Методическая статья

Анализ Cap-связывающих белков в человеческих клетках, подвергнутых Физиологические кислорода Условия

DOI:

10.3791/55112

⸱

28 декабря 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протоколы культивирования клеток человека для анализа факторов инициации трансляции, которые связывают 5'-колпачок мРНК в физиологических кислородных условиях. В этом методе используется аналог колпачка m7GTP, связанный с агарозой, и он подходит для исследования факторов связывания крышек и их взаимодействующих партнеров.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансляционный контроль является центральным элементом регуляции генов, особенно в периоды клеточного стресса. Cap-зависимая трансляция через комплекс eIF4F на сегодняшний день является наиболее распространенным путем инициирования синтеза белка в эукариотических клетках, но в настоящее время появляются стресс-специфичные вариации этого комплекса. Очистка кэп-связывающих белков с помощью аффинной смолы, состоящей из связанного с агарозой m7GTP (аналог 5'-мРНК-колпачка), является полезным инструментом для выявления факторов, участвующих в регуляции инициации трансляции. Гипоксия (низкий уровень кислорода) — это клеточный стресс, возникающий во время развития плода и прогрессирования опухоли, и в значительной степени зависящий от регуляции трансляции. Кроме того, недавно сообщалось, что органы взрослого человека имеют более низкое содержание кислорода (физоксия 1-9% кислорода), что ближе к гипоксии, чем окружающий воздух, где клетки обычно культивируются. В связи с продолжающейся характеристикой гипоксического комплекса eIF4F (eIF4FH) растет интерес к пониманию кислородзависимой инициации трансляции через 5'-мРНК-колпачок. Недавно мы разработали метод культивирования клеток человека для анализа кэп-связывающих белков, которые регулируются доступностью кислорода. В этом протоколе подчеркивается, что культивирование и лизис клеток должны выполняться на рабочей станции для лечения гипоксии для исключения контакта с кислородом. Клетки должны инкубироваться в течение не менее 24 часов, чтобы жидкая среда могла уравновеситься с атмосферой внутри рабочей станции. Чтобы избежать этого ограничения, в ячейки можно добавлять предварительно подготовленные среды (деоксигенированные), если требуются более короткие временные точки. Некоторые белки, связывающие колпачки, требуют взаимодействия со вторым основанием или могут гидролизовать m7GTP, поэтому некоторые взаимодействующие агенты колпачков могут быть упущены в процессе очистки. В этом протоколе могут быть заменены аналоги колпачков, связанные с агарозой, к ферментативно стойким колпачкам. Этот метод позволяет пользователю идентифицировать новые кислород-регулируемые факторы трансляции, участвующие в cap-зависимой трансляции.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поступательное управления становится столь же важным шагом в регуляции транскрипции в экспрессии генов, особенно в периоды клеточного стресса 1. Координационный центр контроля перевода находится на лимитирующей стадии инициации , где первые этапы синтеза белка связаны с связывание эукариотических фактор инициации 4Е (eIF4E) к 7-methylguanosine (м 7 GTP) 5 'колпачка мРНК 2 , eIF4E является частью тримера комплекса имени eIF4F , который включает eIF4A, РНК - геликазу и eIF4G, белок строительные леса , необходимого для набора других факторов перевода и 40S рибосомы 3. В нормальных физиологических условиях, подавляющее большинство мРНК транслируются с помощью механизма кэп-зависимой, но в периоды клеточного стресса приблизительно 10% человеческих мРНК содержит 5 'НТО , которые могли бы позволить кэп-независимый перевод инициация 1,4. Cap-зависимый перевод был исторически синонимOUs с eIF4F, однако, стресс-специфические вариации eIF4F стали трендом тема 5-8.

