Микрожидком система с поверхности паттернирования для исследования кавитационного пузырька (ы) -клетка взаимодействия и результирующая биоэффектов на уровне одной клетки

Summary

Был изготовлен микрофлюидный чип для производства пар золотых точек для создания тандемных пузырей и покрытых фибронектином островов для структурирования одиночных клеток поблизости. Полученное поле потока было охарактеризовано с помощью скорости изображения частиц и использовано для изучения различных биологических эффектов, включая порацию клеточных мембран, деформацию мембраны и внутриклеточную реакцию кальция.

Abstract

В этой рукописи, мы сначала опишем протокол изготовления микрожидком чипа, с золотыми точками и фибронектина покрытием областей на той же стеклянной подложке, которая точно контролирует образование пузырьков тандемных и отдельных клеток узорчатых рядом с хорошо определенными местах и ​​форм. Затем демонстрируют генерацию пузырьков тандеме с использованием двух импульсных лазеров, освещающие пару золотых точек с задержкой по времени несколько микросекунд. Мы визуализировать взаимодействие пузырь пузырь и формирование струи изображений высокой скорости и характеризуют поле результирующего потока с использованием велосиметрии изображения частиц (PIV). И, наконец, мы приведем некоторые применения этого метода для анализа отдельных клеток, включая клеточную мембрану порации с макромолекулы поглощения, локализованной деформации мембраны определяется смещениями присоединяемых интегрином связывания шариков и внутриклеточной реакции кальция из логометрической визуализации. Наши результаты показывают, что быстрый и направленный поток струйное является прообразуемых при взаимодействии тандем пузырь, который может наложить высоколокализованной напряжение сдвига на поверхности клетки, выращенные в непосредственной близости. Кроме того, различные биоэффекты можно индуцировать путем изменения силы потока нагнетаемой регулируя расстояние STANDOFF от кюветы до пузырьков тандема.

Introduction

Существует растущее признание того, что клеточная гетерогенность, возникающие в связи с стохастической экспрессии генов, белков и метаболитов, существует в большой популяции клеток и служит основополагающим принципом в биологии , чтобы позволить адаптации и эволюции ¹ клеток. Поэтому часто неточны и ненадежны использовать объемные измерения на уровне всего населения для понимания функции отдельных клеток и их взаимодействий. Разработка новых технологий для анализа одноклеточного поэтому представляет большой интерес в биологических и фармакологических исследований, и может быть использовано, например, чтобы лучше понять ключевые сигнальные пути и процессы в области биологии стволовых клеток и терапии рака ^2-4. В последние годы, появление микрофлюидальных платформ в значительной степени облегчает анализ одноклеточного, где позиционирование, лечение и наблюдение ответа от отдельных клеток были проведены с новыми аналитическими стратегиями ^5.

Кавитация играет важную роль в разнообразных биомедицинских применений, в том числе при лечении злокачественных опухолей с помощью высокоинтенсивного сфокусированного ультразвука (HIFU) ^6, неинвазивный фрагментация камней в почках с помощью ударно - волновой литотрипсии (SWL) ^7, лекарственное средство или ген доставки по sonoporation ^8, а также недавно сообщили разрушения клеток или тканей с помощью гидродинамического кавитационного пузыря ^9,10. Несмотря на это, не были хорошо изучены динамические процессы кавитационного пузырька (ами) взаимодействия с биологической ткани и клетки. Это происходит из-за хаотичности в инициировании и пузырьковых динамики кавитационных производства с помощью ультразвука, ударные волны, и локального гидравлического давления; Кроме того, существует недостаток стимулирующих методов для решения сложных по своей сути и быстрый отклик биологических клеток, особенно на уровне одной клетки.

