Методическая статья

Выращивание Caenorhabditis Элеганс В трех измерениях в лаборатории

DOI:

10.3791/55048

⸱

12 декабря 2016 г.

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем простой метод для построения 3D-систем культивирования нематод под названием NGT-3D и NGB-3D. Они могут быть использованы для изучения нематод пригодности и поведения в местах обитания, которые более похожи на натуральные Caenorhabditis Элеганс места обитания , чем стандартные 2D - лаборатория C. Элеганс культуры пластин.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование генетических модельных организмов, таких как Caenorhabditis elegans, привело к плодотворным открытиям в биологии за последние пять десятилетий. Большая часть того, что мы знаем о C. elegans, ограничена лабораторным выращиванием нематод, которые могут не обязательно отражать среду, в которой они обычно обитают в природе. Выращивание C. elegans в 3D-среде обитания, которая больше похожа на 3D-матрицу, с которой черви сталкиваются в гнилых фруктах и растительном компосте в природе, может выявить новые фенотипы и поведение, не наблюдаемые в 2D. Кроме того, эксперименты в 3D могут показать, насколько фенотипы, которые мы наблюдаем в 2D, актуальны для червя в природе. Здесь представлен новый метод, с помощью которого C. elegans нормально растет и размножается в трех измерениях. Выращивание C. elegans в Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) может позволить нам измерить репродуктивную пригодность штаммов C. elegans или различные условия в 3D-среде. Мы также представляем новый метод, получивший название Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), для культивирования C. elegans в 3D для микроскопического анализа. Эти методы позволяют ученым изучать биологию C. elegans в условиях, которые в большей степени отражают окружающую среду, с которой они сталкиваются в природе. Это может помочь нам понять лежащую в основе эволюционную значимость физиологии и поведения C. elegans, которые мы наблюдаем в лаборатории.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение нематоды Caenorhabditis elegans в лаборатории привело к плодотворным открытиям в области биологии за последние пять десятилетий1. C. elegans был первым многоклеточным организмом, геном которого был секвенирован в 1998 году2, и он оказал неоценимое влияние на понимание вклада отдельных генов в развитие, физиологию и поведение всего организма. В настоящее время ученые стремятся глубже понять, как эти гены могут способствовать выживанию и репродуктивной пригодности организмов в их естественной среде, задавая вопросы об экологии и эволюции на генетическомуровне.

C. elegans снова может предоставить отличную систему для ответа на эти вопросы. Тем не менее, мало что известно о биологии C. elegans в естественных местах обитания нематод, и в настоящее время не существует методов моделирования контролируемых естественных условий обитания C. elegans в лаборатории. В лабораторных условиях C. elegans культивируется на поверхности агаровых пластин, засеянных бактериями E. coli 6. В природе, однако, C. elegans и родственные ему нематоды редко населяют почвы по всему земному шару, но они особенно хорошо процветают в гниющих плодах и растительных веществах7,8. Эти трехмерные (3D) сложные среды сильно отличаются от простых 2D-сред, с которыми черви сталкиваются в лаборатории.

Чтобы начать отвечать на вопросы о биологии нематод в более естественной 3D-обстановке, мы разработали 3D-среду обитания для лабораторного выращивания нематод, которую мы назвали Nematode Growth Tube 3D или NGT-3D для краткости9. Цель состояла в том, чтобы разработать 3D-систему роста, которая позволяет обеспечить рост, развитие и плодородие, сопоставимые со стандартными 2D-нематодами (NGM)10. Эта система поддерживает рост бактерий и нематод на протяжении всего их жизненного цикла в 3D, позволяет червям свободно двигаться и вести себя в трех измерениях, а также проста и недорога в производстве и использовании.

