Методическая статья

Мониторинг экзоцитоз реактивности и распространения в Vitro условиях ишемии как

DOI:

10.3791/55108

⸱

21 октября 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical Sciences, Campus, University of Puerto Rico

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ишемического инсульта является трудным для изучения сложных событий, в котором конкретный вклад астроциты в регионе пострадавших мозга воздействию кислорода глюкозы (OGD). Эта статья знакомит методологию для получения изолированных астроциты и изучить их реактивность и распространения OGD условиях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ишемический инсульт является сложный мозга травмы, вызванные тромба или эмболии, препятствующих приток крови к части мозга. Это приводит к лишению кислорода и глюкозы, который вызывает энергии неудачи и нейрональных смерти. После ишемического инсульта инсульт астроциты стать реактивной и распространяться вокруг места повреждения, как она развивается. Согласно этому сценарию трудно изучить конкретный вклад астроциты подвержена ишемии мозга регионе. Таким образом эта статья знакомит методологии для изучения первичного экзоцитоз реактивности и распространения в рамках модели в vitro ишемии как окружающей среды, называется глюкоза лишение кислорода (OGD). Астроциты были изолированы от 1-4 дня-старый новорожденных крыс и количество неспецифические Астроцитарная клеток была оценена с помощью экзоцитоз селективного маркер глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) и ядерных окрашивания. Можно настроить период, в котором астроциты подвергаются OGD состояния, а также процент кислорода, которым они подвергаются. Эта гибкость позволяет ученым охарактеризовать продолжительность ишемического как условие в различных группах клеток в пробирке. Эта статья обсуждает таймфреймы OGD, побудить экзоцитоз реактивности, гипертрофический морфологии и распространения как измеряется иммунофлюоресценции с помощью расползанию ядерного антигена клеток (PCNA). Помимо распространения астроциты пройти энергии и окислительного стресса и реагировать OGD, выпустив растворимых факторов в среду клетки. Это средство можно собирается и используется для анализа влияния, выпущенный астроциты в первичной нейрональных культур без ячеек для взаимодействия молекул. В целом эта модель культуры главной ячейки может использоваться эффективно понять роль изолированных астроциты после травмы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инсульта определяется как «острый неврологической дисфункции сосудистого происхождения с внезапным или быстрое развитие симптомов и признаков, соответствующего участия областей в мозге»1,2. Существует два типа инсульта: геморрагический и ишемический. При сосудистой дисфункции является причиной аневризмы или артериовенозных неисправности, сопровождается ослаблением с задней разрывом артерии, это называется геморрагического инсульта3 , которая, в большинстве случаев, приводит к смерти. Когда тромб или эмболии препятствует кровотока, вызывая временное лишение кислорода и глюкозы в области мозга, это называется ишемического инсульта4. Неспособность питают клетки вокруг пораженной области или ишемического ядра приводит к гомеостаза и метаболического дисбаланса, энергичный дисфункции, нейронов смерти и воспаление5, который может побудить пожизненной инвалидности для пациентов6.

Ишемический инсульт является многофакторной травмы с участием нескольких типов клеток, которые реагируют и приложить их последствия в различных временных точках. Многие взаимодействия создают сложную обстановку для изучения поведения отдельных клеток. Итак как мы изучаем вклад типа конкретной ячейки в такой сложной среде? Принятыми в vitro модель ишемии состоит из подвергая клетки к лишению кислорода и глюкозы (OGD), за определенный период, после восстановления клеток в нормоксические среде. Эта система имитирует ишемического инсульта следуют крови реперфузии. В этом методе клетки или ткани подвергаются глюкозы свободных средств массовой информации в среде, очищены от кислорода, с помощью специализированной гипоксических камеры. Время инкубации OGD может варьироваться от нескольких минут до 24 часов, в зависимости от гипотезы, что хочет быть протестированы. Исследования показали, что в зависимости от времена OGD и нормоксические среды, конкретных фенотипов инсульта (т.е., острой и подострой) может быть достигнуто. Первичный изолированных астроциты, подвергается OGD с задней реставрации нормоксические условий, является хорошо изученных сотовой модель для имитации инсульта в пробирке7. С помощью OGD можно выявить независимых молекулярные механизмы изолированных клеток под инсульта-среде.

