Был изготовлен микрофлюидный чип для производства пар золотых точек для создания тандемных пузырей и покрытых фибронектином островов для структурирования одиночных клеток поблизости. Полученное поле потока было охарактеризовано с помощью скорости изображения частиц и использовано для изучения различных биологических эффектов, включая порацию клеточных мембран, деформацию мембраны и внутриклеточную реакцию кальция.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Микрожидком система с поверхности паттернирования для исследования кавитационного пузырька (ы) -клетка взаимодействия и результирующая биоэффектов на уровне одной клетки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этой рукописи, мы сначала опишем протокол изготовления микрожидком чипа, с золотыми точками и фибронектина покрытием областей на той же стеклянной подложке, которая точно контролирует образование пузырьков тандемных и отдельных клеток узорчатых рядом с хорошо определенными местах и форм. Затем демонстрируют генерацию пузырьков тандеме с использованием двух импульсных лазеров, освещающие пару золотых точек с задержкой по времени несколько микросекунд. Мы визуализировать взаимодействие пузырь пузырь и формирование струи изображений высокой скорости и характеризуют поле результирующего потока с использованием велосиметрии изображения частиц (PIV). И, наконец, мы приведем некоторые применения этого метода для анализа отдельных клеток, включая клеточную мембрану порации с макромолекулы поглощения, локализованной деформации мембраны определяется смещениями присоединяемых интегрином связывания шариков и внутриклеточной реакции кальция из логометрической визуализации. Наши результаты показывают, что быстрый и направленный поток струйное является прообразуемых при взаимодействии тандем пузырь, который может наложить высоколокализованной напряжение сдвига на поверхности клетки, выращенные в непосредственной близости. Кроме того, различные биоэффекты можно индуцировать путем изменения силы потока нагнетаемой регулируя расстояние STANDOFF от кюветы до пузырьков тандема.
Введение
Существует растущее признание того, что клеточная гетерогенность, возникающие в связи с стохастической экспрессии генов, белков и метаболитов, существует в большой популяции клеток и служит основополагающим принципом в биологии , чтобы позволить адаптации и эволюции 1 клеток. Поэтому часто неточны и ненадежны использовать объемные измерения на уровне всего населения для понимания функции отдельных клеток и их взаимодействий. Разработка новых технологий для анализа одноклеточного поэтому представляет большой интерес в биологических и фармакологических исследований, и может быть использовано, например, чтобы лучше понять ключевые сигнальные пути и процессы в....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. микротехнологий
Примечание: Все процедуры микротехнологий выполняются в чистом помещении. Хромированная маска предназначена до микротехнологий, смотри Рисунок 2.
Рисунок 2: Схема конструкции канала в микрожидком чипа и размеры рабочих органов. а) Маска дизайн выровненных микроканалов PDMS (зеленый) и узоры на стеклянной подложке (синий и красный). б) Увеличенное изображение конструкции маски в репрезентативной части рабоч....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Микрожидкостных платформа описана в этой работе, может быть использован для изучения пузыря пузырь взаимодействий и анализировать различные кавитационных индуцированных биоэффектов на уровне одной клетки. Здесь мы приведем несколько примеров, демонстрирующих различные экспериментальных исследований и биопробы, которые могут быть выполнены в нашей экспериментальной системе. Сначала мы иллюстрировать переходные взаимодействия пузырьков тандеме с формирования струи, визуализации поля резуль.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Анализ Одноклеточный, в сочетании с изображениями живых клеток, значительно расширило наше понимание динамических и часто переменных процессов в отдельных клетках, таких как развитие фенотипа и иммунного ответа 23. В отличие от обычной клеточной культуры, в блюдах или баллонах, микрофлюидальные системы позволяют точно контролировать микросреды, вплоть до уровня одноклеточного, в реальном времени. Следовательно, прогресс в микрожидком технологии и методы в значительной степени улучшили пропускную способность и.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы отметить использование чистой комнаты SMIF в Университете Дьюка. Мы также хотим поблагодарить Хао Цяна за его помощь в измерении скорости струи. Авторы благодарят Тодда Рамбо из Hadland Imaging за предоставление камеры Shimadzu HPV-X, используемой в этом исследовании. Работа была частично профинансирована NIH через гранты 5R03EB017886-02 и 4R37DK052985-20.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильный>Реагент/Материалы | |||
| 75 мм x 38 мм Предметные стекла для микроскопа | Corning | 2947-75X38 | |
| Ацетон | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS реагент, ≥ 99,5% |
| Изопропиловый спирт | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥ 99,7%, FCC, FG |
| Серная кислота | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | Реагент ACS, 95,0-98,0% |
| Перекись водорода | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 мас.% в H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR фоторезист | JSR | NFR016D2 | |
| Фотошаблон | Фотоplotstore | N/A | 4x4 Прямая запись маски |
| MF-319 Проявитель Shipley | (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Средство для удаления фоторезиста | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-метил-2-пирролидинон на основе |
| фоторезиста S1813 | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| парафиновая пленка | HACH | 251764 | |
| SU-2025 фоторезист | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0,5 кг | |
| Трубка с микроотверстием | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Металлические штифты | New England Маленькая трубка | NE-1300-01 | Отрезная трубка (прямая), 0.025" Наружный диаметр x 0,017 дюйма Внутренний диаметр x 0,50 дюйма Длинные |
| клетки HeLa | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) буфер | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| среда для культивирования DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| фибронектин бычьего белка, плазма | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0,25% трипсин-ЭДТА (1x) | ThermoFisher Научный | 25200056 | |
| Йодид пропидиума | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Карбоксилатные микросферы 1.00 μ m | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Карбоксилатные микросферы 2.00 μ m | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Фура-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µ m фильтрованный (10% раствор в воде) |
| Пониженное содержание сывороточных сред | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Название | Company< | strong>Номер в каталоге | Комментарии< |
| >Оборудование | |||
| Плазменный асер | Emitech | K-1050X | O2 / Ар плазменное озоление фоторезист и другие органические материалы Маска |
| выравнивателя | SUSS MicroTec | Карл Сасс MA6/BA6 | |
| Электронно-лучевой испаритель | CHA Industries | Решение CHA Industries Электронный луч | |
| RIE | Trion Technology | Трион Технолоджи Phantom II | (оксид/нитрид/полимер) травление |
| Стереоскоп | AmScope | Американский Микроскоп SM-4TZ-FRL | Стереомикроскоп |
| Шприцевой насос | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Инкубатор клеточных культур | NuAire | AutoFlow NU-8500 Водяная рубашка CO2 Инкубатор | |
| Шкафы биологической безопасности | NuAire | NU-425-400 | |
| Водяная баня | VWR | 1122s | |
| Центрифуга | IEC | Centra CL2 | |
| Микроскоп | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG лазер (лазер 1) | Новая волна исследования | Tempest | |
| Nd:YAG лазер (лазер 2) | Новая волна исследования | Ориона | |
| генератор задержки | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Лампа-вспышка | Dyna-Lite | ML1000 оптоволоконная лампа-вспышка | |
| высокоскоростная камера | DRS Hadland | Высокоскоростная камера Imacon 200 | |
| камера | Shimadzu | HPV-X | |
| Высокоскоростная камера Vision Research | Phantom V7.3 | ||
| PIV программное обеспечение | LaVision | DaVis 7.2 | |
| камера | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| программное обеспечение | Zeiss | AxioVision | |
| PTI система | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio программное обеспечение | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | версии 2.3.125.86 |
| 63&крат; объектив | Zeiss | LD Plan Neofluar |
Ссылки
- Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
- Gossett,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
