Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выведение лептоменинкс эксплантата культур от посмертных доноров человеческого мозга

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55045

⸱

21 января 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Parkinson’s Institute and Clinical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Протокол культуры от эксплантов мягкая и паутинная оболочки мозга человеческого мозга посмертных является технически надежный и простой способ получения фибронектин-позитивных менингеальных фибробласты в течение 6-8 недель и криоконсервируют около 20-30 миллионов клеток.

Аннотация

Несмотря на то, значительный прогресс был достигнут в клинической характеристике болезни Паркинсона, некоторые исследования показывают, что диагноз болезни Паркинсона не патологически подтверждено в до 25% от болезни клинически диагностированных Паркинсона. Таким образом, ткань собрана из клинически диагностированных пациентов с идиопатической болезнью Паркинсона может иметь высокий уровень ошибочному диагнозу; следовательно , в пробирке исследования из таких тканей для изучения болезни Паркинсона как доклинические модель может стать бесполезной.

Собрав посмертных человека лептоменинкс с подтвержденным нейропатологического диагнозом болезни Паркинсона и характеризуется нигростриатной потерей клеток и внутриклеточных белковых включений называемые тельца Леви, можно быть уверенным , что клинически наблюдается паркинсонизм не вызывается другим основным процессом заболевания (например , опухоли, атеросклероз).

Этот протокол PresenТ.С. Вскрытие и подготовка посмертных человеческих лептоменинкс для дифференцирования менингеальной культуры фибробластов. Эта процедура является надежной и имеет высокий уровень успеха. Проблема культуры является стерильность, как заготовка головного мозга, как правило, не выполняется в стерильных условиях. Поэтому, важно, чтобы дополнить культуральные среды с коктейлем пенициллин, стрептомицин и амфотерицин В.

Вывод менингеальных фибробластов из случаев аутопсии подтвержденных с болезнью Паркинсона, обеспечивает основу для моделирования в пробирке болезни Паркинсона. Менингеальные фибробласты появляются 3-9 дней после подготовки образца и около 20-30 миллионов клеток могут быть криоконсервации через 6-8 недель. Менингеальная культура фибробластов является однородным и клетки экспрессируют фибронектин, обычно используемый маркер для идентификации мозговых оболочек.

Введение

Мозговые оболочки состоят из трех оболочек, которые защищают мозг: твердой мозговой оболочки, паутинной и мягкой мозговой оболочки. Совсем недавно было признано , что Оболочек также играют важную роль в развитии мозга и мозговой гомеостаз 1. Оболочках получены из мезенхимальных и нервного гребня полученных клеток и , что интересно, было показано , что клетки - предшественники , проживающих в оболочках могут привести к нейронов в пробирке и после трансплантации в естественных условиях 2, 3, 4. Оболочках культур были также с успехом использованы в качестве фидерных слоев, так как они обладают полученной из культур клеток , индуцирующих активность стромы для дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в дофаминергические нейроны 5. Кроме того, есть мягкая и паутинная оболочки мозга потенциал непосредственно дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты при ишемии 6.

Для этого протокола, образцы посмертных Оболочек человека собирают из паутинной и мягкой мозговой оболочки, совместно именуемые лептоменинкс и закупаются в рамках донорства головного мозга человека в исследовательских целях. Препарирование мозга осуществляется в течение 24 ч после смерти и образец помещается мягкая и паутинная оболочки мозга в холодной питательной среды для дальнейшей обработки в течение ближайших 6-8 часов, как показано здесь, в этом протоколе.

Этот протокол описывает Вскрытие и подготовка человеческих образцов мозговые оболочки для развития пациента первичных лептоменинкс культуре клеток. Ткань разрезали на 25-30 кусков приблизительно 3 мм х 3 мм квадратов. Три фигуры помещены в каждом 6-луночные покрытый желатином хорошо и удерживается с круглыми покровные стекла. Оболочек рассечение занимает около 25-35 мин. Основной задачей этой культуры является стерильность как мозг закупок, транспорта и рассечения, как правило, не производится в стерильных условиях. Therefore, важно, чтобы дополнить культуральные среды с коктейлем пенициллина, стрептомицина, и амфотерицином В и использовать мульти-луночных планшетах для культуры отдельно Куски ткани.