Различные клеточные стрессы вызывают eIF4E активность, чтобы быть подавлено через мишень рапамицина у млекопитающих комплекса 1 (mTORC1). Эта киназа становится нарушение в условиях стресса, что приводит к увеличению активности одной из своих целей, то 4E-связывающий белок (4E-BP). Нефосфорилированный 4E-BP связывается с eIF4E и блокирует его способность взаимодействовать с eIF4G вызывает репрессию кэп-зависимой трансляции 9,10. Интересно отметить , что гомолог eIF4E по имени eIF4E2 (или 4EHP) имеет значительно более низкое сродство к 4E-BP 11, может быть , что позволяет ему уйти от стресса опосредованной репрессии. Действительно, первоначально характеризуется как репрессор перевода из - за отсутствия взаимодействия с eIF4G 12, eIF4E2 инициирует перевод сотен мРНК , которые содержат РНК - элементы ответа гипоксия в их 3 'UTR во время гипоксического стресса 6,13. Эта активация яы достигается за счет взаимодействия с eIF4G3, РНК связывающий белок мотив 4 и индуцируемого гипоксией фактор (HIF) 2Л составлять гипоксической eIF4F комплекс, или eIF4F H 6,13. В качестве репрессора при нормальных условиях, eIF4E2 связывается с GIGYF2 и ZNF598 14. Эти комплексы были, в частности, определены через Агарозном-сцепленных м 7 GTP аффинных смол. Этот классический метод 15 является стандартом в области перевода и является лучшим и наиболее часто используемый метод для выделения кэп-связывающих комплексов в выдвиньте вниз и в пробирке анализы связывания 16-19. По мере того как крышка-зависимого перевода машины появляется как гибкость и адаптируемость с интер изменяющие деталей 6-8,13, этот метод является мощным инструментом для быстрого выявления новых кэп-связывающих белков , участвующих в реакции на стресс. Кроме того, изменения в eIF4F может иметь далеко идущие последствия, как несколько эукариотических систем модели появляются использовать гомолог eIF4E2 для таких стрессовых реакцийкак A. thaliana 20, С. Pombe 21, Д. MELANOGASTER 22, и С. Элеганс 23.

Имеющиеся данные свидетельствуют о том , что изменения в eIF4F не может быть строго ограничена стрессовым условиям, но участвовать в нормальной физиологии 24. Подача кислорода к тканям (на концах капилляра) или в тканях (измеряется с помощью микроэлектродов) колеблется от 2-6% в головном мозге 25, 3-12% в легких 26, 3,5-6% в кишечнике 27, 4% в печень 28, 7-12% в почке 29, 4% в мышцах 30, и 6-7% в костном мозге 31. Клетки и митохондрии содержат менее 1,3% кислорода 32. Эти значения гораздо ближе к гипоксии, чем окружающий воздух, где клетки обычно культивируют. Это говорит о том, что ранее считалось, как гипоксия специфические клеточные процессы, которые могут быть необходимы в физиологической обстановке. Интересно, что eIF4F и eIF4F H активно участвуют в инициации трансляции различных пулов или классов мРНК в нескольких различных клеточных линий человека , подвергшихся воздействию физиологического кислорода или "physioxia" 24. Низкий уровень кислорода также приводит правильное развитие плода 33 и клетки обычно имеют более высокий уровень пролиферации, увеличенный срок службы, меньше повреждений ДНК и меньше ответов общего напряжения в physioxia 34. Поэтому eIF4F H, вероятно , является ключевым фактором в экспрессии генов , выбранных в физиологических условиях.

Здесь мы приводим протокол к культуре клеток в основных физиологических условиях кислорода или в динамическом диапазоне колеблющейся, который, вероятно более представительным микросреды ткани. Одно из преимуществ этого способа состоит в том, что клетки лизируют в пределах рабочей станции гипоксией. Не так часто, ясно, как переход от гипоксического культуры клеток к лизису клеток производится в других протоколах. Клетки часто сначала удаляют из небольшого гипоксией инкубаторе бытьпередний лизис, но это воздействие кислорода может влиять на биохимические пути , как клеточная реакция с кислородом происходит быстро (один или два мин) 35. Некоторые кэп-связывающие белки требуют взаимодействия с вторым основанием или может гидролизовать м 7 ГТФ, поэтому некоторые крышки interactors могут быть пропущены в процессе очистки. Агарозном связаны с аналогами ферментативно резистентных Колпачок может быть заменен в данном протоколе. Изучение активности и состава eIF4F H и других вариаций eIF4F с помощью метода , описанного здесь будет пролить свет на запутанные экспрессии генов механизмов , которые клетки используют в процессе физиологических условиях или стрессовых реакций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка к культуре клеток