Из-за этих проблем, это не удивительно, что очень небольшое число исследований было пчелап сообщили исследовать взаимодействия пузырьков клетки в хорошо контролируемых условиях эксперимента. Например, мембрана порации отдельных клеток в суспензии в ловушке ¹¹ и импульсивный большая деформация человеческих красных кровяных клеток ¹² были продемонстрированы с использованием лазерных сгенерированных одиночных пузырьков в микроканалов. Последний метод, однако, может производить только очень малую деформацию в эукариотических клетках , из - за наличия ядра ^13. Кроме того, трудно контролировать вниз по течению биоэффектов при обработке клеток в суспензии. В других исследованиях, ультразвуковое возбуждение клеток переплете микропузырьков (или ультразвуковое контрастное вещество) для производства мембран порации и / или внутриклеточные реакции кальция в одиночных адгезивных клеток было сообщено ^8. Мембрана порации отдельных адгезивных клеток , также могут быть получены при использовании генерируемое лазером пузырьков тандемные в тонком слое жидкости , содержащей светопоглощающий трипанового синего раствора ^14, иликолеблющимся газового пузыря , генерируемого микросекунды лазерных импульсов , облучающих через оптически поглощающую подложку в микрокамеры ^15. При сравнении оптически поглощающей подложке имеет преимущество по сравнению с лазерным поглощающие -ным раствором трипанового синего, поскольку последний является токсичным для клеток. Что еще более важно, лазерные генерируемые пузырьки более управляемым с точки зрения размера пузырьков и места, чем акустически возбужденных пузырьков. Тем не менее, во всех этих предыдущих исследованиях, форма клеток, ориентация и условия прилипания были не контролируется, что может существенно влиять на клеточный ответ и биоэффектов , полученные с помощью механических напряжений ^16.

Для преодоления этих недостатков в предыдущих исследованиях, в последнее время мы разработали экспериментальную систему для образования пузырьков, клетки кучность, пузырь пузырь-клеточных взаимодействий, и в режиме реального времени биоэксперименты клеточного ответа в микрожидком чипа, построенного с использованием уникального сочетания микроструктур техничiques. Три основные черты , которые отличают нашу экспериментальную систему от других в области являются: 1) структурирование микронного размера золотых точек на стеклянной подложке , чтобы позволить локализованное поглощение лазера для образования пузырьков ^17; 2) структурирование микронного размера островков внеклеточного матрикса (ЕСМ) для клеточной адгезии на той же подложке, чтобы контролировать как расположение и геометрию отдельных ячеек; и 3) сжатие размерности области взаимодействия пузырь пузырь-клеток из 3D в квази-2D пространства для облегчения в плоскости визуализации пузырьков пузыря взаимодействий, струйное поля течения, деформации клеток, и биоэффектов, все захваченные в один обтекаемый последовательность изображений (рис 1д).

Рисунок 1: Микрожидкостных чипа и схемы различных анализов. а) Собранный Микрожидкостных чип с каналами заполнены синими чернилами для визуализации. б) область внутри микрожидком чипа с узорчатыми клетками и золотыми точками (расстояние между двумя точками золота в непосредственной близости от 40 мкм). Многие пары рабочих блоков могут быть расположены в канале. с) Крупным планом изображение одного рабочего узла , состоящего из пары золотых точек и клетки HeLa прилипшего к области клеточной структуризации. d) Схема работы устройства. Одна ячейка придерживается и распространяется на "Н" -образного острова, покрытого фибронектина. Пара кавитационных пузырьков (тандем пузырь) с анти-фазовых колебаний производятся путем освещения импульсные лазерные лучи на золотых точек (рис 4а), что приводит к образованию быстро и локализованным струи движется в направлении клетки - мишени поблизости. Клетка может быть деформирован, porated для макромолекулярной поглощения, и / или стимулируются с ответом кальция, в зависимости от расстояния зазора , (S _г) клетки на тандем - пузырь.F = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Эта платформа может быть дополнительно в сочетании с анализами флюоресценции и функционализированных бусинок, прикрепленных к поверхности клетки для кавитационных-индуцированной биоэффектов. В частности, эта платформа открывает путь для надежных и поддающихся количественной оценке анализов на уровне одной клетки. До сих пор мы использовали устройство для анализа тандемной пузыря-индуцированной деформации клеточных мембран, клеток порации и внутриклеточного поглощения, жизнеспособность, апоптоз и внутриклеточного кальция ответ. В следующем протоколе мы опишем процесс изготовления чипа и порядок анализа различных биоэффектов, упомянутых выше. Кроме того, также описаны операции чипа.

Protocol

1. микротехнологий

Примечание: Все процедуры микротехнологий выполняются в чистом помещении. Хромированная маска предназначена до микротехнологий, смотри Рисунок 2.

Рисунок 2: Схема конструкции канала в микрожидком чипа и размеры рабочих органов. а) Маска дизайн выровненных микроканалов PDMS (зеленый) и узоры на стеклянной подложке (синий и красный). б) Увеличенное изображение конструкции маски в репрезентативной части рабочего блока массивов. в) схема одного рабочего блока , показывающее конфигурацию ячейки (синий) и пару золотых точек (красный). Все масштабы длины приведены в правом нижнем углу. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть LARGER версия этой фигуры.

