Method Article

Микрожидком система с поверхности паттернирования для исследования кавитационного пузырька (ы) -клетка взаимодействия и результирующая биоэффектов на уровне одной клетки

DOI:

10.3791/55106

⸱

January 10th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University, 2Huacells Corp

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Был изготовлен микрофлюидный чип для производства пар золотых точек для создания тандемных пузырей и покрытых фибронектином островов для структурирования одиночных клеток поблизости. Полученное поле потока было охарактеризовано с помощью скорости изображения частиц и использовано для изучения различных биологических эффектов, включая порацию клеточных мембран, деформацию мембраны и внутриклеточную реакцию кальция.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи, мы сначала опишем протокол изготовления микрожидком чипа, с золотыми точками и фибронектина покрытием областей на той же стеклянной подложке, которая точно контролирует образование пузырьков тандемных и отдельных клеток узорчатых рядом с хорошо определенными местах и ​​форм. Затем демонстрируют генерацию пузырьков тандеме с использованием двух импульсных лазеров, освещающие пару золотых точек с задержкой по времени несколько микросекунд. Мы визуализировать взаимодействие пузырь пузырь и формирование струи изображений высокой скорости и характеризуют поле результирующего потока с использованием велосиметрии изображения частиц (PIV). И, наконец, мы приведем некоторые применения этого метода для анализа отдельных клеток, включая клеточную мембрану порации с макромолекулы поглощения, локализованной деформации мембраны определяется смещениями присоединяемых интегрином связывания шариков и внутриклеточной реакции кальция из логометрической визуализации. Наши результаты показывают, что быстрый и направленный поток струйное является прообразуемых при взаимодействии тандем пузырь, который может наложить высоколокализованной напряжение сдвига на поверхности клетки, выращенные в непосредственной близости. Кроме того, различные биоэффекты можно индуцировать путем изменения силы потока нагнетаемой регулируя расстояние STANDOFF от кюветы до пузырьков тандема.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует растущее признание того, что клеточная гетерогенность, возникающие в связи с стохастической экспрессии генов, белков и метаболитов, существует в большой популяции клеток и служит основополагающим принципом в биологии , чтобы позволить адаптации и эволюции 1 клеток. Поэтому часто неточны и ненадежны использовать объемные измерения на уровне всего населения для понимания функции отдельных клеток и их взаимодействий. Разработка новых технологий для анализа одноклеточного поэтому представляет большой интерес в биологических и фармакологических исследований, и может быть использовано, например, чтобы лучше понять ключевые сигнальные пути и процессы в....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. микротехнологий