Как наши знания биологии экзоцитоз увеличивается, становится очевидным, что они имеют решающее значение для поддержания синапсов и поддержания для ремонта, развития и пластичности нейронных8. В нормальных условиях астроциты релиз и реагировать цитокины, chemokines, факторы роста и gliotransmitters, сохраняя Метаболик баланс и гомеостаза в синапсах5,9. В острых neuroinflammation, таких как ишемического инсульта эти клетки могут стать реактивной, показать долгосрочный гиперэкспрессия глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) и показать гипертрофия в их морфология5,10, 11 , 12. по мере ишемический инфаркт гомеостаза, предоставляемые астроциты становится пострадавших, относительно нормальной глутамата поглощения, энергетический метаболизм, Обмен активных молекул и антиоксидантной активности13.

Возобновленные астроциты размножаться вокруг инфаркте ткани, а Лейкоциты мигрируют к пораженного области14. Астроцитарная распространения может быть измерена с помощью маркеров пролиферирующих клеток ядерного антигена (PCNA), Ki67 и Бромдезоксиуридин (BrdU)15. Этот пролиферативной ответ генерируется в зависимости от времени, и это помогает, образуя глиальный рубец, массив необратимо реактивной астроциты вдоль паренхиме поврежденного участка после травмы9. Одна из первоначальных функций этот шрам заключается в ограничении иммунных клеток кровоподтек из этой области. Однако исследования показали, что шрам становится физическое препятствие для аксоны продлить, как они выпустят молекул, ингибирующих аксональное рост, и создать физический барьер предотвращая расширение вокруг травмированного участка16аксоны. Тем не менее есть научные доказательства того, что после травмы спинного мозга, полностью предотвращения глиальных рубцов может ухудшить регенерации аксоны17. Таким образом контекст, в котором измеряется конкретными Астроцитарная ответ, должны рассматриваться на рамках изучал травмы.

Представлена методология может применяться для изучения индивидуального функции астроциты после кислорода глюкозы, и он может быть изменен в зависимости от которых следователь хочет ответить на вопросы. Например, помимо морфологических изменений и маркеры, выраженные в разные времена OGD, supernatants от астроциты, подвергается OGD могут быть далее проанализированы для определения растворимых факторов выпущенное эти клетки, или использоваться в качестве условных СМИ для оценки ее эффект в другие клетки мозга. Этот подход позволяет исследования на реактивность экзоцитоз, которая могла привести к выяснение факторов, которые регулируют и модулировать их ответ в случае ишемического инсульта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

постнатального крысы (Sprague-Dawley) 1-4 дней старый используются для изоляции коре. Метод эвтаназия является обезглавливание, утвержденными руководящими принципами NIH.

1. Подготовка инструменты и материалы для хирургии

  1. Стерилизируй-отпусти инструментов в автоклаве (температура: 121 ° c, давление: 15 psi, время: 30 минут) с помощью стальной коробке или мгновенное уплотнения мешок стерилизации. Смотрите материалы в Таблице материалах.

2. Завершить подготовку DMEM

  1. в один литр стакан, содержащие газобетона 700 мл воды, добавить Дульбекко ' s Modified Eagle ' s Средний порошок при комнатной температуре.
  2. Добавить бикарбонат натрия 3,7 г/Л, в то время как решение перемешивают с магнитной мешалкой.
  3. Регулировка рН 7,4, газобетона водой довести объем до 1 L, а затем фильтр. Для целей культуры, дополнить требуемый объем средств массовой информации с 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина и тепло в 37 градусов. Смотрите материалы в Таблице материалах.
    Примечание: PH была скорректирована до 7,4 через вставки электроды рН в средствах массовой информации. Средства массовой информации должны помешивая, затем медленно добавить 1 M NaOH с помощью капельницы.

3. Основная экзоцитоз культуры

Примечание: после посева, ячейки СМИ должны быть изменены каждые три дня и клетки может быть выращен до confluency (11-13 дней). На третий день, коснитесь фляга несколько раз для подъема Микроглии клеток и клеток-предшественников Олигодендроциты от культуры, удалите все ' старый ' СМИ, мыть дважды с помощью 10 мл PBS, аспирационная PBS, затем добавить свежие новые средства массовой информации. Смотрите материалы в Таблице материалах.

