Мы представляем протокол для функционализации стекла с нанометровыми белковыми пятнами, окруженными жидкостью липидного бислой. Эти субстраты совместимы с современной оптической микроскопии и, как ожидается, служить в качестве платформы для клеточной адгезии и миграции исследований.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Лигандом Нано-кластер Массивы в поддерживаемому липидный бислой
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В настоящее время существует значительный интерес к созданию упорядоченных массивов адгезивных белков островков в море пассивирован- поверхности для биологических исследований клеток. В последние года она становится все более очевидной, что живые клетки реагируют не только на биохимическую природу молекул, представленных им, но и к тому, как представлены этим молекулам. Создание белковых микро-модели, таким образом, в настоящее время стандартом во многих биологических лабораториях; нано-структура также является более доступной. Однако, в контексте межклеточных взаимодействий, существует необходимость в шаблон не только белки, но и липидные двухслойные. Такой двойной Proteo-липидной структурирование до сих пор не было легко доступны. Мы предлагаем легкое техника для создания белковых нано-точек, нанесенных на стекле и предложить способ засыпки между точечным пространством с поддерживаемым липидным бислой (SLB). С фото-отбеливание трассера флуоресцентные липиды включены в БВУ, мы показали, что бислой обладает значительным в-плана текучесть. Функционализующих белковые точки флуоресцентных групп позволяют им изображение и показать, что они упорядочены в правильной гексагональной решетке. Типичный размер точек составляет около 800 нм, а расстояние между продемонстрирована здесь составляет 2 мкм. Эти подложки, как ожидается, чтобы служить в качестве полезных платформ для клеточной адгезии, миграции и исследований механо-зондирования.
Введение
Адгезия клеток происходит через специализированные молекул клеточной адгезии (АМСГ), белки, присутствующие на клеточной мембране, которые способны связываться с их аналогом на внеклеточном матриксе или на другую клетку. На прилипших клетки, большинство молекул адгезии , включая повсеместные интегриный и кадгерин, находятся в виде кластеров 1. Взаимодействие Т-лимфоцитов (Т-клетки) с антиген-представляющими клетками (АРС) обеспечивает особенно яркой иллюстрацией важности кластеров рецепторов, сформированных на границе раздела между двумя клетками - часто называют иммунологический синапс. При формировании первого контакта с рецепторами кле....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Очистка стекла крышка гребни и наблюдения Камеры
- Расположить стеклянную крышку-слайды на несколько слайдов лоток, выполненный из инертного материала, как политетрафторэтилен (ПТФЭ).
- Погрузите лоток с горками и наблюдательную камеру в растворе поверхностно-активного вещества (любой продукт, рекомендованный для очистки кварцевых кювет подходит).
- С помощью ультразвуковой ванне, ультра-соникатные в растворе поверхностно-активного вещества в течение 30 мин при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
- Промыть 5 раз сверхчистой водой (18,2 MΩ.cm, 0,059 мкСм / см).
- Ультра-соникат в растворе поверхностно-активного вещества....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Флуоресцентные изображения были проанализированы, чтобы измерить расстояние и размер точек. Типичный интервал было установлено, что 1 900 ± 80 нм и типичная точка-размер был 600 ± 100 нм (рис 1 г). Интервал устанавливается по размеру гранул, используемых для маски. Точка-размер устанавливается шарик размером, а также условий осаждения. SLB осаждается однозначно вокруг белковых точек , а не на них (рисунок 2), с совершенной комплементарностью между отверс.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические шаги в рамках протокола, описанном выше, связаны с образованием белковых нано-точек или задним заполнением пространства вокруг точек с помощью поддерживаемого липидного бислой. Первый важный шаг в отношении белкового нано-точка является подготовкой борта-маска. Чистка крышки-ползун имеет решающее значение. Слайды должны быть либо очищены с помощью моющего раствора, который рекомендуется для очистки кварцевых кювет, или с помощью кислородной плазмы. Другие методы очистки, такие как погружение в этаноле или об.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Лоран Limozin, Пьер Диллард и Астрид Валь для продолжения плодотворной дискуссии по поводу приложений сотовой связи. Мы также благодарим Фредерика Беду от PLANETE чистых помещений объекта за его помощь с наблюдениями SEM. Эта работа была частично финансируется Европейским исследовательским советом по грант № 307104 FP / 2007-2013 / ERC.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Стеклянные покровные стекла | Assistent, Karl Hecht KG | ||
| Смотровая камера | Самодельный | ||
| концентрат щелочного поверхностно-активного вещества (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| Ультраультразвуковой аппарат | ThermoFisher | ||
| Desiccator | Labbox | ||
| Crystallizer | Shott | ||
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 | |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 | |
| Вода MQ | ELGA, Veolia France | ||
| Гранулы диоксида | кремния Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES Sigma-aldrich | A3648 | ||
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Полярные липиды | 850375C | |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| Хлороформ | Sigma-aldrich | 650471 | |
| Газоплотный шприц | Dominique Dustcher , Франция | 74453 | |
| Пленочные весы | NIMA | Medium Microscope Zeiss | |
| , Германия | TIRF-III система | ||
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, США | ||
| Радиочастотный магнетрон для распыления Systè Ме | модифицированный инструмент SMC 600 от ALCATEL , Франция |
Ссылки
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminate....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
