Лигандом Нано-кластер Массивы в поддерживаемому липидный бислой

Адгезия клеток происходит через специализированные молекул клеточной адгезии (АМСГ), белки, присутствующие на клеточной мембране, которые способны связываться с их аналогом на внеклеточном матриксе или на другую клетку. На прилипших клетки, большинство молекул адгезии , включая повсеместные интегриный и кадгерин, находятся в виде кластеров ^1. Взаимодействие Т-лимфоцитов (Т-клетки) с антиген-представляющими клетками (АРС) обеспечивает особенно яркой иллюстрацией важности кластеров рецепторов, сформированных на границе раздела между двумя клетками - часто называют иммунологический синапс. При формировании первого контакта с рецепторами клеток АРС, Т (TCR) на поверхности масштабных кластеров формы клеток микронного Т , которые служат в качестве сигнальных платформ ^{2, 3, 4,} и, в конечном счете централизованных , чтобы сформировать больший центральный надмолекулярный кластер (cSMAC )деваха = "Xref"> ^{5, 6, 7.} В последнее время было показано , что на стороне APC, лиганды рецептора Т - клеток, также сгруппированы ^8.

В контексте Т - клеток-APC взаимодействия, развертывание гибридных систем, где АРС имитировало искусственную поверхность функционализированной с соответствующими белками, значительно продвинул наше понимание синаптического интерфейса ^{2, 3, 4, 5, 6, 7} , В этом контексте имеет большое значение для разработки APC мимические поверхностей, которые захватывают один или несколько аспектов клетки-мишени. Например, если лиганды привиты на поддерживаемых липидных бислоев, они могут диффундировать в плоскости бислоя, имитировать ситуацию на поверхности APC и в то же время позволяет формированиеcSMAC ^{6, 7.} Аналогичным образом , кластеры на APC были имитировали путем создания островков лигандов в море полимеров ^{9, 10, 11, 12, 13, 14.} Тем не менее, эти две функции до сих пор не были объединены.

Здесь мы описываем технику, чтобы создать новую нано-точек анти-CD3 (антитело, которое нацеливает комплекс TCR), окруженный липидный бислой с диффундирующими липидами. Бислой осаждают с помощью Ленгмюра-Блоджетт / Ленгмюра-Schaefer технику ^{7, 15, 16} и , если желательно, может быть функционализированный с определенным белком - например, лиганд клеточного интегрина Т ( так называемый ICAM - 1). Кроме того, анти-CD3 белка точек КоуLD быть заменен другим антителом или CAM. В то время как мы выбрали белки для дальнейшего использования в качестве платформы для исследований клеточной адгезии Т, стратегия подробно здесь может быть адаптирована для любого белка и даже ДНК.

1. Очистка стекла крышка гребни и наблюдения Камеры

1. Расположить стеклянную крышку-слайды на несколько слайдов лоток, выполненный из инертного материала, как политетрафторэтилен (ПТФЭ).
2. Погрузите лоток с горками и наблюдательную камеру в растворе поверхностно-активного вещества (любой продукт, рекомендованный для очистки кварцевых кювет подходит).
3. С помощью ультразвуковой ванне, ультра-соникатные в растворе поверхностно-активного вещества в течение 30 мин при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
4. Промыть 5 раз сверхчистой водой (18,2 MΩ.cm, 0,059 мкСм / см).
5. Ультра-соникат в растворе поверхностно-активного вещества в течение 30 мин при комнатной температуре (от 20 до 30 ° С).
6. Промыть 10 раз сверхчистой водой.
7. Повторите шаги 1.5 и 1.6 раза.
8. Хранить в воде при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C) в течение одной недели.

2. Изготовление Protein Nano-точек

1. Осаждение из бисера
   1. Deposiт суспензию диоксида кремния шариков (2% об / об, 70 мкл) по каплям на крышке горкой (24 х 24 мм, толщина 170 мкм), проводимых с наклоном 15 градусов.
   2. Пусть суспензия распространяется в течение примерно 1 мин, переворачивая стекло на 90 ° каждые 15 с.
   3. Дайте жидкости испаряются в условиях окружающей среды.
   4. Хранить в чистом стекла или PTFE камеры при условиях окружающей среды в течение до 2 дней.
2. Отложение алюминия
   1. Поместите слайды (полученный в разделе 2.1) внутри радиочастоты оборудования напыления (РЧ) магнетрон ^8, на поворотный стол на расстоянии около 105 мм от алюминия (99%): кремний (1%) целевой.
   2. Откачка камеры осаждения до 2,6 × 10 ^-4 Па с использованием турбо-молекулярным насосом. Этот шаг важен для удаления возможных газообразных примесей.
   3. Представьте атмосферу чистого аргона (5N, 99,999%) с потоком 10 станда при давлении 0,8 Па (6,6 мТорра).
      
