Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Эффективная изоляция функциональных островках из неонатальной мыши Поджелудочная железа

10.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55160

⸱

6 января 2017 г.

 , 
1Department of Cell and Development Biology, Vanderbilt University Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Мы опишем протокол в настоящем документе для выделения интактные островки из неонатальных мышей. Поджелудочных желез частично переваривают коллагеназы, с последующим промыванием и ручного сбора. 20 - 80 островковых кластеры могут быть получены в поджелудочной железе от новорожденных мышей, которые подходят для нескольких островковых исследований.

Аннотация

Перфузионные на основе протоколов островок изоляции от большого поджелудочных желез млекопитающих хорошо известны. Такие протоколы легко проводятся во многих лабораториях из-за большого размера протока поджелудочной железы, который позволяет для готовой инъекции коллагеназы и последующей тканевой перфузии. В отличие от этого, островок изоляции от небольшого поджелудочных желез, как у новорожденных мышей, является сложной задачей, так как перфузия не является легко достижимым в маленьком поджелудочных желез. Здесь мы опишем подробно простую процедуру, которая позволяет восстанавливать значительное число островков от новорожденных мышей с визуальной помощи. Свеже расчлененный весь поджелудочных желез переваривали 0,5 мг / мл коллагеназы IV, растворенного в Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) при 37 ° С, в микроцентрифужных пробирках. Трубы регулярно постучала для облегчения рассредоточения ткани. Когда большая часть ткани была рассеяна на небольшие кластеры около 1 мм, лизаты были промыты три-четыре раза культуральной средой с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Островок кластеры,лишенные распознаваемых тканей ацинарными, а затем могут быть восстановлены под рассекает стереоскоп. Этот метод восстанавливает 20 - 80 малых и больших размеров островков в поджелудочной железе новорожденной мыши. Эти островки являются подходящими для большинства возможных последующих анализов, в том числе секреции инсулина, экспрессии генов и культуры. Пример анализа секреции инсулина представлена ​​для проверки процесса выделения. Генетический фон и степень переваривания являются крупнейшими факторами, определяющими доходность. Свежеприготовленный раствор коллагеназы с высокой активностью является предпочтительным, поскольку он помогает в эндокринно-экзокринной изоляции. Наличие катионов [кальция (Ca 2+) и магния (Mg 2+)] во всех растворах и эмбриональной телячьей сыворотки в стирке / собирание носители информации необходимы для хорошего урожая островками с надлежащей целостности. Рассекает прицел с хорошей контрастностью и увеличением также поможет.

Введение

Выделение чистых островков поджелудочной железы необходимо для анализа глюкозостимулированной секреции инсулина (GSIS) бета-клеток и для трансплантации островков от трупных доноров 1-3. Также необходимо установить экспрессию эндокринных генов в островковых клетках 4, 5. С этой целью были разработаны подробные протоколы, позволяющие выделить островки поджелудочной железы из большой поджелудочной железы (6 и ссылки в них). Эти методы основаны на ферментативной перфузии для диссоциации ацинара из островковых тканей в сочетании с градиентной сепарацией и ручным сбором. Таким образом, выделение островков из большой поджелудочной железы может быть легко выполнено в большинстве лабораторий. С другой стороны, не существует подробного пошагового протокола, позволяющего изолировать островки от поджелудочной железы, которые слишком малы для перфузии.

Изучение экспрессии генов и функции неонатальных островков важно. Островки новорожденных отличаются от взрослых свойствами секреции и пролиферации инсулина 7, 8. Тем не менее, выделение островков от новорожденных животных, особенно мышей, является сложной задачей из-за небольшого размера только что родившейся поджелудочной железы. Размер препятствует обычному процессу перфузии при введении коллагеназы через проток поджелудочной железы. Действительно, в нескольких работах были представлены исследования в этом направлении, с процедурами выделения с помощью ферментов или без ферментов 7, 9, 10. Тем не менее, подробное описание процесса изоляции островков с помощью наглядных пособий отсутствует 7, 9, что затрудняет проведение подобных исследований для большинства исследователей.