В текущем исследовании мы предлагаем пошаговый метод производства NGT-3D и оценки развития и фертильности червей. В дополнение к оценке приспособленности червей в 3D, мы стремились изобразить, снять на видео и оценить поведение и физиологию червей в 3D-выращивании. Таким образом, в дополнение к NGT-3D, мы представляем здесь альтернативный метод, называемый Nematode Growth Bottle 3D или NGB-3D, для микроскопической визуализации C. elegans во время 3D-культивирования. Это будет особенно важно для изучения известных моделей поведения, идентифицированных в 2D, и выявления новых моделей поведения, уникальных для 3D-культивирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка решения для NGT-3D и NGB-3D

  1. Подготовьте следующие стерильные растворы: 1 л раствора 0,1454 М NaCl, 1 л 1 М CaCl 2, 1 л 1 М MgSO 4, лизогении Бульон (LB), 1 л 1 М KPO 4 буфера (108,3 г KH 2 PO 4 и 35,6 г K 2 HPO 4, и заполняют H 2 O до 1 л). Производство NGM с помощью этих решений можно найти в предыдущем протоколе 10.
  2. Автоклавы растворы при температуре 121 ° С, 15 мин.
  3. Приготовьте 50 мл стерильного 5 мг / мл раствора холестерина. В коническую пробирку емкостью 50 мл, смешивают 0,25 г холестерина и 50 мл 99,99% этанола и хорошо перемешать. Не автоклав. Стерилизацию раствора холестерина с использованием 50 мл шприц с шприцевой фильтр 0,45 мкм. Это также приведет к удалению любого нерастворенного холестерина.
  4. (Необязательно) Подготовьте 10 мл 150 мМ 2'-дезокси-5-фторуридиновые (FudR) акций. В конической трубе 15 мл, смешать 0.3693 гФУДР и 10 мл дистиллированной воды. Встряхнуть хорошо.

2. Подготовка культуре бактерий для NGT-3D и NGB-3D

  1. Привить 10 мл LB бульона с бактериями. Стандартные бактерии , используемые для кормления C. Элеганс является штамм E.coli OP50.
  2. Культура бактериальная инокуляция при 37 ° C в инкубаторном шейкере в течение ночи.
  3. При подготовке к последовательным разбавлением, аликвотные 9 мл раствора NaCl в стерильные 15 мл конические пробирки. Например, аликвоту 9 мл в общей сложности 7 трубок , чтобы сделать 10 -7 разведения штамма OP50 E.coli.
  4. С помощью стерильной 1000 мкл пипетку, пипеткой 1 мл бактериальной культуры или разбавленный бактериальной культуры в стерильную новую пробирку с 9 мл раствора NaCl и вихревые смесь по 10 мл хорошо. Повторите, пока желаемый бактериальный разбавление не будет достигнута.
    Примечание: Заданная бактериальной разбавление зависит от типа и состояния бактерий, а также точных условий эксперимента.Например, 10 -6 - 10 -8 разбавление штамма OP50 кишечной палочки было достаточным для получения от 1 - 200 бактериальных колоний на 6,5 мл НЗТ-3D трубки. Черви надежно разработаны и воспроизводится нормально , если количество колоний было старше 60 лет , которые произошли в разведении 10 -6 - 10 -7. Для NGB-3D, используйте разбавление 10 -8.

3. Создание NGT-3D и NGB-3D (200 мл)