Примечание: Все процедуры микротехнологий выполняются в чистом помещении. Хромированная маска предназначена до микротехнологий, смотри Рисунок 2.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Схема конструкции канала в микрожидком чипа и размеры рабочих органов. а) Маска дизайн выровненных микроканалов PDMS (зеленый) и узоры на стеклянной подложке (синий и красный). б) Увеличенное изображение конструкции маски в репрезентативной части рабочего ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микрожидкостных платформа описана в этой работе, может быть использован для изучения пузыря пузырь взаимодействий и анализировать различные кавитационных индуцированных биоэффектов на уровне одной клетки. Здесь мы приведем несколько примеров, демонстрирующих различные экспериментальных исследований и биопробы, которые могут быть выполнены в нашей экспериментальной системе. Сначала мы иллюстрировать переходные взаимодействия пузырьков тандеме с формирования струи, визуализации поля резуль.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ Одноклеточный, в сочетании с изображениями живых клеток, значительно расширило наше понимание динамических и часто переменных процессов в отдельных клетках, таких как развитие фенотипа и иммунного ответа 23. В отличие от обычной клеточной культуры, в блюдах или баллонах, микрофлюидальные системы позволяют точно контролировать микросреды, вплоть до уровня одноклеточного, в реальном времени. Следовательно, прогресс в микрожидком технологии и методы в значительной степени улучшили пропускную способность и.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы отметить использование чистой комнаты SMIF в Университете Дьюка. Мы также хотим поблагодарить Хао Цяна за его помощь в измерении скорости струи. Авторы благодарят Тодда Рамбо из Hadland Imaging за предоставление камеры Shimadzu HPV-X, используемой в этом исследовании. Работа была частично профинансирована NIH через гранты 5R03EB017886-02 и 4R37DK052985-20.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<сильный>Реагент/Материалы
75 мм x 38 мм Предметные стекла для микроскопаCorning2947-75X38
АцетонSigma Aldrich, Co.320110ACS реагент, ≥ 99,5%
Изопропиловый спиртSigma Aldrich, Co.W292907≥ 99,7%, FCC, FG
Серная кислотаSigma Aldrich, Co.320501Реагент ACS, 95,0-98,0%
Перекись водородаSigma Aldrich, Co.21676330 мас.% в H2O
Primer P-20MicrochemMCC Primer 80/20
NFR фоторезистJSRNFR016D2
ФотошаблонФотоplotstoreN/A4x4 Прямая запись маски
MF-319 Проявитель Shipley(Rohm and Haas)Microposit MF-319
1165 Средство для удаления фоторезистаDow Chemical, Co. DEM-100180731-метил-2-пирролидинон на основе
фоторезиста S1813Shipley (Rohm and Haas)S1813
PLL-g-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPESThermoFisher Scientific15630080
парафиновая пленкаHACH251764
SU-2025 фоторезистMicrochemSU-2025
PDMSDow Corning184 SIL ELAST KIT 0,5 кг
Трубка с микроотверстиемSaint-Gobain PPL Corp.S-54-HL
Металлические штифтыNew England Маленькая трубкаNE-1300-01Отрезная трубка (прямая), 0.025" Наружный диаметр x 0,017 дюйма Внутренний диаметр x 0,50 дюйма Длинные
клетки HeLaDuke Cell Culture Facility(307-CCL-2) HeLa, p.148
DPBS (1x) буферThermoFisher Scientific14190144
среда для культивирования DMEMThermoFisher Scientific11995065
фибронектин бычьего белка, плазмаThermoFisher Scientific33010018
0,25% трипсин-ЭДТА (1x)ThermoFisher Научный25200056
Йодид пропидиумаThermoFisher ScientificP21493
Карбоксилатные микросферы 1.00  μ mPolysciences, Inc08226-15
Карбоксилатные микросферы 2.00  μ mPolysciences, Inc18327-10
EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид)ThermoFisher Scientific22980
Sulfo-NHSSulfo-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид)24510
Peptite-2000Advanced BioMatrix5020-5MG
FITC Annexin VThermoFisher ScientificA13199
Фура-2, AMThermoFisher ScientificF1221
DMSOSigma Aldrich, Co.D2650
F-127invitrogenP68660.2 µ m фильтрованный (10% раствор в воде)
Пониженное содержание сывороточных сред ThermoFisher Scientific11058021
НазваниеCompany<strong>Номер в каталогеКомментарии<
>Оборудование
Плазменный асерEmitechK-1050XO2 / Ар плазменное озоление фоторезист и другие органические материалы Маска
выравнивателяSUSS MicroTec Карл Сасс MA6/BA6
Электронно-лучевой испарительCHA IndustriesРешение CHA Industries Электронный луч
RIETrion Technology Трион Технолоджи Phantom II(оксид/нитрид/полимер) травление
СтереоскопAmScopeАмериканский Микроскоп SM-4TZ-FRLСтереомикроскоп
Шприцевой насосChemyx IncNanoJet
Инкубатор клеточных культурNuAireAutoFlow NU-8500 Водяная рубашка CO2 Инкубатор
Шкафы биологической безопасностиNuAireNU-425-400
Водяная баняVWR1122s
ЦентрифугаIECCentra CL2
МикроскопZeissAxio Observer Z1
Nd:YAG лазер  (лазер 1)Новая волна исследованияTempest
Nd:YAG лазер  (лазер 2)Новая волна исследованияОриона
генератор задержкиBerkeley Nucleonics BNC 565-8c
Лампа-вспышкаDyna-LiteML1000 оптоволоконная лампа-вспышка
высокоскоростная камераDRS Hadland  Высокоскоростная камера Imacon 200
камераShimadzuHPV-X
Высокоскоростная камера Vision ResearchPhantom V7.3
PIV программное обеспечениеLaVisionDaVis 7.2
камераZeissAxioCam MRc 5
программное обеспечениеZeissAxioVision
PTI системаHoribaS/N: 1705 RAM-X
EasyRatio программное обеспечениеHoribaEasy Ratio Pro 2версии 2.3.125.86
63&крат; объективZeissLD Plan Neofluar
strong, Высокоскоростная

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
  2. Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
  3. Gossett,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic SystemSurface PatterningCavitation BubbleTandem BubblesSingle Cell AnalysisHigh Speed ImagingParticle Image VelocimetryCell Membrane PorationIntracellular Calcium ResponseGold Dot Patterning

Related Articles