1. Золотая точка формирования рисунка
   Примечание: Площадь каждого из золота точка предназначена быть в пределах 25-30 мкм ^2, таким образом , чтобы она была достаточно большой , чтобы поглотить энергию лазера для образования пузырьков, но достаточно малы , чтобы избежать отдельных клеток , прилипшие к нему. Схематическая диаграмма для изготовления золота точка показана на рисунке 3a.
   1. Стекло слайд очистки (в химической капотом)
      1. Промыть стекло с ацетоном с последующим изопропилового спирта (IPA), а затем высушить его с помощью N ₂ потока.
      2. Замочите слайд в пираньи растворе (H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ = 4: 1) в течение 10 мин.
      3. Выньте слайд, промойте его дистиллированной водой, а затем высушить его с помощью N ₂ потока.
      4. Выпекать Предметное стекло на плитке при 120 ° С в течение 10 мин.
      5. Рассматривать слайд в плазме Ашера при 100 Вт в течение 90 с.
   2. Спин-покрытие (спин-покрытие капота)
      1. Включите плитке и подождите, пока температура не стабильна при 95 ° С.
      2. Выполните процедуру нанесения покрытия:
         1000 оборотов в минуту в течение 5 с с / с рампой 500 оборотов в минуту;
         то 3000 оборотов в минуту в течение 30 с с / с рампой 1000 оборотов в минуту.
      3. Закрепите очищенное предметное стекло на спин для нанесения покрытий с применением вакуума.
      4. Покройте поверхность скольжения с P-20 и начать рецепт покрытия.
      5. Повторите процесс нанесения покрытия для NFR-негативного фоторезиста.
      6. Выпекать слайд при 95 ° С в течение 60 секунд и подождать, пока она не остынет до комнатной температуры.
   3. фотолитография
      1. Установить хромовую маску на маску выравнивателя и убедитесь, что сторона шаблон лицевой стороной вниз в направлении скольжения.
      2. Установите рецепт фотолитографии в режим жесткого экспозиции с 9 с УФ-облучения и быстро выровнять стеклянную подложку с маской.
      3. После проведения экспозиции УФ, выпекать слайд на 956 ° С в течение 1 мин, а затем дайте ему остыть до комнатной температуры.
   4. разработка
      1. Разработка рисунка на слайде в растворе проявителя в течение 60 с.
      2. Удалить слайд от разработчика, промойте его дистиллированной водой и высушить его с помощью N ₂ потока.
      3. Проверьте геометрию картины под микроскопом, а также измерить и записать размер элемента.
   5. Осаждение золота (испарение E-света) и отрыва
      1. Выпекать слайд при 120 ° С в течение 5 мин и дайте ему остыть до комнатной температуры.
      2. Очистите слайд с плазмой в машине реактивное ионное травление (РИТ) в течение 90 с при 500 Торр и 100 Вт
      3. Депозит 5 нм Ti и 15 нм Au на слайд с использованием электронно-лучевой испаритель ^17.
      4. Замочите на ночь слайд в стеклянный стакан, содержащий фоторезиста для удаления растворителя для удаления золота покоится на вершине NFR сопротивляться.
      5. Получить слайд, на одном уровне ят с ацетоном с последующим ИПС, и высушить его с помощью N ₂ потока.
      6. Сушат слайд на горячей плите при 115 ° С перед очисткой в ​​кислородной плазме Асировой при 100 Вт в течение 90 с.
2. Молекулярно-сборка структурирование путем отрыва от земли (MAPL)
   Примечание: Площадь каждого острова фибронектина покрытием устанавливается в пределах 700-900 мкм ² для облегчения адекватной клетки HeLa распространения в квадратной области при одновременной минимизации возможности нескольких ячеек агрегировании на острове. Принципиальная схема для получения клеточного кучность островков показана на рисунке 3b.
   1. Спин покрытие
      1. Повторите шаг 1.1.2, но используют S1813-позитивного фоторезиста и температуру 115 ° С.
   2. Унифицированные фотолитографии
      1. Установить хромовую маску на маску выравнивателя и убедитесь, что сторона с рисунком обращена вниз к слайду сзолотых точек.
      2. Установите рецепт фотолитографии в режим жесткого экспозиции с 9 с УФ-облучения.
      3. Совместите верхнюю маску с нижней слайда с использованием меток выравнивания, расположенные вокруг края маски, как пространственная привязка.
      4. Проверьте центральную часть маски и убедитесь, что характеристики модели совмещены правильно.
      5. Заполните УФ-облучения без пост-выпекать.
   3. разработка
      1. Повторите шаг 1.1.3 , но с 45 с разработки перед сушкой на плитке и сохранения в памяти N _2.
3. химическая обработка
   1. Приготовьте раствор пассивирующий: 0,5 мг / мл ФАПЧ-г-ПЭГ в 10 мМ HEPES-буфере.
   2. Получить слайд из хранилища N ₂ и очистить его с помощью RIE с установкой параметра: 500 мм рт.ст. давление, 100 Вт мощности и 90-х годов продолжительность.
   3. Пипетка одну каплю раствора пассивирования на кусочек парафиновой пленки.
   4. Сэндвич раствора с пленкой и слайде, убедившись, что сторона с рисунком признаков лицевой стороной вниз в направлении пленки; Во избежание образования пузырьков.
   5. Подождите в течение 45 минут перед удалением слайд из фильма.
   6. Замачивание слайд последовательно в фоторезиста удаления, удаления фоторезиста и DI воды (1: 1), и деионизованной воды, и перемешивать ее в ультразвуковой ванне в течение 90 с для каждого растворения грязи.
   7. Сушат предметное стекло на плитке, чтобы удалить влагу перед пломбированием ее в эксикаторе и хранить его в холодильнике.
4. Чип сборки
   1. Повторите шаги 1.1.1-1.1.4, но с SU8-2025-негативного фоторезиста и настройки параметра , упомянутого называется протоколом MICROCHEM ^18, чтобы подготовить силиконовую форму с фотошаблона.
   2. Изготовить микроканале PDMS (40 мм х 25 мм х 5 мм, Д х Ш х В) и небольшой PDMS (сляб мкм шириной структуры паз 800), используя мягкую литографию.
   3. Пробейте microchanneл для портов доступа жидкости и очистить его с лентой, а затем с АПИ.
   4. Щит узорный участке стеклянной подложки с плитой PDMS, и применять RIE (100 Вт, 500 мТорр, 60 лет), чтобы удалить ФАПЧ-G-ПЭГ из периферийной области.
   5. Лечить Микроканал с уменьшенной дозой РИТ (25 Вт, 500 мТорр, 25 с), а затем привести его к узорчатой ​​стеклянной подложке (с небольшой PDMS плиты удалены); принести Микроканал и узорчатое стекло подложки в конформной контакте под стереоскоп.