  1. После приготовления бактериальной культуры, смесь 0,6 г NaCl, 1 г гранулированного агара и 0,5 г пептона в 500 мл колбе. Вставьте магнитной мешалкой в ​​колбу.
  2. Добавить 195 мл дистиллированной воды и покрывают горлышко колбы с алюминиевой фольгой.
  3. Автоклавы 121 ° С в течение 15 мин.
  4. Горячую автоклавного колбы на мешалке, и перемешивают при умеренной скорости в течение по крайней мере 2 часов. Охлаждают колбу до 40 ° С. Обязательно остыла как продолжение здесь при высоких температурах может привести к помутнению готового агара.Тем не менее, более низкие температуры могут привести к преждевременному отвердевания агар.
    1. (Необязательно) Чтобы ускорить процесс охлаждения, колбу помещают в 40 ° С на водяной бане 15 мин перед помещением на мешалке.
  5. Когда температура агаровой среде достигает 40 ° С, добавляют 200 мкл 1 М CaCl 2, 200 мкл 5 мг / мл раствора холестерина, 200 мкл 1 М MgSO 4 и 5 мл 1 М KPO 4 буфера , как раствор продолжает перемешивать до конечной концентрации 1 мМ CaCl 2, 5 мкг / мл холестерина, 1 мМ MgSO 4, 1 мМ KPO 4.
    1. (Необязательно) Для НЗТ-3D анализа продолжительности жизни добавляют 80 мкл 150 мМ FUdR до конечной концентрации 120 мкМ 12.
  6. Добавить 6 мл 10 мл разбавленных бактериальной культуры, полученной на стадии 2.4, в колбу непосредственно.
    1. (Необязательно) Для NGT-3D, снимите 6 мл агара сред перед стадией 3.6 и держать его теплым отдельно. Этот носитель будет использоваться для бактерий, свободныхверхний слой.
  7. Использование стерильных процедур выдачи носителя в стерильной культуральной камере. Убедитесь, что крышка камеры закрывается плотно.
    1. (Необязательно) Чтобы предотвратить бактериальные колонии от формирования на верхней поверхности агара, чтобы слой без бактерий агаре с этапа 3.6.1 на верхней перед СМИ со стадии 3.7 полностью затвердевает. Это создаст зону без бактерий в верхней части NGT-3D.
    2. Для NGT-3D, залить 6,5 мл носителя в 8 мл из прозрачного пластика пробирки, чтобы сделать слой бактерий агар, и тщательно дозировать 200 мкл бактерий свободные средства массовой информации на вершине полузависимыми закаленной 3D средах, чтобы сделать тонкую bacteria- свободный слой сверху.
    3. Для NGB-3D, залить 65 мл носителя в 25 см 2 ясно пластиковой бутылки клеточной культуры. Эта сумма должна заполнить тело бутылки культуры 2 клетки 25 см.
  8. Оставьте камеры по вертикали при комнатной температуре в течение одной недели, чтобы позволить колонии бактерий растидо значительных размеров диаметром не менее 1 мм.
    1. (Необязательно) Для анализа продолжительности жизни в NGT-3D, крышка камеры с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить легкую деградацию ФУДР.

4. Мера Фитнес червячных населения на NGT-3D (Относительная Brood Размер пробирной)

  1. Выберите каскад червя L4 при помощи платиновой проволоки выбрать и передачи на бактерии свободной NGM пластины. Разрешить червь свободно передвигаться в течение нескольких минут, чтобы удалить бактерии, прикрепленные к его телу.
  2. Повторите шаг 4.1 и убедитесь, что червь свободен от бактерий. Как правило, два повторы 4.1 достаточно.
  3. Аккуратно положите чистую червяка на поверхности 3D-среды с платиновой проволоки забрать. Червяк должен в конечном итоге ввести агар в матрицу 3D агар.
  4. Закройте крышку свободно позволяет некоторое количество воздуха, чтобы попасть в трубу, но предотвращая высыхание агаре.
  5. Инкубировать в течение 96 часов при температуре 20 ° С.
  6. Через 4 дня, закройте крышки плотно и местоNGT-3D культуры камера в C водяной бане в 88 °, чтобы расплавить агар. Жара убивает червей, но их тела остаются нетронутыми.
    Примечание: Используя 8 мл пробирки для NGT-3D, 20 - 30 мин инкубации обычно достаточно.
  7. С помощью стеклянной пипетки, передавать Расплавленный носитель на 9 см пластиковую чашку Петри. Пластиковые пипетки не рекомендуется, так как черви могут часто прилипают к ним.
  8. Использование стерео передачи рассекает микроскопом, подсчитать количество червей на L3, L4 и взрослых этапах. Не рассчитывайте червей, которые являются этапом L2 и моложе, как можно спутать здесь поколений F1 и F2. Таким образом, этот анализ является относительным анализ размера выводка, а не общий анализ размера выводка.