Вырост менингеальных фибробластов происходит обычно в течение первой недели. Медиа меняется каждые два-три дня, пока клетки не сливающийся и клетки ферментативно пассировать. Менингеальной фибробласты замораживают в 1 миллион клеток на мл / флакон в криоконсервации средах. С помощью этого протокола, 20-30 миллионов менингеальные фибробласты могут быть получены в течение 6-8 недель для криоконсервации. Downstream применения этих менингеальных фибробластов являются первичные культуры для исследования болезней, прямой дифференцировки нейронов или выводе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из лептоменинкс для понимания механизмов развития заболеваний, а также для разработки лекарственных средств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Регистрации пожертвование мозга включает в себя документацию по регистранта о своем намерении пожертвовать. Разрешение аутопсии для извлечения тканей обеспечивается ближайших родственников, как это разрешено законом. Научные исследования с использованием собранных образцов аутопсии рассматриваются этическими комитетами (IRB), чтобы обеспечить соответствие данных медицинского страхования и Закон об ответственности (HIPAA) правил.

Примечание: лептоменинкс образцы собирают диссекторе мозга или невропатолога во время рассечения мозга и хранятся в 50 мл конические пробирки, содержащие 25-30 мл Оболочек питательной среды. Образец хранят при температуре 4 ° С до подготовки образца. Обработка должна быть выполнена как можно быстрее, как жизнеспособность клеток уменьшается с течением времени вскрытии.

1. Set-перед Запуск лептоменинкс Разбор

Примечание: Шаги 1.1 - 1.3 должны быть выполнены в шкафу биологической безопасности.

  1. Подготовка оболочках в культуральную среду путем объединения 375 мл Дульбекко Modified Eagle Media, 100 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 5 мл 10 мМ заменимых аминокислот, 5 мл 200 мМ L-аланил-L-глутамина, 5 мл 100 мМ пирувата натрия, 5 мл 10000 ед / мл пенициллина / стрептомицина и 5 мл 250 мкг / мл амфотерицина в в 500 мл блока фильтров. Фильтр и перемешать. Использование средств массовой информации на срок до четырех недель.
  2. Поместите все материалы в шкафу биологической безопасности перед началом рассечение: 4x чашки Петри, 2x 6-луночные планшеты, 2x скальпели, 15-20 стерилизованные 15-мм покровные стекла, фосфатный буфер солевой раствор (PBS), серологические пипетки, аспирационных пипеток.
  3. Добавить 1 мл стерилизованного в автоклаве 0,1% раствора желатина в каждую лунку 6-луночного планшета. Установите пластину в сторону в течение 30-60 мин. Подготовьте 2x 6-луночные планшеты.

2. Подготовка образца лептоменинкс

Примечание: Шаги 2.1 - 2.3 должны быть выполнены в шкафу биологической безопасности.

  1. Добавьте примерно 10 мл PBS сстерильный 10 см блюдо культуры ткани и поместите Оболочек образец в блюдо. С помощью щипцов, аккуратно мыть лептоменинкс с PBS, чтобы удалить кровь.
  2. Перенесите мозговые оболочки в новый 10-см блюдо культуры ткани, содержащей 10 мл свежей PBS и продолжайте промывку. Повторите по мере необходимости, чтобы удалить как можно больше крови, насколько это возможно.
  3. С помощью двух скальпели, разрезать ткани в мягкая и паутинная оболочки мозга приблизительно 6 см х 6 см большой кусок.
  4. Поместите крышку на блюдо культуры и передачи рассекает микроскопа в горизонтальной ламинарный.

3. Вскрытие лептоменинкс ткани

Примечание: Шаги 3.1 - 3.3 должны быть выполнены в горизонтальном колпаке с ламинарным потоком с использованием рассекает микроскопом.

  1. Удалить кровеносные сосуды из области на кусок лептоменинкс (шаг 2.3), достаточно большой, чтобы создать по меньшей мере, 20-25 3 мм х 3 мм штук. Держите лептоменинкс на месте с одним скальпелем и с другой стороны, использовать мягкий и неглубокую выскабливание моции, чтобы отделить сосуды.
  2. Вырежьте небольшие квадраты ткани из подготовленной области. Вырезать в ступенчатом процессе, сначала делая большие куски, а затем нарезая те на более мелкие части.
  3. Используйте один скальпель для удержания ткани на месте, а другой скальпель, чтобы разрезать ткань с качке. Благодаря консистенции ткани, трудно сдвинуть скальпели друг против друга. Это будет только разорвать ткань на части и приводит к рваных краев.
  4. Продолжить резки куски пополам, пока не около 20-25 3 мм х 3 мм шт.

4. Передача расчлененный на мозговые оболочки Кусочки планшетах культуры

Примечание: Шаг 4 должна быть выполнена внутри шкафа биологической безопасности.

  1. Отберите желатин из 6-луночного планшета (с шага 1.3). Добавить 1 мл Оболочек питательной среды в каждую лунку. Использование стерильного пинцета, поместить 3-4 биопсии штук в каждую лунку.