Рисунок 3: Принципиальные схемы для микротехнологий и чип - сборки. а) Структура золотых точек на стеклянной подложке. б) Получение стеклянной подложки для клеток кучность через MAPL. в) Сборка микрожидкостных канала с плазменной сварки. Смотрите список материалов для определения ое сокращений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

5. прикрепление клеток
   Примечание: HeLa клетки обычно поддерживают в среде DMEM, дополненной 10% FBS и 1% / антимитотическому раствором антибиотика в культуре клеток инкубаторе. Принципиальная схема для сборки стружки и клеточного прикрепления показан на рисунке 3в.
   1. Заливка чип с PBS в течение 30 мин при 1 мкл / мин, а затем влить раствор фибронектина (50 мкг / мл в PBS, 1 мкл / мин) в течение 45 мин.
   2. Во время ожидания, Trypsinize культуры клеток с 0,25% трипсин-ЭДТА, промойте их в культуральной среде, центрифужные отдельных клеток, и восстановить суспензии клеток в предварительно нагретом (37 ° С) культуральной среде при 5x10 ⁶ клеток / мл.
   3. Заменить фибронектин раствора PBS и промывать чип при 10 мкл / мин в течение 5 мин.
   4. впрыскиватьПриготовленную суспензию клеток в чип, остановить поток, зажимать выходное отверстие, и поддерживать чип в культуре клеток инкубаторе в течение 30 мин.
   5. Освободить выходное отверстие и промывать чип с клеточной культуральной среде при 10 мкл / мин в течение 5 мин. Уменьшить скорость потока перфузионного культуральной среды до 0,75 мкл / мин и поддерживают культуру клеток в течение 2 ч в инкубаторе.