  1. Покупка коммерчески доступные запасы человеческих клеток.
    Примечание: Этот протокол использует НСТ116 колоректальной карциномы и первичной почки проксимальных канальцев эпителиальные клетки человека (HRPTEC).
  2. Сделать 500 мл среды для культивирования НСТ116: Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) / Высокий средний глюкозы, дополненной 7,5% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S).
  3. Сделать 500 мл среды для культивирования HRPTEC: Эпителиальный среду клеток, дополненной 5% FBS, 1% добавки роста эпителиальных клеток, а 1% P / S.
  4. Приготовьте 500 мл 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS): 140 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 15 мМ KH 2 PO 4. Регулировка рН до 7,4 и стерилизуют в автоклаве в течение 40 мин при температуре 121 ° С.

2. Начало культивирования клеток

  1. Тщательно аспирата среду от 80-90% сливающийся блюдо с не нарушая тон клетки.
  2. Аликвотные 3-5 мл 1x PBS на чашку для культивирования, аккуратно раскачивать каждую колбу, чтобы покрыть площадь поверхности тарелки, и тщательно аспирата 1X PBS. Повторите эти действия для второй промывки 1x PBS.
  3. Алиготе 3 мл 0,05% трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в каждую чашку для культивирования и осторожно встряхните, чтобы равномерно слой клеток с помощью трипсина-ЭДТА. Инкубируют при 37 ° С в течение 2-3 мин.
  4. Передача обособленные клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируют при 4000 х г в течение 90 сек.
  5. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл полной среды DMEM.
  6. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Подсчитайте , сколько апирогенно и полистирольная 100 мм чашки для культивирования клеток необходимы для достижения начальной плотности посева около 2500-5000 клеток на см 2.
  7. Предварительно теплая полная среда для культивирования клеток сделаны с шагом 1.2 или 1.3, в водяной бане при 37 ° С в течение 30-45 мин.
  8. Дезактивацию средней бутылки и флакон клеток с 70% этанола. С этого момента всеоперации должны быть выполнены в асептических условиях.
  9. Алиготе 6 мл полной DMEM на столько 100 мм чашки для культивирования клеток, необходимых для использования весь объем замороженных клеток в пределах плотности высева упомянутого в пункте 2.6.
  10. Перенести объем клеточной суспензии, вычисленным на этапе 2.6 к каждому из мм культуральные чашки 100. Rock каждую пластину вручную, чтобы равномерно распределить клетки по поверхности пластины.
  11. Поместите отобранный 100 мм для культивирования клеток блюдо в инкубаторе при температуре 37 ° С в атмосфере 5% СО 2. Разрешить клетки инкубировать по меньшей мере, 24 ч до следующих шагов.