5. Размещение покровных стеклах над Мeninges Pieces

Примечание: Шаги 5.1 - 5.2 должны быть выполнены в горизонтальном колпаке с ламинарным потоком с использованием рассекает микроскопом.

  1. Накройте куски с 1-2 стерильные 15-мм круглыми покровные на лунку.
  2. Сильно надавите с щипцами, чтобы обеспечить куски прикасаясь к нижней части пластины. Это дает возможность присоединить кусочков ткани на дно колодца.
  3. Поместите 6-луночного планшета в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.

Техническое обслуживание Культура 6. Cell

Примечание: Шаги 6.1 - 6.3 должны быть выполнены в шкафу биологической безопасности. Ручка культуры блюда с осторожностью, так как покровные не должны двигаться и смещать мозговые оболочки штук.

  1. После 2-х дней в культуре, добавьте еще 1 мл свежей среды для выращивания оболочках в каждую лунку.
  2. На 7-й день, тщательно аспирата СМИ и добавляют 2 мл свежей среды в каждую лунку.
  3. После того, как 9-й день, продолжают изменяться роста среды каждыедругой день до культуры становится вырожденная.

7. Пассирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны быть выполнены в шкафу биологической безопасности. После того, как менингеальные фибробласты мигрируют из кусочков ткани менингеальных и начинают расти к краям сосуда для культивирования, расширение менингеальных фибробласты в более крупные чашки для культивирования.

  1. Перед началом пассажей, пальто культуры блюдо с 1% желатина в течение 15-30 мин.
  2. Аспирируйте средств массовой информации из 6-луночного блюдо и мыть клетки с 2 мл PBS.
  3. Добавить 1 мл трипсина / EDTA в каждую лунку и инкубировали при 37 ° С в течение 5-10 мин. Не нужно, чтобы снять крышку слипы или менингеальной ткани для этого шага.
  4. Когда клетки округлены и начинают отделяться, добавляют 2 мл культуральной среды.
  5. Пипетировать клетки вверх и вниз, чтобы полностью разрушить все комки и передать решение клеток в большей культуре блюдо.
  6. Используйте отношение 1: 3 до 1: 4, чтобы объединить клетки из трех 6-луночных планшетах вк одному T75 блюдо культуры.
  7. После того, как менингеальные фибробласты клетки сливающийся в культуральных флаконах Т75, Trypsinize клетки, и криоконсервируют в криоконсервации средах при 1x10 6 клеток / мл в пузырек. Одна T75 культуры колбу с сливающихся менингеальных фибробластов содержит около 5-7 миллионов клеток.

8. Характеристика менингеальной фибробластами иммунным окрашиванием

Примечание: Перед началом процедуры, подготовить 4% раствора параформальдегида 5% нормальной козьей сыворотки в PBS (блокирующем буфере), 0,3% Тритон Х-100 в PBS (пермеабилизации буфер), растворы первичных и вторичных антител, и 1 мкг / мл Hoechst 33342 разводили в PBS с 10 мг / мл стоковый.

  1. Семя 15000 до 30000 менингеальные фибробласты в 8-луночного камеры слайде покрыты 0,1% желатина.
  2. Через 24 ч, когда прикрепляются клетки, фиксируют клетки в 100 мкл 4% параформальдегида на лунку в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть лунки 3 раза 1x PBS.
  3. Клетки проницаемыми с 150 мкл 0,3% Тритона Х-100 в течение 5 мин при комнатной температуре. Промыть лунки 3 раза 1x PBS.
  4. Добавить 200 мкл блокирующего раствора (PBS + 5% нормальной козьей сывороткой) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Аспирируйте блокирующий раствор и добавляют 150 мкл желательных первичных антител разводят в блокирующем растворе. Для получения двойного окрашивания, подготовка рабочих разведений первичных антител в отдельных центрифужные пробирки на лед следующим образом:
    1. Приготовьте 1: 300 разбавление анти-фибронектин + 1: 200 разбавление анти-нестину в блокирующем растворе. Приготовьте 1: 250 разведение анти-SERPINH1 + 1: 1000 разведение анти-TUJ1 в блокирующем растворе. Приготовьте 1: 250 разбавлением анти-SERPINH1 + 1: 100 разведение анти-SOX2 в блокирующем растворе
  6. Инкубируйте при 4 ° С в течение ночи.
  7. Промыть лунки 3 раза 1x PBS.
  8. Подготовка рабочего 1: 400 разбавление флуоресцентно меченных вторичных антител козы к антителам кролика (зеленый; Ex / Em 2 495/519 нм) и козьего антитела против мышиных (красный; Ex / Эм 2 590/617 нм) в блокирующем растворе и 100 мкл в каждую лунку. Инкубировать в течение 1 ч, в темноте, при комнатной температуре. Затем промыть лунки один раз с 1x PBS.
  9. Добавить 100 мкл 1 мкг / мл Hoechst 33342 (синий, Ex / Em 2 358/461 нм) раствора в каждую лунку и инкубировать в темноте в течение 3 мин. Промыть лунки 3 раза 1x PBS, в результате чего в последней промывки 1x PBS в скважине, и покрывают слайд с алюминиевой фольгой.
  10. Анализ клетки под флуоресцентным микроскопом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Когда протокол обработки мягкая и паутинная оболочки мозга был успешным, нарост менингеальных фибробласты сначала наблюдается от трех до девяти дней после того, как рассечение, хотя это может зависеть от длины интервала посмертном для мозга. Рисунок 1 демонстрирует менингеальные фибробласты культуры четырех различных доноров. На фиг.1А показана часть лептоменинкс , нажатых на покровным стеклом (темная диагональная линия) и фибробласты вырост вокруг ткани...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает простой и надежный протокол для получения оценки менингеальное культуры фибробластов из лептоменинкс посмертных человека, собранных в сочетании с пожертвованием мозга. Есть очень мало описания протоколов для получения клеточных культур из посмертного человеческого материала. Два исследования описывают кожи полученных культур фибробластов 7, 8, 9, одно исследование описывает Твердая мозговая проб