Мы исследовали несколько различных условий, которые дают высококачественные островки от неонатальных мышей. Здесь мы представляем протокол, который, как ожидается, поможет исследователям узнать ключевые детали в процессе изоляции островков. Этот протокол применим к поджелудочной железе мышей в возрасте до двух недель, после чего может быть выполнена перфузия для рутинной изоляции островков. Островки могут быть непосредственно использованы для анализа секреции инсулина и экспрессии генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Использование животных соответствует процедурам, указанным в протоколе M / 11/181 утверждена Вандербильта Институциональные уходу и использованию животных комитета по Гу. CD1 или CBA / НД6 мышей были приобретены у коммерческих поставщиков и перешли в виварии Vanderbilt для получения неонатальных мышей.

1. Получение мышей, маточные растворы и оборудование

  1. Для креста мыши: водрузил крест мыши и записать забивания даты, чтобы помочь планирования эксперимента. мышей CD1 обычно рожают около 19-й день после спаривания. Использование CD1 или CBA / НД6 кресты получить CD1 или CBA / НД6 новорожденных соответственно. Intercrosses между этими двумя линиями используют CD1 самок и CBA / НД6 мужчин.
  2. Для коллагеназы складе: вес 200 мг коллагеназы типа IV с высокой точностью баланса. Перенесите в 50 мл центрифужную пробирку. Растворить в 40 мл HBSS с Ca 2+ / Mg 2+ (1,26 и 0,5 мМ соответственно) , чтобы сделать 5 мг / мл маточного раствора.
    1. Разрешить коллагеназы враствориться в течение ~ 30 мин при осторожном встряхивании. Алиготе и держать раствор заморожен в -20 ° C в качестве запаса, который остается активным в течение не менее одного года.
  3. Автоклава стерилизуют несколько пар пинцетов, ножниц и P20 советов для рассечения и собирание островок.
  4. Для глюкозы на складе 1 M: весят 9 г глюкозы в 50 мл центрифужную пробирку, добавляют 50 мл RPMI 1640, чтобы растворить глюкозу. Хранить в 4 ° С до использования, но не более 6 месяцев.

2. Рабочие растворы

Примечание: На следующий день изоляции островковых клеток поджелудочной железы, подготовить следующие реагенты.

  1. Для IV рабочего раствора типа коллагеназы: оттепель и разбавьте коллагеназы запас на льду. Разлить 0,15 мл в каждый запас 1,7 мл пробирке. Добавить 1,35 мл HBSS с Ca 2+ / Mg 2+. Переверните пробирку 5 раз. Оставьте на льду в течение 15 мин.
    1. Вращение на высокой скорости в течение 3 мин в микроцентрифуге. Перенести супернатант в новую пробирку. Оставьте на льду до использования, Выбросьте трубку с нерастворимого мусором.
  2. Для получения полной среды RPMI 1640: добавить 2,5 мл 1 М глюкозы, 50 мл инактивированной нагреванием FBS, и 5 мл 100x Пен-стрептококковый запас в 500 мл среды RPMI 1640. Оставьте на льду до использования.