   4. Включите генератор ВЧ-мощности.
      Примечание: В данном случае был использован типичный диапазон 400-600 Вт мощности радиочастотного на частоте 13,56 МГц. РФ используется генератор с соответствующей сетью в режиме емкостной плазмы связи. Отраженная мощность контролируется и сведено к минимуму с помощью адаптации к сети.
   5. После того, как плазма стабилизируется, распылением в течение 2 мин держать затвор закрыт, чтобы удалить возможные примеси с поверхности мишени.
   6. Открыть затвор и позволить напыление продолжать в течение 60 мин для осаждения алюминия на стекле до толщины 200 нм.
   7. Вырезать поток аргона, закрыть запорный клапан, чтобы изолировать турбомолекулярный насос от камеры осаждения и удаление воздуха из камеры с чистым пitrogen, чтобы получить давление в помещении. Восстановление слайдов алюминиевого покрытия. Хранить до одного месяца в чистых и герметично закрытых стеклянных или ПТФЭ коробков в условиях окружающей среды.
3. Осаждение из паровой фазы органосилана
   1. Погрузите слайд алюминиевого покрытия, полученный на стадии 2.2.6 в сверхчистой воде при комнатной температуре и ультра-разрушать ультразвук в течение 30 с в ультразвуковой ванне (50 Вт, 50/60 Гц, между 20 и 30 ° С).
   2. Депозит 0,5 мл (3-аминопропил) -triethoxysilane (APTES) в нижней части эксикатора.
      ВНИМАНИЕ: APTES представляет собой органосилан, который легко испаряется, и является токсичным. APTES следует обращаться только под проточной капюшоном и перчатками.
   3. Поместите стеклянные слайды (полученные в разделе 2.3.1) на керамическую сетку и месте внутри эксикатора.
   4. Подключение к эксикаторе мембранного насоса и работать на максимальной мощности в течение 30 мин, чтобы генерировать низкий вакуум.
   5. Закройте клапан эксикатора и выключить насос.
   6. Нагреть эксикатордо примерно 50 & deg; С в течение 1 ч.
   7. Откройте эксикаторе и собрать слайды.
   8. Переход к другому чистому эксикаторе для хранения в течение до 48 ч при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
4. Нанесение первого слоя белка - бычий сывороточный альбумин меченного биотина (БС-биотин)
   1. Разместите один из слайдов, подготовленных в разделе 2.3 на подложке из ПТФЭ.
   2. Депозит 1 мл 25 мкг / мл БСА-биотин, растворенного в фосфатном буферном растворе (PBS). Оставьте в течение 30 мин при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
   3. Полоскание 10 раз PBS. Хранить образец в течение 24 ч при 4 ° С от источника света.
5. Удаление алюминиевой маски
   1. Инкубируйте слайды в растворе NaOH в PBS (приготовленного добавлением по каплям 1 М NaOH до приблизительно 100 мл PBS, чтобы получить pH≈12) в течение ночи при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
      ВНИМАНИЕ. NaOH, вызывает коррозию и должны быть обработаны с помощью перчаток.
   2. Полоскание10 раз в сверхчистой воде.

3. Осаждение Поддерживаемое липидный бислой (SLB)