5. Изображение и запись Worm Поведение на NGB-3D

  1. Выберите каскад червя L4 с использованием платиновой проволоки выбрать и удалить любые бактерии, попавшие на поверхность путем переноса на бактерии свободной NGM пластины и позволяет ему свободно двигаться в течение нескольких минут.
  2. Повторите шаг 5.1, чтобы убедиться, шогт свободна от бактерий.
  3. Осторожно поместите чистый червяка на центр агаровой поверхности NGB-3D вблизи горлышка бутылки с платиновой проволоки забрать. Червяк должен в конечном итоге ввести агар в матрицу 3D агар.
  4. Закройте крышку свободно позволяет некоторое количество воздуха, чтобы попасть в трубу, предотвращая высыхание агаре.
  5. Изображение или запись червя под стерео передачи рассекает микроскопом. Отрегулируйте фокус, как червь движется через 3D-матрицу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конструкция NGT-3D является простой и прямой протокол , который приводит к агаровой заполненной пробирки с небольшими бактериальных колоний , разнесенных по всей агар (Рис . 1А) Черви могут свободно перемещаться по агара матрице, находя и отнимает много бактериальных колоний. Для того, чтобы подтвердить , может ли C. Элеганс воспроизводить и нормально расти в NGT-3D, мы сравнили плодородие и развития личинок в 3D со стандартными пластинами 2D NG...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лаборатория выращивания C. Элеганс с использованием классических медиа пластин роста нематода имеет решающее значение для сотен важных открытий , что исследования в C. Элеганс предоставил. Здесь мы представляем новые методы для выращивания C. Элеганс в среде , которая более точно отражает их естественные трехмерные среды обитания. Хотя другие методы были использованы для наблюдения C. Элеганс в 3D 13, это первый протокол , который позволяет выращивать червей в твердой матри...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана новым Investigator Грант [2014R1A1A1005553] из Национального исследовательского фонда Кореи (NRF) к JIL; и Йонсей будущий лидер Вызова Грант [2015-22-0133] для JIL

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
LB бульон, Miller (Luria-Bertani)Difco224620
Sodium chlorideDAEJUNG7548-440058,44 МВт
агар, гранулированныйDifco214530
PeptoneBacto211677
Кальция хлорид, дигидратBio BasicCD00502*H2O; 147,02 МВт
ХолестеринBio BasicCD0122386,67 МВт
Этиловый спиртB& JRP090-199,99%; 46,07 МВт
Сульфат магния, безводныйBio BasicMN1988120,37 МВт
Калийфосфат, одноосновный, безводныйBio BasicPB0445136,09 МВт
2'-дезокси-5-фторуридинTokyo Chemical IndustryD2235246,19 МВт
Калийфосфат, двухосновный, безводныйBio BasicPB0447174,18 МВт
Многоцелевые пробиркиStockwell ScientificST.85708 мл
Крышки для пробирокStockwell ScientificST.8575
Колба для клеточных культурSPL Lifescience7012525 см2
исследовательский стереомикроскопNikonSMZ18
Цветная головка фотоаппарата высокой четкостиNikonDS-Fi2
Блок управления на базе ПКNikonDS-U3
NIS-Elements Basic Research, программное обеспечение для микроскопической визуализацииNikonMQS32000

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  2. Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  3. Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans. ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).
  4. Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).
  5. Cutter, A. D. Caenorhabditis evolution in the wild. Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Felix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).
  8. Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
  9. Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D. Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).
  10. Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).
  11. Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment. Biomed Res Int. , 465056(2015).
  12. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (48), (2011).
  13. Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. 3-D worm tracker for freely moving C. elegans. PLoS One. 8 (2), e57484(2013).
  14. Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
  15. Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments. Sci Rep. 5, 9564(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

C elegansNGT 3DNGB 3D

Похожие статьи