Мышиные полная толщина трансплантация кожи является хорошо известной моделью для изучения отказа в установке аллоиммунная. Здесь мы предоставляем учебник каждого шага, участвующих в выполнении / с BALB -> C57BL / 6 всю толщину трансплантата кожи.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мышиные Полная толщина кожи Трансплантация
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мышиные полная толщина трансплантация кожи является хорошо создана в естественных условиях модель для изучения аллоиммунная реакции и отторжения трансплантата. Несмотря на ограниченное применение для человека, трансплантация кожи у мышей широко применяется для исследования трансплантации. Процедура проста в освоении и выполнять, и это не требует тонких методов микрохирургических, ни интенсивное обучение. Кроме того, отторжение трансплантата в этой модели имеет место в очень воспроизводимым иммунологической реакции и легко контролировать путем непосредственного осмотра и пальпации. Кроме того, вторичная трансплантация кожи с донорскими соответствием или третьей стороной кожи трансплантаты могут быть выполнены на более сложные модели трансплантации в качестве альтернативы и несложный метод оценки донорского-специфической толерантности. Осложнения низкие, и в общем случае ограничено анестезии передозировки или респираторного дистресс-синдрома после процедуры. отказ привитые, с другой стороны, происходит обычно в результате плохой подготовки гркормовой части, неправильное положение в привитой постели, или несоответствующее размещение повязки. В этой статье мы приводим протокол для полной толщины пересадки кожи у мышей и описывают важные шаги, необходимые для успешной процедуры.
Введение
Трансплантация органов является методом выбора при лечении больных с недостаточностью терминальной стадии органов, а также исходы значительно улучшилось с прогрессом в области хирургических процедур и протоколов иммуносупрессии. Тем не менее, длительное подавление иммунитета связано со значительными побочными эффектами, а также разработка новых стратегий, способствующих толерантности остается целью современных исследований трансплантации.
Многочисленные животные модели были разработаны для фундаментальных исследований в области трансплантации, чтобы изучить механизмы отторжения трансплантата и испытать иммуносупрессии подходы для предотвращения отторжения трансплантата и для содействия долгосрочному толерантности 1-3. Мышиные модели стали основой иммунологического исследований в связи с исключительной и обширной доступности диагностических и терапевтических антител и четко определенных инбредных и трансгенных линий. Пересадка кожи является простая процедура, которая не требует специальных навыков микрохирургических и можетлегко контролировать в послеоперационном периоде. Взятые вместе, трансплантация кожи мыши была исключительным инструментом для изучения многих аспектов , участвующих в реакции аллоиммунная, включая доставку антигена, незаконный оборот клеток и разрушения тканей во время отторжения трансплантата 4,5.
Здесь мы покажем процедуру шаг за шагом для полной толщины пересадки кожи с использованием модели мыши, и мы опишем важные шаги, необходимые для успешного приживления пересаженного кожи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья (NIH) и были одобрены Университета животных по уходу и использованию комитета Джона Хопкинса (JHUACUC) путем. Конкретные процедуры были выполнены в соответствии с утвержденными протоколами ACUC MO13M292 и MO13M370.
1. Донор Урожай кожи
- Обезболить мыши-донора с изофлуран (индукционным испарителем на уровне 4%, обслуживание на 1 - 2% через конус мыши). Используйте носок вывода пинч рефлекс контролировать глубину анестезии.
- Используя электрическую бритву, брить спину животного и дезинфицировать его с 10% повидон йода (например, Бетадин).
- Используя стерильные ножницы, перчатки и асептики, донорские урожай кожи спины от бедра до шеи, с тупым на уровне рыхлой соединительной ткани.
- Усыпить животное шейки дислокации после сбора урожаякожа трансплантат.
- Под микроскопом, отделить соединительной ткани, жировой ткани, и panniculus carnosus из кожи спины с помощью тонких ножниц тенотомию. Panniculus carnosus представляет собой тонкий, прозрачный мышцы отвечают за подергивание движений кожи.
- Использование стерильных инструментов, вырезать 15-мм х 15-мм трансплантаты из кожи спины для 10-мм х 10 мм до 15 мм х 15 мм привитого кровати.
- Хранить трансплантатов на марли, смоченными стерильным фосфатно-солевом буфере (PBS) в чашке Петри на льду.
Примечание: 8 - 10 трансплантаты могут быть получены из одной мыши-донора.
2. Получатель Пересадка кожи
- Обезболить мышь получателя с изофлуран (индукционным испарителем на уровне 4%, обслуживание на 1 - 2% через конус мыши). Используйте носок вывода пинч рефлекс контролировать глубину анестезии.