3. Изоляция Поджелудочная и Переваривание

  1. Эвтаназии новорожденных с изофлуран, а затем путем обезглавливания в соответствии с утвержденными протоколами.
  2. Положите мышь с ее животом вверх. Спрей с 70% -ным этанолом для стерилизации.
  3. Подтяжка кожи живота с помощью пинцета и разрезают кожу и мышечные слои в продольном направлении вдоль средней линии с парой ножниц, от генитальной области к грудной клетке. Это открывает брюшную полость, чтобы раскрыть все внутренние органы.
  4. Перенесите все внутренние органы до 100 см чашку с помощью пинцета. Расположить поджелудочную железу, которая представляет собой рассеянный гармошка с дорсальной части , которая цепляется желудка и селезенки и брюшной части , которая цепляется двенадцатиперстной кишки 11.
  5. Добавить HBSS в блюдо, чтобы погрузить органы. В растворе, панкреатические ткани больше не цепляться двенадцатиперстной кишки, желудка или селезенки. Он легко узнаваем под областью рассекает из-за его типичного белого цвета. Используйте пинцет, чтобы очистить панкреатические ткани от окружающей ткани и передачи на новый 60 мм блюдо с HBSS.
  6. Разрежьте каждую поджелудочную железу с ножницами на куски размером менее 5 мм в поперечнике любых размеров. Переложить в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. До пяти поджелудочных желез (моложе Р7) могут быть переварены в одной пробирке. Для P8-P16 мышей, использовать одну из трубок каждого поджелудочной железы.
  7. Добавить 0,5 - 1 мл коллагеназы рабочего раствора в каждую пробирку (0,2 мл для каждого поджелудочной железы Р1-Р7 Используйте 0,5 мл для каждого Р8-P16 поджелудочной железы.). Оставьте трубку в инкубатор C 37 ° до 15 мин. Переверните пробирку два раза каждый мин.
  8. После ~ 5 мин, нажмите трубку для мониторинга состояния переваривания ткани поджелудочной железы. Продолжить процесс пищеварения, пока большая часть поджелудочной железыткань выглядит как фрагментированные кластеры клеток, с диаметром <2 мм. Лизат появится облачно, что связано с нормальной ацинарной автолиза клеток.

4. лизата Стиральная

  1. Спин лизат при 500 мкг в течение 10 секунд в микроцентрифуге. Удалить супернатант слой с Pipetman P1,000. Супернатант должен появиться мутная, но лишенные клеточных кластеров. Не следует использовать стремление, которое может быстро аспирата от обломков ткани на дне из-за наличия какого-либо липкого ДНК.
  2. Добавляют 1 мл RPMI 1640 полной среде. Нажмите на трубку осторожно ресуспендируют фрагментированной лизата. Переверните вверх и вниз 10 раз. Повторите шаг 4.1.
  3. Повторите шаг 4,2 еще два раза или до тех пор, пока не появится супернатант ясно. Повторное приостановить вымытые панкреатических фрагментов в 1 мл полной среды RPMI 1640.

5. Выделение Островок

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения небольшого количества поджелудочных желез, прямой ручной сбор, как показано ниже (5.1) могут быть использованы для островковых Isolвания. Для получения большого количества поджелудочных желез (> 6), методом, описанным в 5.2, является предпочтительной.

  1. Прямая ручной сбор:
    1. Передача лизата из стадии 4.3 до 60 мм блюдо. Добавляют 5 мл полной среды RPMI 1640. Подведите под рассекает микроскопом.
    2. Настройка светлого поля подсветки на микроскоп. Регулировка интенсивности света до ~ 50% от максимальной мощности. При выполнении этого условия островки появляются в виде слегка розовых кластеры, в то время как ацинарных клеток , как темные неправильной формы кластеров (рис 1А). Увеличении ~ 50X (комбинируя силу объективного и окуляра) рекомендуется предложить лучший способ визуализации островками и открытие пипетка наконечника одновременно для выбора.
    3. Возьмите островки с P20 наконечником пипетки, избегая при этом ацинарные кластеров. Разливают островки обогащенным фракций на новый 60 мм блюдо с RPMI полной среды (Фиг.1В).
    4. Повторите процесс Сбор урожая вручную в два раза больше. Оставьте чистые островки в новом 60мм блюдо с 4 мл полной среды RPMI (Рисунок 1C).
  2. Центрифугирование в градиенте:
    1. Приготовьте 15 мл центрифужную пробирку, что поджат с 2 мл polysucrose и натрия диатризоат при плотности 1,077 г / мл. Оставьте пробирку на льду до момента использования.
    2. Передача суспензии со стадии 4.3 на верхней части polysucrose и натрия раствора диатризоат с пипеткой Пастера. Не беспокоить нижний слой. Тканей от 10 до новорожденной или 2 P17 поджелудочных желез могут быть загружены в каждые 15 мл трубки.
    3. Спин трубку на -600 XG в свинг ротора в течение 15 мин при 4 ° С. Используйте тормоза отключения настройки.
    4. После центрифугирования, передают СМИ и межфазные слои (обратите внимание, что при идеальных условиях эксплуатации, островки будут находиться в интерфазе между polysucrose и культуральной среды после центрифугирования) в новую 15 мл трубки. Добавьте 10 мл среды, осторожно , но тщательно перемешать.
    5. Спин вниз островок фракции, обогащеннойпри 300 х г в течение 5 мин. Удалите промывочный носитель. Повторите промывной еще раз с полной среды RPMI. Ресуспендируют гранулы в 4 мл среды, которая содержит в основном островки и протоки (рис. 1D)
    6. Ручной выбрать островки, как описано в разделе 5.1.

