexa 488-меченых козьего антитела против мышиного антитела IgG.
  5. Разведите вторичные антитела 1: 1000-дилюция в PBS. Выдержите вторичное антитело в течение 30 мин при 37 ° С. Обеспечение ядерной пятно с DAPI. Развести DAPI 1: 1000 в PBS. Вымойте слайды в общей сложности 3 раза в течение 5 мин и добавить DAPI к третьей и последней стадии промывки.
  6. Незаконный оборот Захват с помощью конфокальной микроскопии и интенсивности флуоресценции мера в ядрах и цитозоль , как описано выше 10. Определить зеленую маркировку для irf5, определить синий DAPI пятно для ядра. Клетки, которые демонстрируют синие ядра с зеленой маркировкой в ​​них содержат активированный irf5, который вывозили из цитоплазмы в ядро. Когда irf5 не активируется зеленая маркировка находится в цитозоле.
  7. Проанализировать флуоресцентно меченых клеток с помощью конфокальной микроскопии с использованием объектива 40X масла. Использование длины волны возбуждения 488 нм и длине волны излучения более 530 нм для irf5. Использование длины волны возбуждения 360 нм и длине волны излучения 460 нм для визуализации DAPI.

9. Статистика

  1. Выполнить анализ дисперсии (ANOVA) для повторных измерений внутри, так и между группами. Следуйте ANOVA с модификацией Бонферрони Студентов Т-тест. Экспресс данные как стандартная ошибка среднего значения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты исследования показали на рисунке 1 показано , как разработать пептид. На рисунке 1, верхняя левая, показана область (между 2 - желтыми стрелками, аминокислоты (аа) 425-436) в irf5 , который фосфорилирует с рядом киназ. На рисунке 1, верхняя правая, показывает желтый овал , где фосфорилированный домен irf5 в связывающийся. Димерная структура 3DSH поворачивался наблюдать скола или долина слева от Спирали 2 (aa303-312). Это где ф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель состояла в том, чтобы разработать ингибитор irf5 для выяснения роли irf5 на воспаление, фиброз и сосудистой функции в сердцах TSK / + мышей. Полученные данные, что IRF5D не индуцируют пролиферацию или апоптоз. Кроме того, воспаление уменьшается и сосудистой функции улучшились. Эти данные свидетельствуют о том, что irf5 играет важную роль механистической в ​​развитии воспаления и фиброза в сердце TSK / + мышей и что она имеет потенциал, чтобы служить в качестве терапевтической мишени.

Пе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) и HL-102836 (KAP) и Cimphoni Life Sciences (часть зарплаты DW). Авторы благодарят Меган Ситсма за редактирование рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
  Triton X 100Sigma AldrichX100 - 100 мл
Alexa 488-меченый козий антимышиный антитело IgG Термо ФишерA11001
Бардфорд реактивТермо Фишер23200Пирс 
БиосенсорыForte-BioMR18-0009
CD64 (H-250)Santa Cruz Biotechnologiessc-15364
CellEvent Caspase-3/7 SubstrateThermo Fisher/Life TechnologiesC10427
CellTiter AQueous One Solution Набор для анализа пролиферации клетокPromegaG3580Promega
DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол)Thermo FisherD-13061:1,000 разведение в PBS
donkey anti rat Alexa 488Thermo FisherA-212081:1,000 разведение в PBS
ECL plusGE healthcare/AmershamRPN2133После долгих проб и ошибок мы вернулись к этому
одному микроскопу Eclipse TE 200-U с программным обеспечением для лазерного сканирования EZ C1Nikon
goat anti rabbit Alexa 488Thermo FisherA-11008Разведение 1:1,000 в PBS
HRP  анти-козыSanta Cruz Biotechnologiessc-516086!:10,000 разведение в TBS
HRP ослик против мышейSanta Cruz Biotechnologiessc-2315:10,000 разведение в
антителе TBS ICAM-1Santa Cruz Biotechnologiessc-15111:200 в
антителе PBS IRF5 (H56)Santa Cruz Biotechnologiessc-98651
Микропланшетный ридер Elx800Biotek
NIMP нейтрофильный маркерSanta CruzBiotechnologies sc-1338211:200 разведение в PBS
Octet RED Forteбиобелок-белок-связывающий
пептидный дизайн  Программное обеспечение Medit SARCSB.org
синтез рекомбинантного белка IRF5экспрессия белка TopGene Technologiesэкспрессия белка, услуги синтеза
додецилфосфат натрияSigma Aldrich436143моющее средство
КетаминАптекаСписок III контролируемое вещество, требуется предварительное применение 
XylazineMedVet
3.5X-45X Тринокулярный препарирующий зум Стереомикроскоп со светодиодными лампами на гусиной шееAm ScopeАртикул: SM-1TSX-L6W
Zeba Обессоливающие колонныThermofisher2161515
эндотелиальные базальные среды EBM Bullet kitLonzaCC-3124набор содержит добавки
для роста VIA-100K  Boeckeler Instruments
4 - 15% гель TGXBio-Rad5671081
программное обеспечение MedSuMo Medit, Palaiseau, France
Laemmli BufferBioRad
1

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).
  2. Dideberg, V., et al. An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases. Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).
  3. Graham, R. R., et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).
  4. Krausgruber, T., et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).
  5. Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).
  6. Mayes, M. D., et al. Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis. Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).
  7. Dimitroulas, T., et al. Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease. Curr Pharm Des. , (2013).
  8. Botstein, G. R., LeRoy, E. C. Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches. Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).
  9. Oram, S., Stokes, W. The heart in scleroderma. Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).
  10. Xu, H., et al. 4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice. PLoS One. 7 (12), 52046(2012).
  11. Steen, V. The heart in systemic sclerosis. Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).
  12. Deshpande, N., et al. The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema. Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).
  13. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
  14. Matthew, A. Current biosensor technologies in drug discovery. Drug Discovery. , 69(2006).
  15. Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. A review of MED-SuMo applications. Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).
  16. Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).
  17. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry. PloS one. 9 (9), 106882(2014).
  18. Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  20. Bauer, P. M., et al. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase. J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).
  21. Weihrauch, D., et al. An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice. PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).
  22. Hoogenboom, H. R., et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).
  23. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  24. Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 8 (1), 1(2015).
  25. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  26. Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
  27. Weihrauch, D., et al. Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).
  28. Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. Mavragani, C. , 35(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

IRF5

Похожие статьи