1. Очистка желоба Ленгмюра
   1. Удалить воду в корпусе из PTFE желоба Ленгмюра с использованием насоса.
   2. Очистить с помощью безворсового нетканого одноразового полотенца, смоченного в хлороформе.
      ВНИМАНИЕ. Хлороформ является токсичным и следует манипулировать в хорошо вентилируемом месте, с маской (или под капотом потока), и с помощью соответствующих перчаток.
   3. Чистые 4 раза с теплой водой (сверхчистой от 40 до 50 ° C).
   4. Чистые, по меньшей мере 6 раз с холодной водой. Сверхчистой
2. Осаждение первого липидного слоя
   1. Поместите подносы из ПТФЭ в корпусе из PTFE желоба Ленгмюра, а затем заполнить его сверхчистой водой.
   2. Используйте программное обеспечение управления устройством Лэнгмюры, чтобы установить измеренное давление до 0 мН / м.
   3. Используйте газонепроницаемые стекло / металл шприца внести 30 мкл 1 мг раствора / мл липидов (1, 2-dioleoyl- зп глицеро-3-фосфохолин (DOPC) в хлороформе) на поверхности воды. Хлороформ испаряется и липидные молекулы спонтанно образуют монослой.
   4. Используйте программное обеспечение управления, чтобы сжать липидный монослой, закрыв ПТФЭ барьер до требуемого давления (27 мН / м для DOPC) достигаются.
   5. Используйте программное обеспечение управления, чтобы погрузить предметное стекло, полученное в разделе 2.5.2, в корпус из ПТФЭ с использованием моторизованного зажима.
   6. Удерживая слайд, в зажиме, перпендикулярной к поверхности раздела воздух-вода. Используйте программное обеспечение управления, чтобы поднять ее медленно (15 мм / мин) через интерфейс, сохраняя при этом постоянное давление в 27 мН / м.
   7. Место в сухой среде либо для немедленного использования или для хранения до 24 ч при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
3. Осаждение второго липидного слоя
   1. Поддерживать поверхностное давление в корыте Ленгмюры на требуемом уровне 27 мН / м. Сжатие с использованиемУправляющее программное обеспечение устройства Ленгмюра и / или добавить небольшое количество липида для достижения желаемого давления.
   2. Поместите стеклянные слайды, несущие липидный монослой, подготовленный в разделе 3.2.6, в горизонтальном положении на поверхности воды. Убедитесь, что каждый слайд плавает над лотком PTFE.
   3. Нажмите стеклянные слайды вниз, один слайд в то время, в его соответствующий лоток PTFE с использованием PTFE или металла пинцетом таким образом, что они погружены в воду. Избегайте наклон слайдов, нажимая.
   4. Используйте PTFE или металлические пинцеты для передачи лотков из ПТФЭ, содержащих слайды в кристаллизатор, наполненный сверхчистая вода, убедившись, что слайды не подвергаются воздействию воздуха.
   5. Используйте PTFE или металлические пинцеты для передачи, во время работы под водой, двухслойное покрытием предметного стекла в камеру наблюдения.
      Примечание: Наблюдение камера находится под водой внутри кристаллизатора. Камеры наблюдения на заказ и состоит из ПТФЭ кольца с резиновой прокладкой апD стальные кожухи, которые могут быть собраны под водой, чтобы сделать камеру водонепроницаемой которой нижней поверхность выполнена из предметного стекла, предварительно покрытое липидного бислой.
   6. Закройте камеру, продолжая работать под водой и обеспечение того, чтобы около 1 мл воды в ловушке внутри камеры.
   7. Возьмите собранную камеру из воды. Убедитесь, что водонепроницаемый и утечка бесплатно.
   8. Заменить 1 мл сверхчистой воды, присутствующей в камере наблюдения с PBS путем добавления и удаления 500 мкл PBS, в 10 раз. Убедитесь в том, что камера никогда не лишена жидкости.
4. SLB этап блокирования
   1. Введение 100 мкг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) в смотровой камере, содержащей слайд, полученный в разделе 3.3.6, и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
   2. Ополосните бислой путем удаления и добавления 500 мкл PBS, в 10 раз. Бислой может храниться 24 ч при 4 ° С.

4. Функционализация с лигандами

1. Добавить флуоресцентное или нефлуоресцентного neutravidin (NAV, дегликозилированной версия авидин не заряжается при рН 7) при 2 мкг / мл в камеру, содержащую слайд, полученный в разделе 3.4.2 в течение 30 мин при комнатной температуре (от 20 до 30 ° С).
2. Промыть путем добавления и удаления 500 мкл PBS, в 10 раз.
3. Добавить биотинилированного анти-CD3 по 2 мкг / мл в камеру, содержащую слайд, полученный в разделе 3.4.2. Для двойной функционализации SLB и точками, добавить Fc-ICAM-1 His-метки при 5 мкг / мл (в данном случае, бислой изготовлен из DOPC + 1% нитрилтриуксусная кислоты (NTA) липидов). Оставьте в течение 30 мин при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
4. Промыть путем добавления и удаления 500 мкл PBS в 10 раз
5. Заменить PBS с клеточной средой (PBS + 0,1% BSA) путем добавления и удаления 500 мкл клеточной среды в 10 раз.
6. Оставьте 200 мкл клеточной среды в Chambeг с ползуном.
7. Поместите камеру в течение 10 мин при 37 ° С перед добавлением клеток.

5. Осаждение клеток (см ссылки 7 для деталей)

1. Осторожно внести 400 мкл клеточной суспензии в камеру. Инкубируйте клетки в течение 30 мин при 37 ° С.
2. Зафиксировать ячейку с 2% параформальдегида (PFA) в течение 15 мин при 37 ° С. Заменить PFA с PBS путем повторного удаления и добавления 500 мкл PBS.