2. Поколение пузыря и визуализации потока

Примечание: Схема экспериментальной установки показана на рисунке 4а для генерации тандема пузырьков и взаимодействие полученного потока с одной клетки , выращенного рядом в микрожидком канале.

1. Генерация тандема пузырьков с двумя лазерами и управление синхронизацией
   1. Поместите микрожидкостных чип на сцене инвертированного микроскопа и выравнивать фокусов двух импульсных Nd: YAG лазеров (λ = 532 нм, 5 нс длительность импульса) на паре узорчатых золотых точек разделенных Ьу 40 мкм.
   2. Используйте генератор цифровой задержки для запуска двух лазеров с временной задержкой около 2,5 мкс, чтобы произвести два пузырька, инициированные на золотых точек.
   3. Регулировка выходной мощности лазера энергии (~ 10 мкДж), чтобы произвести максимальный диаметр пузырьков в пределах 50 ± 2 мкм.
   4. Синхронизировать камеру высокоскоростной (экспозиции 200 нс и 2 миллиона кадров в секунду (FPS)) для лазеров и захватить динамику расширения пузыря, коллапс, взаимодействие пузырь пузырь и формирования струи.
2. Количественное скорости струи
   1. Записывают положение струйного наконечника (J ₁₎ на проксимальном конце первого пузырька (В ₁₎ и дистальным концом B _1, начиная с генерации второго пузырька (B ₂₎ и заканчивая приземлением из J ₁ по направлению к дистальному концу B _1; см схему на рисунке 5а.
   2. Линейно подходят временной ход позиции для ботач проксимальный (струйного наконечника) и дистальные концы. Вычислить наклон положения зонда в зависимости от кривой времени для проксимального конца, чтобы определить скорость струи. Пересечение двух линий указывает время струи приземления. Более подробную информацию можно найти в работе 19.
3. Визуализация поля потока пузырьков индуцированный тандем
   1. Готовят 1 мкм из полистирола (PS) суспензионной в деионизированной воде (2,6% вес / объем) и вводят шарики в микрожидком микросхеме.
   2. Генерация пузырьков в тандеме, как описано в шаге 2.1.1-2.1.3.
   3. Запишите динамику тандема пузырь с помощью камеры высокоскоростного видео со скоростью формирования кадров 5 кадров в секунду M с временем экспозиции 100 нс.
   4. Загрузить полученную последовательность изображений в коммерческое программное обеспечение PIV.
   5. Разделите каждое изображение на более мелкие допроса окна размером 16 х 16 пикселей (точек) с 75% перекрытием.
   6. Применить многоходовую итерацию и региональные фильтры, чтобы уменьшить ошибки в вычислении поля скоростей ивыводить результаты в вектор скорости карты.

Рисунок 4: Схема экспериментальной установки и записи изображения. а) Экспериментальная установка для генерации тандем пузыря. б) последовательность времени , используемый для различных типов приобретениям изображений. FL: флуоресцентная микроскопия, BF: светлое поле, IFT: межкадрового время. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Одноклеточный Анализ и биоэффекты

Примечание: Тандем пузырь производится рядом с клетками-мишенями, и полученные биоэффекты изучаются в тупике расстояния-зависимым образом. Последовательность времени для различных типов изображений приобретений изображен на рисунке 4b.

1. Мембрана порации и макромолекулярная поглощение
   Примечание: Поглощение внеклеточных макромолекул в клетку-мишень характеризуется прогрессирующей диффузии йодида мембранного impermeant пропидиума (PI) через сайт порации на клеточной мембране.
   1. После стадии 1.5, заменить обычный культуральной среды (то есть, DMEM) с раствором PI (100 мкг / мл в DMEM) , работающей при скорости потока перфузионной 0,5 мкл / мин в течение всего эксперимента.
   2. Программирование программного обеспечения управления микроскоп для автоматического выбора PI флуоресцентного куб на вращающейся турели и синхронизировать синхронизацию ПЗС-камеры с PI возбуждения флуоресценции для захвата флуоресцентные изображения с временем экспозиции 200 мс.
   3. После того, как два лазерных фокусы совмещены с парой золотых точек рядом с клеткой-мишенью, записывать как светлого поля (BF) и флуоресценции (FL) изображений до лечения тандем пузыря.
   4. С помощью программного обеспечения управления микроскопом немедленноначать замедленную запись флуоресцентного изображения клетки-мишени вскоре после того, шаг 2.1, чтобы захватить историю поглощения PI.
2. Мембрана деформация
   1. Готовят 1 мкм бусин (1% вес / объем, активированные с растворимой в воде карбодиимида) и функционализации их с пептидом-2000 (100 мкг / мл в PBS).
   2. После стадии 1.5, инкубировать прикрепленные клетки с функционализованной бусинок при плотности 1x10 ⁹ бусин / мл при 37 ° С в течение 30 мин.
   3. Повторите шаг 2.1 для создания пузырьков в тандеме рядом с клеткой-мишенью и записывают деформацию клетки с камерой сверхвысокой скоростью работает со скоростью кадрирования 5 миллионов кадров в секунду.
   4. Идентифицировать триаду 3 бусинок , которые остаются на плоскости формирования изображений в течение всего эксперимента и обобщать их позиции в виде (х _1, у ₁₎ (X _2, Y _2), и (х _3, у ₃₎ в эксперименте координатах.
   5. Вычислить площадь триады до и афTer лечение тандем пузырьков с использованием формулы:
      