3. пересева

  1. Просмотреть каждую ячейку культуры блюдо под микроскопом, чтобы определить процент клеток сплошности (% клеток, покрывающих площадь тарелки). Возвращение клеток в инкубатор и предварительно теплой полной среде и 1х PBS. Перейдите к следующему шагу, если клетки 80-100% сплошности.
  2. Тщательно аспирата затрачиваемое среду не нарушаяклеток в каждой культуре блюдо.
  3. Аликвотные 3-5 мл 1x PBS на чашку для культивирования, аккуратно раскачивать каждую колбу, чтобы покрыть площадь поверхности тарелки, и тщательно аспирата 1X PBS. Повторите эти действия для второй промывки 1x PBS.
  4. Алиготе 3 мл 0,05% трипсин-ЭДТА в каждую чашку для культивирования и осторожно встряхните, чтобы равномерно слой клеток с помощью трипсина-ЭДТА. Инкубируют при 37 ° С в течение 2-3 мин.
  5. Во время этой инкубации аликвоты 10 мл полной среды на столько чашки для культивирования, необходимых для получения плотности клеток 2500-5000 клеток на см 2.
  6. Когда клетки отделяются от пластины, быстро добавляют 3 мл 1x определенного ингибитора трипсина и осторожно взболтать блюдо в течение 1 мин, чтобы гарантировать, что все трипсин-ЭДТА был нейтрализован.
  7. Перенесите отдельные клетки в стерильный 15 мл центрифужную пробирку и отложите в сторону. Добавьте 3 мл 1x PBS в блюдо, чтобы собрать оставшиеся клетки, и передать, что к тому же 15 мл центрифужную пробирку.
  8. Гранул клетки центрифугированием 150 XGв течение 5 мин.
  9. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 3 мл полной среды.
  10. Граф клеток с использованием гемоцитометра и семян 150 мм культуральные чашки , содержащей 15 мл полной среды , чтобы получить плотность клеток 2500-5000 клеток на см 2. Используйте два 150 мм для каждого колпачка-связывающего анализа.
    Примечание: диффузии кислорода к клеткам через жидкие среды зависит от объема 36. Рекомендуется сохранить объем средств массовой информации в соответствии между экспериментами, используются ли прилипшие клетки или клетки в суспензии. Средства массовой информации могут быть предварительно кондиционером (инкубируют в рабочей станции, в течение 24 часов, как было описано в обсуждение), чтобы избежать этих изменчивости в процессе диффузии.
  11. Поместите посуду отобранный-культуры в термостате при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2. Разрешить клетки инкубировать по меньшей мере, через 24 часа, прежде чем перейти к следующему шагу.

4. Physioxic экспозиции

  1. Просмотреть клетки под микроскопом. Для BESРезультаты T, убедитесь, что клетки на 70-80% сплошности для воздействия на 24 ч, 50-60% сплошности для воздействия на 48 часов, а затем 40-50% сплошности для облучения в 72 ч.
  2. Поместите клетки в гипоксией рабочей станции в течение требуемого времени (24, 48, или 72 ч в зависимости от эксперимента).
  3. Установите рабочую станцию ​​к соответствующему physioxia.
    Примечание: Например, установка 3% O 2 будет сопровождаться 5% CO 2 и 92% N 2.
    Примечание: Если колебания кислорода в пределах динамического диапазона желательно более конкретные сроки, программирования расписания в прибор или вручную настроить параметры кислорода в нужных интервалах.
  4. Установите влажность до 60%. Атмосфера рабочая станция очень сухая, тем не менее, и средства массовой информации будут заметно испаряются во время длительных экспериментов (> 48 ч). Держите резерв средств массовой информации в клеточной культуре колбу в пределах рабочей станции (так что носитель уравновешивают с атмосферой рабочей станции) для пополнения средств массовой информации в культуре клеток дисГЭК.
    Примечание: Любое решение , которое будет взаимодействовать с клетками , предшествующих лизиса (например, PBS и трипсин-ЭДТА) должны быть предварительно кондиционируют в течение 24 часов перед использованием внутри рабочей станции гипоксией таким образом , чтобы содержание растворенного кислорода уравновешивается с атмосферным кислородом 36.
  5. Хранить клетки в пределах рабочей станции до лизиса.