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Разработка этого протокола финансировалась за счет частных пожертвований, направленных на программу донорства мозга Института Паркинсона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашки Корнинга ПетриFisher Scientific351029
Nunc 6-луночная пластинаFisher Scientific14-832-11
15-мм защитные накладкиFisher Scientific12-545-83 15CIR-1D
Скальпели, стерильное лезвие, No 15Miltex4-415
Изогнутые прецизионные щипцыFisher Scientific16-100-122
Серологические пипеткиFisher Scientific13-678-11E
Пипетки ПастераFisher Scientific22-230490
ЖелатинSigmaG1890-100G
Фосфатный буфер Физиологический растворFisher ScientificSH30264.02
Corning 500 мл фильтрующий блокFisher Scientific430770Комбинированный компонент среды и фильтр.
Колбы, обработанные клеточными культурами Nunc, с фильтрующими крышками, T175 см<суп>2 Thermo Scientific178883
Название>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Growth Media
Hyclone DMEMFisher ScientificSH30081.02
Hyclone FBSFisher ScientificSH30910.03
MEM Раствор заменимых аминокислот (100x)Thermo Fisher11140-050
Добавка GlutaMAX (100x)Thermo Fisher35050-061
пируват натрия (100 мМ)Thermo Fisher11360-070
Пенициллин-стрептомицин (10,000 Ед/мл)Thermo Fisher15140-122
Амфотерицин B (желтый раствор/250 &; g/mL)Fisher ScientificBP264520
Bambanker Freeze 120 млFisher ScientificNC9582225
Название<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Fibronectin Staining
Горки с 8-скважинной камерой Научный1256518
Фишера 20% параформальдегида Электронная микроскопия наук15713
Triton X-100 SigmaT8787
100% глицерин BioRad9455
100% нормальная козья сыворотка Fisher Scientific101098-382
Антитело к фибронектину [F1]Abcamab324191:300 разведение в блокирующем растворе
Anti-SERPINH1SigmaS5950-200UL1:250 разведение в блокирующем растворе
Anti-SOX2MilliporeMAB43431:100 разведение в блокирующем растворе
Anti-NestinMilliporeMAB53261:200 разведение в блокирующем растворе
Anti-TUJ1CovanceMMS-435P1:1,000 разведение в блокирующем растворе
Alexa Fluor 488 anti-rabbitThermo FisherA110291:400 разведение в блокирующем растворе; (зеленый канал; Ex/Em2 495/519 нм) 
Alexa Fluor 555 антимышиныйThermo FisherA21424разведение 1:400 в блокирующем растворе; (красный канал; Ex/Em2 590/617 нм) 
Hoechst 33342 морилкаThermo FisherH3570разбавить до конечной концентрации 1,0 мкм; г/мл; (синий канал; Ex/Em2 358/461 nm)
Поставщики - это предложения, также можно использовать аналогичные продукты от альтернативных поставщиков.

Ссылки

  1. Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
  2. Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
  3. Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383(2015).
  4. Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
  5. Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
  6. Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
  7. Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
  8. Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
  9. Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
  10. Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282(2012).
  11. Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4(2014).
  12. Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
  13. Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
  14. Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
  15. Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
  16. Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779(2013).
  17. Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159(2011).
  18. Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
  19. Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выведение лептоменинкс эксплантата культур от посмертных доноров человеческого мозга
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.