- Администрирование 0,02 мг / кг веса тела бупренорфина для послеоперационного обезболивания.
- Бритье сторону задней части животного, где трансплантат WiLL быть вставлена и дезинфицируют 10% повидон-йод.
- Используя ножницы, вырезать 10 мм х 10 мм до 15 мм-х 15-мм квадратной кожи. Размер дефекта должен быть немного больше (10%), чем трансплантата. Вырезать так же поверхностно, насколько это возможно. Позаботьтесь, чтобы сохранить panniculus carnosus и сосуды. Panniculus carnosus можно отличить от основной лицевой панели его подвижности и кровеносных сосудов, которые работают поверхностные к нему.
- Поместите трансплантат на привитой постели, избегая складок по краям.
- Поместите 8 швов на углах и на середине каждого края. Для каждого шва, проходят через иглу трансплантата, а затем через panniculus carnosus трансплантата дну ниже окружающей кожи реципиента.
- Снимите маску обезболивающий и пусть животное частично восстановиться после анестезии перед нанесением клеевой повязку.
- Оберните мышь получателя в клеевой повязка с сложенную марлю над трансплантатом. Повязка путем объединения двух бинты, резкаклеевой состав одного и размещения двух впитывающие прокладки вместе.
- Монитор мыши тесно во время восстановления, чтобы убедиться, что повязка не ограничивая грудную клетку экскурсии и дыхания. Снимите повязку, если частота дыхания снижается или животное начинает задыхаться или дыхание неглубоко.
3. Послеоперационный
- Администрирование Энрофлоксацин 5 мг / кг после операции по поводу инфекции профилактики.
- Поместите пересаженных мышь в чистой клетке над Microwavable грелку, пока она полностью не оправится от анестезии.
- Соблюдайте мыши в течение 1 часа после операции до возвращения его к жилому объекту.
- Через семь дней после операции, анестезию мыши, как на шаге 2.1. Снимите повязку путем разрезания только через брюшную сторону повязки.
- Наблюдайте и ощупывать трансплантата на следующий день на наличие признаков струпьев, сокращения или твердости. Если он присутствует, трансплантат не может быть достигнуто надлежащее vascularizaции и следует рассматривать как технический сбой.
- ежедневно контролировать на наличие признаков отторжения. Рассмотрим трансплантатов отвергнута при ≥90% от трансплантата ткани становится некротической.
- Эвтаназии отклоненные животных и собирать их для анализа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Размещение повязкой на мыши-реципиента является важным шагом процедуры. Кожный трансплантат позиционируется на стволе получателя, между плеча, бедра и позвоночника (рисунок 1). Бандаж выполнен со сложенным марлю и сочетание двух пластиковых пластырей. Мышь получатель помещается с трансплантатом вниз через марлю в центре бинта. С помощью двух изогнутых микро щипцами, нижний конец бинта вытягивается, а затем верхняя часть бинта оборачивают над мышью в живот.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
С момента своего появления по Medawar, во- первых , в исследованиях на людях , а затем у кроликов и мышей, трансплантация кожи была бесценным моделью для изучения аллогенных иммунных ответов 6,7. В этой рукописи, мы представляем модель крупномасштабного, не кровоснабжением, полную толщину пересадки кожи с помощью верхней и нижней части спины кожу. Различные альтернативные методы, в том числе с помощью хвоста кожи или уха кожи мыши в качестве источника ткани трансплантата, было зарегистрировано на сегодняшний ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Эта работа финансировалась грантом NIH R01AI077610.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Прямые микрощипцы | Sigma | F4017 | |
| Изогнутые микрощипцы | Aesculap | BD333R | |
| Изогнутые ножницы для тенотомии Стивенса | Aesculap | BC905R | |
| Mayo препарирующие ножницы | Sigma | S3146 | |
| Микроиглодержатель | Aesculap | BM563R | |
| Стерильная марля | Covidien | ||
| 6-0 Нейлоновый шовный материал | MWI | 31849 | |
| Пластиковые полоски Лента- Эйд | Джонсон & | Johnson Получен из аптеки | |
| 10 см чашка Петри | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Бупренорфин | DEA Требуется номер; Получено из больничной аптеки | ||
| Энрофлоксацин | Bayer Health Care | 186599 |
Ссылки
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753(2014).
- Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
- Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
- Garrod, K. R., Cahalan, M. D. Murine skin transplantation. J Vis Exp. , (2008).
- Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724(2014).
- Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
- Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495(2013).
- Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, (2009).
- Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454(2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