  1. Рассечение мозга новорожденных крыс
    1. выполнения диссекции в культуре ткани капюшоном. Получить 1-4 дней старый новорожденных крыс щенков (2 крысы мозги используются за флакон 75 см 2).
    2. Подготовить три чашки Петри 60 мм и Пипетка 5 мл полного DMEM на каждом.
      Примечание: Они могут быть разделены следующим образом: #1 для каждого крыса мозга, #2 для всех коре мозга и #3 для всех очищенные коре (без мозговых оболочек).
    3. Понять щенка и спрей с 70% этиловом спирте. Обезглавить его и отбросить тела в контейнер для отходов небольшой biohazard.
    4. С помощью пинцета микро секционный, держать голову и вырезать кожу на верхней части головы подвергать черепной коробки.
    5. С другой парой ножницы, сделать " Т " разрез, начиная от задней части черепа к носу. Используйте пару щипцами осторожно удалить черепа.
    6. Удалить подвергаются мозга с парой пинцетом и место в одном из Петри, ранее заполнены с среднего мозга.
    7. Использовать другой набор стерильных инструментов для последующих шагов.
    8. Использовать микро Рассекающий щипцами осторожно поместить один мозг на крышке Перевернутый Петри 60 мм. Когда Петри помещается на стерильную марлю, это возможно для просмотра мозга четко и это проще вскрыть.
    9. Устойчивый мозга с микро Рассекающий щипцами и отделить полушарие головного мозга, мягко теребят вдоль срединной щели с острым концом микро Рассекающий щипцами.
    10. Deflect и пил коре, оставив позади белого вещества и передавать их на чашку Петри, ранее помечены #2. Повторите эту процедуру для всех мозги, объединяя все расчлененных коре в Петри помечены #2.
    11. Возьмите гиппокамп из под каждого коры и отказаться от него.
    12. Использовать микро Рассекающий пинцета и Петри 60 мм аккуратно чистить мозговых оболочек от отдельных корковых лопастями и поместить их в чашке Петри помечены #3.
  2. Диссоциации ткани: Гомогенизатор блендер метод
    1. налить ткани/средний подвеска (очищенные коре головного мозга) в мешок стерильный блендере и добавить достаточно среднего довести общий объем в мешке до 5 мл.
    2. Место мешок в блендере гомогенизатор, оставив примерно 2 см мешок видна над закрытую дверь. Диссоциации клеток осуществляется в течение 2,5 мин на высокой скорости.
      Примечание: Кроме того это можно сделать путем закрытия мешок и аккуратно стучать со стаканом в капюшоне. Убедитесь в том использовать ткань между мешок и стакан, чтобы избежать трения.
    3. Налить суспензию клеток в число 60 сетки сито, а затем налить отфильтрованной через поток на номер 100 сито, что позволяет фильтровать самотеком.
    4. С помощью 15 мл пробирок, центрифуга суспензию клеток на 200 x g в клинических центрифуги (предпочтительно качели ведро ротор) за 5 мин.
    5. Слейте супернатант в стакан, а затем с помощью Серологические Пипетки, вновь приостановить и разъединять Пелле клеток в максимум 5 мл СМИ.
  3. Подсчет клеток
    1. с микропипеткой, собирать 100 мкл суспензии клеток в пробки microcentrifuge 1,5 мл и 100 мкл Трипановый синий.
    2. Вставить 10 мкл собранная подвеска в Горяева и рассчитывать все клетки, которые являются жизнеспособными в четырех углах площади.
    3. Формулы для расчета плотности клеток перед подготовкой колбы являются:
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
    4. Добавить по крайней мере 500 000 ячеек на колбу 25 см 2. Пипетка до 5 мл DMEM в каждый флакон. Смесь не должен доходить до шеи колбу. Поместите их в инкубаторе 37 ° C на 5% CO 2, на 3 дня, затем измените СМИ.