5. Подготовка Буферы для Cap-анализе на связывание

  1. Приготовьте 1х Трис-солевом буфере (TBS).
    1. В 800 мл дН 2 O растворяют 8,76 г NaCl и 6,05 г Трис Base.
    2. Доведите раствор до конечного рН 7,4 с помощью 1 М HCl.
    3. Принесите конечный объем до 1 л с использованием дН 2 O.
  2. Готовят без денатурированного буфера для лизиса. Подготовка буфера для лизиса день колпачка-связывающего анализа. Сделайте дополнительный буфер для лизиса мыть пустые шарики агарозы и тому γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сцепленные бусинки (шаги 7.9 и 7.13).
    1. В 7 мл дН 2 O, добавляют 160 мкл 5 М NACл, 160 мкл 1 М Трис-HCl , рН 7,4, 40 мкл 200 мМ NaF, 40 мкл 1 М MgCl 2, и 40 мкл 1 мМ ортованадата натрия.
    2. Добавьте 40 мкл Igepal к раствору 7 мл. Обрежьте кончик пипетки, чтобы помочь восстановить Igepal как это чрезвычайно вязкая.
    3. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз, или вихрь, раствор 7 мл, пока все Igepal не растворится.
    4. Повысить конечный объем раствора до 8 мл, и держать на льду.
  3. Подготовьте 4x додецилсульфат натрия (SDS) -page буфера выборок.
    1. В химическом стакане, смешайте 16 мл 1 М Трис-HCl, рН 6,8, 12,64 мл глицерина и 8 мл дитиотреитола (DTT).
    2. Добавить 3,2 г SDS и 0,16 г бромофенолового синего. Разрешить порошок полностью раствориться при перемешивании с помощью магнитной мешалки.
    3. Алиготе в 1,5 мл микропробирок и хранят при -20 ° С.

6. лизиса клеток

  1. Подготовить неденатурирующем буфер для лизиса и держать на льду день гое капсюль-анализа связывания.
  2. Предварительно теплой 1X PBS и трипсина в водяной бане при 37 ° С в течение 30 мин.
  3. Алиготе 980 мкл буфера для лизиса в 1,5 мл микроцентрифужных трубки для каждого колпачка-связывающего анализа выполняются.
  4. Добавляют 10 мкл 4- (2-аминоэтил) фторид-бензолсульфонил гидрохлорида и 10 мкл 100-кратного ингибиторов протеаз к 980 мкл буфера для лизиса. Держите на льду.
  5. Выбросить носитель из каждого 150 мм блюдо в мусорный контейнер внутри рабочей станции гипоксией.
  6. Промывают клетки с 3-4 мл подогретого 1x PBS и выбросить всю жидкость.
  7. Добавить 1 мл подогретого 0,05% трипсина-EDTA в каждую чашку и оставьте на 2 мин или пока клетки больше не привязаны к пластине.
  8. С помощью пипетки переносят клетки одной пластины на 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Повторите по мере необходимости так, чтобы каждая пластина клеток переносили в отдельную 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  9. Центрифуга 1,5 мл микроцентрифужных трубки при 6000 мкг в течение 90 сек тO осадка клеток.
  10. Аспирируйте трипсина с помощью пипетки, не нарушая гранул. Если осадок нарушен, повторно Центрифуга микроцентрифужных трубки 1,5 мл при 6000 мкг в течение 90 сек.
  11. Вымойте клетки с теплой 1x PBS, осторожно пипеткой 200 мкл PBS в трубу непосредственно над шариком. Повторно центрифуге, если осадок нарушен.
  12. Аспирируйте PBS, не нарушая гранул.
  13. Пипеток 500 мкл из 1 мл буфера для лизиса приготовленный раствор на первой сотовой гранулы. Ресуспендируют осадок полностью пипетированием вверх и вниз.
  14. Объединяют ресуспендировали клетки со вторым осадку клеток и ресуспендируют вторую таблетку с помощью пипетки вверх и вниз. Повторите этот процесс, пока все гранулы не были объединены и ресуспендировали для каждого образца.
  15. Смешайте лизата с оставшимися 500 мкл буфера для лизиса в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
  16. Удалить образцы с рабочей станции гипоксией.
    Примечание: После добавления лизиса буфер,Л.Л. последующие шаги должны быть выполнены в окружающем воздухе в качестве рабочей станции гипоксия установлен на 37 ° С, и следующие шаги должны быть выполнены холодным (4 ° С или на льду).
  17. Лизировать клетки, используя легкое перемешивание путем вращения образцов при 4 ° С в течение 1,5-2 ч.
  18. Центрифуга лизированных клеток при 12000 х г в течение 15 мин при 4 ° С для удаления остатков клеток.
  19. Передача лизата в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки и выбросить осадок.
  20. Резервируют часть (5-10%) надосадочной жидкости для использования в качестве целого входного контроля клеточного лизата для будущего Вестерн-блот-анализа.