6. Наблюдение

1. Proteo-липидная нано-модель и SLB Текучесть
   1. С помощью флуоресцентного микроскопа с изображением шаблона белка в режиме эпи-флуоресценции с использованием соответствующего освещения длины волны (639 нм) и фильтра кубов (например , здесь, EX ТБФ 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; Е. М. ТБФ 526 + 601 +688).
      Примечание: Интенсивность сигнала может быть определено количественно оценить количество белка внутри и за пределами точки. Используйте соответствующее освещение длину волны (330 нм) и пМСДЭНИ куб с изображением бислой (BP 365/12, FT 395, LP 397), который появляется светлая с темными дырами.
   2. Используйте метод непрерывного фотообесцвечивание (КПБ) ^{13, 15} для измерения коэффициента диффузии меченых липидов из в бислой. Это наблюдение предпочтительно сделано только после осаждения SLB.
      Примечание: Для того, чтобы количественно оценить коэффициент диффузии, два параметра измеряется в процессе КПБА: определенное время отбеливания красителя (тугой) и длины затухания флуоресцентного профиля гало, образованном вокруг беленой области (TAUD). Первый получается путем построения графика временной эволюции интенсивности флуоресценции в центре освещенного поля во время процесса CPB. Второй получаются путем построения профиля интенсивности на крае освещенной зоны (в среднем за 12 линий и 5 изображений после того, как будет достигнут стационарный). Кривые приспособлены для получения тугой и TAUD. Коэффициент диффузии даются темUD ² / тугим (D = ).

Флуоресцентные изображения были проанализированы, чтобы измерить расстояние и размер точек. Типичный интервал было установлено, что 1 900 ± 80 нм и типичная точка-размер был 600 ± 100 нм (рис 1 г). Интервал устанавливается по размеру гранул, используемых для маски. Точка-размер устанавливается шарик размером, а также условий осаждения. SLB осаждается однозначно вокруг белковых точек , а не на них (рисунок 2), с совершенной комплементарностью между отверстиями видели в канале формирования изображения SLB и точками видели в канале СЧ формирования изображения. Анализ непрерывного фотообесцвечивание данных показывает , что липиды в узорной бислой остаются жидкости и имеют типичную диффузионную проницаемость 5 μm² / с (рисунок 3).

Рисунок 1: Схематическое представление этапов изготовления. (а -7 торр, Аргона потока 10 SCCM, давление процесса 6.2 мТорра, изображенном на ускоряющем напряжении 5 кВ. Изображения подтверждают наблюдение, сделанное с оптической микроскопией (изображение не входит) до осаждения алюминия, что шарики расположены в центре монослоя гексагональной решетки на стекле горки. (Б) Вторичная маска из алюминия , созданного осаждение распыления после удаления первичной бисерной-маски. (С) Осаждение кремнийорганического и БСА-биотин , хотя вторичной маски. (Д) удаление из алюминия выявления нано-точек БСА-биотин. (Е) осаждение SLB. (Е) связывание NaV с БСА-биотин. (Г) Binding анти-CD3 для NaV. Вставки показывают эпи-флуоресцентное изображение из нано-точек массивов. Здесь СЧ флуоресцентно меченных. Типичная точка-размер составляет 600 ± 100 нм, а типичное расстояние составляет 1900 ± 80 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: комплементарность нано-точки и SLB узора. (А, б) Эпи-флуоресцентные изображения флуоресцентных NaV нано-точек и из SLB с флуоресцентными меченых липидов. (С) Композитный изображение СЧА точек (красный) в море SLB (зеленый) показывает совершенную комплементарность NaV и SLB. Быстрое преобразование Фурье (БПФ) изображения на вставке указывает на дальний порядок. Шкала бар: 4 мкм.rge.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Количественное диффузии липидов в SLB. (А) Эпи-флуоресценция изображение SLB , прежде чем отбеливания. Белковые точки показывают как темные дыры в ярком море липидов. Поле диафрагма ограничивает освещенную зону. (Б) Эпи-флуоресценция SLB после отбеливания непрерывно в течение 50 с. Гало видны внутри области, ограниченной полевой диафрагмы указывает на то, что липиды являются мобильными. Шкала бар: 10 мкм. (С) Средняя профиль интенсивности вдоль края поля-диафрагмы (вверху) и при распаде интенсивности с течением времени в ходе процесса вытаскивания (внизу). Эти данные анализируются, чтобы извлечь коэффициент диффузии, который обычно 5 μm² / с.

Авторы не имеют ничего раскрывать.