  4. Методов очистки экзоцитоз: СМИ, механические и химические стратегии для изменения
    Примечание: скорость метаболизма астроциты является высоким по сравнению с другими типами клеток, таким образом, в питательной лишен условий, эти клетки показывают низкой выживаемости после нескольких дней. В отличие от астроциты микроглии не подвержены недостатке питания и размножаться в таких средах 18. Чтобы сохранить ограниченное количество Микроглии клеток, авторы изменить СМИ культуры клеток астроглиальных каждые 3 дня. Это постоянное изменение ячейки СМИ также уменьшит микроглии населения, которые могут расти на вершине Астроцитарная клетки однослойная в колбу 19.
    1. Использования Пастер пипетку для аспирационная СМИ с non сторонник Микроглии клеток от каждого из колбы. Вымойте любой мусор оставил с помощью стерильной фильтрации PBS для каждого из колбы в духе прикапывают (5 мл/колба).
    2. Добавить стерильной фильтрации DMEM (с антибиотиком и плода бычьим сывороточным) каплям каждый флакон (5 мл/колба). Аккуратно агитировать в круговое движение, чтобы покрыть всю поверхность.
    3. Место клетки в 37 ° C инкубатор на 5% CO 2 на 8-10 дней колбы до confluency (> плита покрытие 95%).
      Примечание: Несколько протоколов показали, что когда астроциты достигают confluency, механические методы, такие как сотрясение культуры от 2 до 24 ч, приводит к отряд клеток, которые лежат на вершине этих астроциты, главным образом Микроглия и прекурсоров клетки 19 ,- 20.
    4. Non Астроцитарная клетки уменьшаются в культуре, выполняя орбитальных встряхивания на 180 об/мин за 30 мин. После удаления клеток в надосадке, свежие СМИ накапаны в колбу (~ 15 мл).
    5. Для устранения клетки-предшественники олигодендроциты, увеличить пожимая скорость до 200 об/мин для 6 h 21 , 22 , 23, аспирационная супернатант и свежие СМИ накапайте.
      Примечание: Чтобы уменьшить присутствие микроглии в культурах, два химические методы могут использоваться последовательно (не одновременно) в методологии культуры главной ячейки: арабинозы цитозином (Ara-C) и L-лейцина метил Эстер (LME) 24.
    6. Сразу, когда клетки достигают confluency (100%), 3-4 дней после механического удаления микроглии, эти клетки можно лечить с помощью 8 мкм antimitotic составные арабинозы цитозином (Ara-C) в среде DMEM на 5 дней (изменение ежедневно свежие Ara-c в среде DMEM).
      Примечание: Момент времени для добавления Ara-C имеет решающее значение, поскольку это соединение является antimitotic наркотиков, что уменьшает количество быстро делящиеся клетки микроглии 19 , 25 и фибробласты 26 . В отличие от микроглии, когда вырожденная, астроциты остановить пролиферирующих через контакт ингибирование 27.
    7. 2 дней для клетки, чтобы оправиться от лечения Ара-С.
    8. Для дальнейшего сокращения загрязнения микроглии, после того, как клетки достичь confluency, используйте 50 мм L-лейцина метилового эфира (КМЭ) в среде DMEM зафиксировано на рН 7,4, за 1 ч при 37 ° c.
      Примечание: LME кресты мембраны клеток и органелл, и после гидролизованный, L-лейцина производится накапливается в лизосомы этих клеток. Накопление этой аминокислоты приводит к осмотической припухлость и разрыв лизосом 28 , 29. LME является весьма эффективным на ликвидацию микроглии, по сравнению с другими клетками 20 , 30.