7. Cap-связывающим Анализ

  1. Для каждого образца, передать 50 мкл заготовки агарозном суспензии управления шарик и 50 мкл γ-аминофенил-м 7 ГТФ агарозы С10-сцепленного шарик суспензии для отделения 1,5 мл микроцентрифужных пробирок. Используйте ножницы, чтобы удалить кончик пипетки для облегчения сбора суспензии шарик.
  2. Гранул бусы бу центрифугирование суспензии при 500g в течение 30 сек.
  3. Удалить супернатант и ресуспендируют тщательно бусин в 500 мкл TBS.
  4. Повторите шаги 7.2 и 7.3. Гранул шарики при 500 мкг в течение 30 сек и удалить супернатант.
  5. Передача супернатант, содержащий лизата из стадии 6,19 в пробирку микроцентрифужных 1,5 мл раствора, содержащего пустые агарозном бисером.
    Примечание: Пустые агарозном шарики действуют в качестве стадии предварительной клирингового для удаления белков из лизата, которые неспецифически взаимодействовать с буртиком.
  6. Инкубировать в течение 10 мин при 4 ° С при осторожном перемешивании.
  7. Гранул пустые агарозном бисером центрифугированием при 500 мкг в течение 30 сек.
  8. Передача лизата в микроцентрифужных пробирку объемом 1,5 мл , содержащей γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый бусы.
  9. Промыть пустые агарозном бисером ресуспендирования бисером в 500 мкл буфера для лизиса, гранулирование шарики центрифугированием при 500 мкг в течение 30 сек, и отбрасывая supernaTant. Повторите это четыре раза в общей сложности пять стирок.
  10. Ресуспендируют пустые агарозном бисером в 1x SDS-PAGE образца буфера, и кипение шариками в течение 90 сек при 95 ° С. Хранить при -20 ° С для последующего Вестерн-блоттинга, чтобы наблюдать, связывается ли представляющий интерес белок, неспецифически к буртика.
  11. Выдержите лизата с γ-аминофенил-м 7 ГТФ агарозы С10-сцепленных бусинок при осторожном перемешивании в течение 1 часа при 4 ° С для захвата кэп-связывающих белков.
  12. Гранул γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый шарики центрифугированием при 500 мкг в течение 30 сек. Удалите супернатант.
  13. Вымойте γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый бусинки, повторив шаг 7.9.
  14. Ресуспендируют бисером в 600 мкл буфера для лизиса.
  15. Добавить ГТФ до конечной концентрации 1 мМ.
  16. Инкубируйте γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый бусин + 1 мМ GTP при осторожном перемешивании в течение 1 ч при температуре 4 ° С. Примечание: Этабудет разъединить белки , которые неспецифически взаимодействуют с 7 м GTP (то есть, также взаимодействуют с не денатурированного GTP).
  17. Гранул γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый шарики центрифугированием при 500 мкг в течение 30 сек.
  18. Передача супернатант в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки и добавляют 200 мкл 4-кратным SDS-PAGE образца буфера (50 мМ Трис-HCl, 100 мМ DTT, 2% SDS, 0,1% бромфенолового синего, и 10% глицерина). Хранить контрольный образец ГТФ при -20 ° С для последующего Вестерн - блот - анализа 37. Вымойте бисером, повторив шаг 7.9.
  19. Ресуспендируют бисером в 1x SDS-PAGE образца буфера (50 мМ Трис-HCl, 100 мМ DTT, 2% SDS, 0,1% бромфенолового синего, 10% глицерина), и кипение при температуре 95 ° С в течение 90 сек. Хранить м 7 ГТФ-связанной фракции при -20 ° С для последующего Вестерн - блот - анализа 37.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ Cap-связывающая способность в ответ на кислородом eIF4E и eIF4E2 в качестве м 7 GTP сходству столбца