   6. Вычислить напряжение области, как:
      
   7. На основании координат трех вершин до и после обработки пузыря тандем, вычислить локальный главной деформации и зоны деформации в соответствии с установленными протоколами ^20,21.
3. Жизнеспособность и апоптозом
   Примечание: FITC аннексина V маркирует клетки, в том числе апоптотических из них, через экстернализации фосфатидилсерина (зеленой флуоресценции). PI метки ядер некротических клеток (красная флуоресценция). Светлое поле изображения используется для документирования морфологии клеток и для оказания помощи в выявлении жизнеспособности клеток и апоптоз.
   1. Запишите положение каждой обработанной клетки в микрожидкостных канале ( при содействии адресных меток в канале, рис 2b
   2. Выдержите обработанных клеток в клеточной культуральной среде в течение еще 2 ч до перфузируя чип с раствором ФИТЦ аннексина V в течение 15 мин. Положительные клетки отобразить зеленую флуоресценцию.
   3. Повторите шаг 3.3.2 через 24 ч после обработки тандемной пузыря для изучения долгосрочных биоэффектов в клетках-мишенях.
4. кальциевый ответ
   1. Смешайте 3 мкл фура-2 AM маточного раствора (1 мг / мл в ДМСО) с 3 мкл 10% вес / об Pluronic F-127 в 500 мкл среды уменьшенной сыворотки для получения конечного раствора маркировка (6 мкМ).
   2. После стадии 1.5, заменить среду для культивирования клеток с раствором маркировки и инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 40 мин (1 мкл / мин скорость перфузии).
   3. Залейте канал с пониженным сыворотки среде (0,75 мкл / мин скорость перфузии) перед началом эксперимента клетки.
   4. Начало логометрические изображений (длина волны: 340/380 нм, 50-мс экспозиции)клетки-мишени с использованием коммерческой системы PTI.
   5. После того, как 10 с логометрической визуализации клетки на уровне покоя, производят пузырьки в тандеме, как на стадии 2.1; Первая запись с временем межкадрового (IFT) 0,1 с в течение 1 мин, а затем увеличить IFT до 1 с в течение еще мин, а затем увеличивается до 5 с через 2 мин.
   6. С помощью программного обеспечения PTI, чтобы вычислить отношение R = F340 / F380 в интересующей области (ROI), который пропорционален концентрации внутриклеточного кальция.

Results

Микрожидкостных платформа описана в этой работе, может быть использован для изучения пузыря пузырь взаимодействий и анализировать различные кавитационных индуцированных биоэффектов на уровне одной клетки. Здесь мы приведем несколько примеров, демонстрирующих различные экспериментальных исследований и биопробы, которые могут быть выполнены в нашей экспериментальной системе. Сначала мы иллюстрировать переходные взаимодействия пузырьков тандеме с формирования струи, визуализации поля резуль...