4. Астроциты в пластины 6-ну культивировать

  1. coverslips покрытие с поли D-лизин
    1. coverslip положить один в каждом 35 мм Петри, затем 100 мкл разбавленного поли-D-лизин решения каждой coverslip и ждать 1 ч.
    2. Удаление поли-D-лизин и мыть дважды с 2 мл стерильной воды.
    3. Удаление воды и ждать coverslips сухой внутри вытяжки. Хранить coverslips при-20 ° C до двух недель.
      Примечание: Заморозить разбавленный раствор поли-D-лизин; Он может храниться до двух недель.
  2. Trypsinization
    1. с помощью пипетки Пастера, аспирационная среднего из колбы. Добавьте 5 мл/настой стерильной фильтрации PBS аккуратно прополоскать клетки.
    2. Аспирата выключить PBS и затем добавьте 5 мл/колба стерильной фильтрации 0,25% трипсина и 0,5 мм раствора ЭДТА. Место колбу в 37 ° c, 5% CO 2 инкубатора для 10 мин
      Примечание: В то время как инкубации клеток, теплый 5 мл/настой свежих полный DMEM 37 ° C.
    3. После 10 минут инкубации, агитировать чтобы убедиться, что все клетки снять колбу. Быстро добавить 5 мл теплой полный DMEM каждый флакон, чтобы нейтрализовать трипсина.
    4. Нежно Пипетка клетки вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить любой " кусты ". Передать 15 мл конические центрифуги подвесные клетки из двух колб.
    5. Центрифуги для 5 минут при 200 x g для сбора клеток Пелле. Вновь приостановить гранулы в 500 мкл среднего и приступить к место клеток в колбах.
      Примечание: Примеры анализа с клеток: 1) обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР) для анализа экспрессии генов; 2) западную помарку для оценки выражения протеина; 3) потока cytometry анализ квантифицировать количество нейронных прогениторных клеток и белков интерес; 4) иммунофлюоресценции для анализа выражения протеина и локализации.
  3. Посев астроциты
    1. после лечения первичной астроциты с трипсина (см. 4.2), собирать 100 мкл суспензии клеток в пробки microcentrifuge 1,5 мл и добавить 0,5% Трипановый синий 100 мкл.
    2. Добавить 10 мкл собранных подвески в Трипановый синий Горяева и рассчитывать все клетки, которые являются жизнеспособными.
    3. Использовать формулы в шаге 3.3 вычислить плотность клеток перед подготовкой колб.
    4. Подготовка многоскважинных блюда, добавив одну стерильные, поли D-лизин с покрытием coverslip для каждой скважины. Пипетка 50 000 ячеек и заполнить остальные тома в каждом несколькими хорошо блюдо со свежими средний (примерно 2 мл).
    5. Поместить несколько хорошо блюда в 37 градусов инкубатор на 5% CO 2, и после 5-7 дней, астроциты могут расти и покрывают всю поверхность coverslips.

5. OGD протокол для первичного астроциты

  1. OGD средней подготовки
    1. дополнение Дульбекко ' s изменение орел ' s средне свободной глюкозы с бикарбонатом натрия 3,7 г/Л и 1% пенициллина/стрептомицина. Смотрите материалы в таблице 4.
    2. Очистить 20 мл среды свободной глюкозы, восходящей с 95% N 2 / 5% CO 2 10 мин на поток 15 Л/мин (обозначается расходомер), вставив Серологические Пипетки к газовой системе в средне-и.
      Примечание: После продувки среднего кислорода, регулировка рН на 7,4 (см. Примечание на шаг 2.1).
    3. Фильтр очищенных свободной глюкозы среднего, используя систему фильтров 50 мл трубки.
      Примечание: Сделать свежий OGD среднего для каждого эксперимента, восходящей с 95% N 2 / 5% CO 2 перед использованием, чтобы обеспечить, что клетки подвергаются очистке кислорода среды.
  2. Экспериментальная процедура
    1. внутри вытяжки культуры ткани, удалите экзоцитоз СМИ из ранее подготовленных coverslips (обратитесь к шагу 4.3.5) и мыть с сотовой PBS дважды, чтобы удалить любые глюкозы в клетки.
    2. Добавить 2 мл OGD СМИ каждому хорошо и место несколько хорошо блюда в камере гипоксии с их крышками выкл
    3. Подключение газовой смеси на входе клапан и оставить открытым выход клапана. Потолочные камеры с газовой смесью из 95% N 2 / 5% CO 2, 15 Л/мин за 5 мин
    4. Остановить поток газа и сначала близко зажим на выходе клапана, а затем закройте зажим на трубке клапан входа газа.
      Примечание: Убедитесь, что есть нет утечки газа, покрывая печать камеры с мыльной водой. Если печать является безопасным, должно образовываться никаких пузырей.
    5. Поместить всю камеру в инкубатор культуры клеток при 37 ° C, 1 часа или 6 h в OGD.
    6. После того, как закончится время инкубации, аспирационная OGD СМИ и тщательно пипетки 2 мл полного DMEM каждый 4.67 см 2 хорошо для нормоксические процесса 24 h.