На рисунках 1 и 2 представляют собой вестерн - блоттинга типичных м 7 GTP аффинной очистки двух основных кэп-связывающих белков в ответ на колебания кислорода в двух клеточных линий человека: первичные почечные проксимальных канальцев эпителиальные клетки человека (HRP...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ кэп-связывающих белков в человеческих клетках, подвергнутых физиологических условиях кислорода может быть предусмотрена возможность идентификации новых кислородных регулируемых факторов инициации трансляции. Сродство этих факторов для колпачка 5 'мРНК или других кэп-ассоциированных белков может быть измерена с помощью силы их ассоциации с м 7 GTP-сшитый агарозном бисером. Одно предостережение этого метода заключается в том, что он измеряет кэп-связывающий потенциал белков после лизиса, но она выпол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерии Канады и Министерством исследований и инноваций провинции Онтарио.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
γ-аминофенил-m7GTP агарозный C10-linkedbeads Jena BioscienceAC-1555Agarose-linked m7GTP
100 мм чашка для культурыCorning87722210-см чашка для культуры 150
мм чашкадля культуры Thermofisher130183чашка для культуры 15 см
AEBSF HydrochlorideACROS ОрганикаA0356829
Агарозные бусиныJena Bioscience AC-0015Контроль агарозных шариков
БромфенолBlue FisherBP112-25Компонент загрузочного буфера SDS-PAGE
1,5 мл Центрифужные пробиркиFroggaBio1210-00SИспользуются для центрифугирования небольших объемов
15 мл Конические центрифужные пробиркиFisher1495970CИспользуются при культивировании первичных клеток
Определенный ингибитор трипсинаFisherR007100DTI
ДитиотреитолFisherBP172-25DTT
Эпителиальная клеточная среда (полный комплект)ScienCell4101Включает добавки сыворотки и фактора роста)
ГлицеринFisherBP229-1Компонент загрузочного буфера SDS-PAGE
100 мМ Гуанозин 5'-трифосфат, 1 млJena Bioscience272076-0251MGTP
HCT116 колоректальная карциномаATCCCCL-247Клеточная линия рака человека
Эпителиальные клетки почек человека проксимальные канальцевые эпителиальные клеткиATCCPCS-400-010HRPTEC
Hyclone DMEM/High GlucoseLife SciencesSH30022.01Стандартные среды для культуры клеток человека
Гиклон раствор пенициллин-стрептомицинаGE Life SciencesSV30010Антибиотический компонент DMEM
H35 HypOxystationHypoxygenN/AГипоксия Рабочая станция
Igepal CA-630MP Biomedicals2198596Детергентный компонент буфера для лизиса
МонокалийфосфатFisherP288-500KH2PO4
Potassium chlorideFisherP217-500KCl
Magnesium chlorideFisherM33-500MgCl2
Sodium chlorideFisherBP358-10NaCl
Sodium fluorideFisher5299-100NaF (компонент ингибитора фосфатазы лизисного буфера)
Динатрия фосфатFisher5369-500Na2HPO4
Premium Grade Фетальная бычья сывороткаSeradigm1500-500FBS
Коктейль ингибиторов протеазы (100x)Клеточная сигнализация58715Компонент буфера лизиса
Додецилсульфат натрияFisherBP166-100SDS
Ортованадат натрияSigma56508Na3VO4
Tris BaseFisherBP152-5Компонент буферов
0,05% Трипсин-ЭДТА (1x)Life Technologies2500-067Трипсин, используемый для отделения адгезивных клеток
AEBSF

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90(2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394(2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Oxygen RegulationHypoxia Workstationm7GTP Agarose BeadsAffinity PurificationWestern Blot AnalysisCell Lysis ProtocolTranslation Initiation FactorsGTP Wash Specificity

Похожие статьи