Discussion

Анализ Одноклеточный, в сочетании с изображениями живых клеток, значительно расширило наше понимание динамических и часто переменных процессов в отдельных клетках, таких как развитие фенотипа и иммунного ответа ^23. В отличие от обычной клеточной культуры, в блюдах или баллонах, микрофлюидальные системы позволяют точно контролировать микросреды, вплоть до уровня одноклеточного, в реальном времени. Следовательно, прогресс в микрожидком технологии и методы в значительной степени улучшили пропускную способность и...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<сильный>Реагент/Материалы
75 мм x 38 мм Предметные стекла для микроскопа	Corning	2947-75X38
Ацетон	Sigma Aldrich, Co.	320110	ACS реагент, ≥ 99,5%
Изопропиловый спирт	Sigma Aldrich, Co.	W292907	≥ 99,7%, FCC, FG
Серная кислота	Sigma Aldrich, Co.	320501	Реагент ACS, 95,0-98,0%
Перекись водорода	Sigma Aldrich, Co.	216763	30 мас.% в H2O
Primer P-20	Microchem	MCC Primer 80/20
NFR фоторезист	JSR	NFR016D2
Фотошаблон	Фотоplotstore	N/A	4x4 Прямая запись маски
MF-319 Проявитель Shipley	(Rohm and Haas)	Microposit MF-319
1165 Средство для удаления фоторезиста	Dow Chemical, Co.	DEM-10018073	1-метил-2-пирролидинон на основе
фоторезиста S1813	Shipley (Rohm and Haas)	S1813
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
парафиновая пленка	HACH	251764
SU-2025 фоторезист	Microchem	SU-2025
PDMS	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0,5 кг
Трубка с микроотверстием	Saint-Gobain PPL Corp.	S-54-HL
Металлические штифты	New England Маленькая трубка	NE-1300-01	Отрезная трубка (прямая), 0.025" Наружный диаметр x 0,017 дюйма Внутренний диаметр x 0,50 дюйма Длинные
клетки HeLa	Duke Cell Culture Facility	(307-CCL-2) HeLa, p.148
DPBS (1x) буфер	ThermoFisher Scientific	14190144
среда для культивирования DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065
фибронектин бычьего белка, плазма	ThermoFisher Scientific	33010018
0,25% трипсин-ЭДТА (1x)	ThermoFisher Научный	25200056
Йодид пропидиума	ThermoFisher Scientific	P21493
Карбоксилатные микросферы 1.00  μ m	Polysciences, Inc	08226-15
Карбоксилатные микросферы 2.00  μ m	Polysciences, Inc	18327-10
EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид)	ThermoFisher Scientific	22980
Sulfo-NHS	Sulfo-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид)	24510
Peptite-2000	Advanced BioMatrix	5020-5MG
FITC Annexin V	ThermoFisher Scientific	A13199
Фура-2, AM	ThermoFisher Scientific	F1221
DMSO	Sigma Aldrich, Co.	D2650
F-127	invitrogen	P6866	0.2 µ m фильтрованный (10% раствор в воде)
Пониженное содержание сывороточных сред	ThermoFisher Scientific	11058021
Название	Company<	strong>Номер в каталоге	Комментарии<
>Оборудование
Плазменный асер	Emitech	K-1050X	O2 / Ар плазменное озоление фоторезист и другие органические материалы Маска
выравнивателя	SUSS MicroTec	Карл Сасс MA6/BA6
Электронно-лучевой испаритель	CHA Industries	Решение CHA Industries Электронный луч
RIE	Trion Technology	Трион Технолоджи Phantom II	(оксид/нитрид/полимер) травление
Стереоскоп	AmScope	Американский Микроскоп SM-4TZ-FRL	Стереомикроскоп
Шприцевой насос	Chemyx Inc	NanoJet
Инкубатор клеточных культур	NuAire	AutoFlow NU-8500 Водяная рубашка CO2 Инкубатор
Шкафы биологической безопасности	NuAire	NU-425-400
Водяная баня	VWR	1122s
Центрифуга	IEC	Centra CL2
Микроскоп	Zeiss	Axio Observer Z1
Nd:YAG лазер  (лазер 1)	Новая волна исследования	Tempest
Nd:YAG лазер  (лазер 2)	Новая волна исследования	Ориона
генератор задержки	Berkeley Nucleonics	BNC 565-8c
Лампа-вспышка	Dyna-Lite	ML1000 оптоволоконная лампа-вспышка
высокоскоростная камера	DRS Hadland	Высокоскоростная камера Imacon 200
камера	Shimadzu	HPV-X
	Высокоскоростная камера Vision Research	Phantom V7.3
PIV программное обеспечение	LaVision	DaVis 7.2
камера	Zeiss	AxioCam MRc 5
программное обеспечение	Zeiss	AxioVision
PTI система	Horiba	S/N: 1705 RAM-X
EasyRatio программное обеспечение	Horiba	Easy Ratio Pro 2	версии 2.3.125.86
63&крат; объектив	Zeiss	LD Plan Neofluar