6. Протокол для первичной подготовки иммунофлюоресценции экзоцитоз

Примечание: оценить чистоту экзоцитоз, различные мозг клеток такие типы, как нейроны, Микроглия и Олигодендроциты могут быть обнаружены иммунофлюоресценции с использованием различных клеточных маркеров. Маркеры распространения и PCNA пропидий йодидом (PI) может использоваться на первичной астроциты, подвергается OGD следуют нормоксические условий. Смотрите материалы в Таблице материалах.

  1. Иммунофлюоресценции подготовки
    Примечание: это протокол общего иммунофлюоресценции, незначительные изменения могут выполняться для достижения оптимального сигнала (например, длительный инкубационный период, Температура инкубации). Каждый маркер из таблицы 1 может использоваться в зависимости от производителя ' протокол s.
    1. Для оценки жизнеспособности клеток, клетки можно инкубировали в течение 5 минут при 37 ° C с PI (5 мкм в полной DMEM) и мыть дважды с 2 мл PBS для 5 минут клетки, которые показывают PI пятнать менее жизнеспособными.
      Примечание: Использование ячейки рассматривается в шаге 5.2.6.
    2. Исправить клетки после окрашивания PI, добавить 2 мл 4% формалина в 4.67 см 2 хорошо, для 20 минут, 4 градусов. Для образцов, помечены PCNA, крепления предпочтительным является метанола для 10 мин на 4 градусов.
      Осторожностью: Формалин и метанол являются токсичными.
      Примечание: Всегда проверяйте специфическое антитело протоколы от каждой компании.
    3. Мыть ячейки с 2 мл PBS для 5 минут и повторите этот шаг 3 раза.
    4. Инкубации клеток в блокировании раствор (0,5% неионные ПАВ, 10% FBS в PBS) за 30 мин при комнатной температуре с нежным пожимая.
    5. Мыть ячейки с 2 мл PBS на 5 мин, повторить 3 раза мыть.
    6. Инкубируйте на 4 ° C, на ночь (16 ч), с основного антитела (PCNA, СВМС) в раствор 1% FBS в PBS.
    7. Удалить решение основное антитело, вымыть клетки с 2 мл PBS для 5 минут и повторите этот шаг 3 раза.
    8. Инкубировать с вторичное антитело проспряганное с Флюорофор в раствор 1% FBS в PBS, за 1 ч, при комнатной температуре.
    9. Мыть ячейки с 2 мл PBS на 5 минут, повторите этот шаг 3 раза. Добавить 1 мкг/мл DAPI (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phenylindole) на 5 минут, чтобы пятно клеточных ядер.
    10. Мыть ячейки с 2 мл PBS 5 мин, повторите этот шаг два раза и держать в PBS.
    11. Подготовить coverslips на микроскопа с помощью установки среднего.
  2. Конфокальный микроскоп
    1. после настройки Микроскоп, место на coverslip стороне вниз на сцене Микроскоп.
    2. С помощью программного обеспечения, выберите лазерный луч на 543nm для СВМС Cy3 конъюгированных антител.

7. Жизнеспособность Assay клетки

  1. Trypsinize и количественно астроциты, выполните шаги, 4.3 и 4.4.
  2. Добавить 1 x 10-4 клетки/хорошо 96-луночных пластины и вырастить их в confluency.
  3. С использованием методологии из шага 5, разоблачить культивировали 96-луночных пластины либо нормоксические 1 h OGD или 6 h OGD.
  4. После OGD лечение, нормоксические СМИ добавляется ко всем ячейкам на 24 часа и жизнеспособности измеряется с помощью MTT Реагент assay (использовать как производитель ' s инструкции указывают).
  5. Из 5 мг/мл раствора MTT, добавить 10% от общего объема каждой скважины и Инкубируйте 3 ч при 37 ° c с реактивом MTT.
  6. Удаление средств массовой информации и Ресуспензируйте кристаллы с помощью 200 мкл диметилсульфоксида. Читайте пластины в спектрофотометром в 570 Нм.
    Примечание: Снижение поглощения относительно управления ячеек будет соотносить с менее жизнеспособность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одной из главных проблем первичной Астроцитарная культуры является наличие других клеток, нейронов, олигодендроциты, фибробластов и микроглии. На рисунке 1изолированных клеток от крыс коре были СМИ изменений каждые 3 дня и были либо необработанных или обработанных с добавлением LME за 1 ч. 24 h позже, клетки были immunostained для общего и counterstained с DAPI. Неочищенные клетки показал в среднем 39% не СВМС позитивные клетки, хотя LME-лечение клеток показа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает изоляции астроциты из крыса коре. В этом методе важно, чтобы уменьшить загрязнение с других клеточных типов, таких как микроглии, олигодендроциты и фибробластов. Чтобы уменьшить количество микроглии, некоторые шаги могут быть предприняты: изменение средств массовой информации, орбитальная встряхивания и химических обработок. После подтверждения чистоты культуры иммунофлюоресценции с помощью селективного клеточных маркеров или для самых известных загрязнителей клеток экспериментов может быть выполн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Паола Лопес Pieraldi для оказания технической помощи. А выражает признательность за гранты 8G12MD007600 и U54-NS083924, которые поддержали эту публикацию. Мы благодарим низ-NIMHD-G12-MD007583 Грант Фонда поддержки. D.E.R.A. благодарен за стипендий, предоставляемых NIHNIGMS-R25GM110513. Мы благодарны за использование области общего инструментария и помощи доктора Присцила Санабриа для использования оптических изображений объекта RCMI программы путем предоставления G12MD007583. Кроме того мы хотим поблагодарить за его выдающуюся роль в съемки и редактирования visual протокол Хосе Падилья.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
инструменты для хирургии - шаг 1
операционные ножницы 5,5"Робоз компанииRS-6812Инструменты, используемые для обезглавливания крыс.
Изогнутые щипцы 7"  Робоз компанииRS-5271Удерживает шкуру крысы во время снятия черепа.
Микрорассекающие ножницы 4"  Робоз компанииRS-5882Режет как кожу, так и череп крысы.
Микрорассекающие щипцы 4" угловые, тонкие острые;Робоз компанииRS-5095Удерживает шкуру крысы во время снятия черепа.
Микрорассекающие щипцы 4" слегка изогнутые 0,8Roboz CompanyRS-5135Инструмент используется для разделения коры головного мозга.
Микрорассекающий пинцетRoboz компанииRS-4972Peels мозговые оболочки.
Диссекционный микроскопOlympusSZX16Важен для удаления мозговой оболочки из коры головного мозга.
Подготовка DMEM - шаг 2
Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Medium (DMEM)GibCo. Компания11995-065Поддерживает рост клеток.
Бикарбонат натрияSigma-Aldrich CompanyS7277Добавка для клеточных культуральных сред.
Фетальная бычья сыворотка (FBS)GibCo. РМ10437-010Сыворотка-добавка для клеточных культур.
Пенициллин-стрептомицин GibCo. Компания15140-148Подавляет рост бактерий в клеточной культуре.
Система фильтрации 1л с порами 0,22 мкмCorning431098
Astrocyte culture - шаг 3
серологические пипетки 5mLVWR89130-896Для дозирования DMEM в контейнеры с клетками.
Серологические пипетки 10млVWR89130-898Для дозирования DMEM в контейнеры с ячейками.
Серологические пипетки 25млVWR89130-900Для дозирования DMEM в контейнеры с ячейками.
Коническая пробирка центрифуги 15 млSanta Cruz Biotechnologysc-200250
Safe-lock Tube 1,5 млНаконечники для барьеров Eppendorf022363204
200 мклSanta Cruz Biotechnologysc-201725
Барьерные наконечники 1 млSanta Cruz Biotechnologysc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"VWR14220-048
Чашки Петри 60 ммFalcon351007
Стерильные марлевые салфеткиHoneywell Safety89133-086
Stomacher 80 BiomasterSewar Lab System030010019растирать ткани мозга.
Stomacher 80 Blender Стерильные пакетыSewar Lab SystemBA6040Стерильный мешок для гомогенизатора клеток желудка.
Стакан 400 млPyrex1000
Стерильное сито для диссоциации клеток, сетка #60 Sigma-Aldrich CompanyS1020Для получения одноклеточной суспензии.
Стерильное сито для диссоциации клеток, сетка #100Sigma-Aldrich CompanyS3895Для получения одноклеточной суспензии.
Инвертированный фазовый микроскопNikonEclypse Ti-SПроверяйте клетки на предмет загрязнения или аномального роста клеток.
75см2 стерильные колбыFalcon353136
Многолуночная пластинаFalcon353046
Микро защитные стекла (покровные стекла), 18 мм, круглыеVWR48380-046
Bright-Line гемацитометрSigma-Aldrich CompanyZ359629
Пастеровские пипеткиFisher Scientific13-678-20D
Этиловый спирт Sigma-Aldrich CompanyE7023
L-лейцина метиловый эфир гидрохлорид 98% (LME)Sigma-Aldrich CompanyL1002Способствует элиминации клеток микроглии в первичной кортикальной культуре астроцитов.
Цитозин β-D-арабинофуранозид (Ara-C)Sigma-Aldrich CompanyC1768
Поли-D-лизин гидробромид, моль 70 000-150 000Sigma-Aldrich CompanyP0899
Трипсин/ЭДТАGibCo. 15400-054
Trypan BlueSigma-Aldrich CompanyT8154
Фосфатный буферный раствор (PBS) таблеткиCalbiochem524650
Стерильная водаSigma-Aldrich CompanyW3500
  Подготовка среды OGD - ступень 5
Центрифуга коническая пробирка 50 млVWR89039-658
Dulbecco' s модифицированный Eagle' Средне свободная глюкозаSigma-Aldrich CompanyD5030поддерживает рост клеток.
Бикарбонат натрияSigma-Aldrich CompanyS7277Добавка для клеточных культуральных сред.
Пенициллин-стрептомицин GibCo. Компания15140-148Подавляет рост бактерий в клеточной культуре.
200мМ  L-глютамин GibCo. Компания25030-081Аминокислота, которая дополняет рост клеток.
Фоспахет буферный физиологический раствор (PBS) таблеткиCalbiochem524650
Фильтрующая система 50 мл с порами 0,22 мкмCorning430320
Центрифуга коническая трубка 50 млVWR89039-658
Однопоточный расходомер Биллапс-РотенбергSMF3001Измерение расхода газа при продувке кислородом.
Камера инкубатора при гипоксии StemCell27310Создает гипоксическую среду для клеточной культуры.
Отслеживаемый измеритель растворенного кислородаVWR21800-022
95% N2/ 5% CO2 Газовая смесьLindeочищает окружающую среду от кислорода.
<сильная>первичная иммунофлуоресценция астроцитов - шаг 6
фосфатный буфер физиологического раствора (PBS) таблеткиCalbiochem524650
Раствор формалина нейтральный буфер 10%Sigma-AldrichHT501128раствор, используемый для фиксации клеток.
Метанол FisherA4544Раствор, используемый для фиксации клеток.
Неионогенное поверхностно-активное вещество (Triton X-100)Sigma-AldrichT8787
Фетальная бычья сыворотка (FBS)GibCo. РМ10437-010Сыворотка-добавка для клеточных культур.
Anti-NeuNCell Signaling24307Обнаруживает зрелые нейроны, служит для валидации астроцитарной культуры.
Anti-PCNACell Signaling2586Обнаруживает пролиферирующие клетки.
Йодид пропидия (PI)Sigma-Aldrich CompanyP4170Окрашивание апоптозом.
Anti-Olig1AbcamAB68105Обнаруживает зрелые олигодендроциты.
Anti-Iba1+Wako016-20001Обнаруживает клетки микроглии.
Анти-GFAP конъюгированный с Cy3 Sigma-Aldrich CompanyC9205Обнаруживает реактивные астроциты в обработанных клетках.
Alexa Fluor 488Молекулярный зонд Life TechnologyA1101Вторичное антитело против мыши.
Alexa Fluor 555Молекулярный зонд Life TechnologyA21428Вторичное антитело против кролика.
4',6'-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)Sigma-Aldrich CompanyD9542Ядерное окрашивание.
Конфокальный микроскопOlympus
Company

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
  2. Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
  3. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
  4. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  5. Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278(2015).
  6. Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
  7. Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574(2012).
  8. Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
  9. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
  10. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282(2013).
  11. Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
  12. Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987(2016).
  13. Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
  14. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
  15. Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
  16. Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
  17. Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
  18. Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
  19. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26(2007).
  20. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  21. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
  22. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
  23. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  24. Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
  25. Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
  26. Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
  27. Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
  28. Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
  29. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
  30. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
  31. Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
  32. Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
  33. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
  34. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
  35. Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
  36. Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
  37. Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
  38. Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFAPPCNA

Похожие статьи