6. СБИС в Assays изолированные островки

  1. Инкубируйте островки с этапа 5.1.4 в полной среды RPMI в течение 2 ч при 37 ° C инкубаторе тканевых культур.
  2. С помощью пипетки, чтобы удалить RPMI под рассекает микроскопом. Добавьте 3 мл раствора КРФ с 2,8 мМ глюкозы к пластине 3. Вихревой 10 раз, чтобы вымыть островки. Удалить решения крб.
    1. Повторите процесс стирки один раз. Инкубируйте островки с 3 мл раствора KRB при 37 ° С в течение 1 ч в инкубаторе.
  3. Аликвоты 1 мл КРФ в каждую лунку 12-луночного планшета. Предварительно нагреть запас КРФ и пластины до 37 ° С в термостате.
  4. Вымойте островки дважды подогретого KRB, как в 6.2. ТрансFER 10 островки в каждую лунку предварительно подогретой пластин. Инкубируйте в 37 ° С инкубатор.
  5. Через 45 мин вывести 50 мкл надосадочной жидкости. Это содержит раствор инсулина, секретируемого под базальной глюкозы.
  6. Добавить 32 мкл 500 мМ глюкозы. Вихревой пластина 20 раз, чтобы перемешать раствор. Инкубируйте в 37 ° С инкубатор. Вихревой пластина 5 раз один раз каждые 5 минут.
  7. Через 45 мин вывести 50 мкл надосадочной жидкости. Это инсулин секретируемых под высоким содержанием глюкозы.
  8. Перенос всех островки в 1,5 мл трубки. Замораживание в -20 ° С в течение 30 мин. Разморозить при комнатной температуре в течение 5 мин. Повторите процесс замораживания и оттаивания.
  9. Добавить 0,5 мл 70% этанола, 20 мМ НСl. Оставить на ночь. Это инсулин остается в островках.
  10. С помощью обычного ELISA для анализа уровня инсулина, описанные ранее 3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

При оптимальных условиях, данный способ может дать 20 - 80 островки из каждой маленькой поджелудочной железы мыши. Это количество зависит от генетического фона, возраста мышей, а размер островков, которые будут восстановлены. Среди широко используется, CD1 из воспитанный и C57BL / 6J чистопородные мышей производят меньше островков с меньшим размером, чем гибриды между CD1 и C57BL / 6 или коммерческого B6CBAF1 / J мышей делают. Прямая рука сбор в целом дал меньшее количество островками, в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы приводим протокол шаг за шагом по изоляции островковой от поджелудочных желез, которые слишком малы для обычного перфузией. Ожидается, что выход островки готов ко всем островковых на основе исследований , таких как очистка бета-клеток, анализа экспрессии генов, островковых бета-клеток созревания, пролиферации клеток ответов стресс, выживание клеток, обмена веществ и функционального обслуживания СБИС и др. Это будет, насколько нам известно, первый подробный визуальный протокол, который направляет новых ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов в отношении описываемого произведения.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом от NIDDK (DK065949 для GG). Мы благодарим доктора Бренду М. Джарвис и Джеффа Дьюриа-младшего за прочтение рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллагеназа типа IVSigma Aldrich, St Louis, MOC5138
1x HBSS with Ca2+/Mg2+Mediatech/Cellgro, Manassas, VAMT21020CVЕсли HBSS без Ca2+/Mg2+ можно добавить CaCl2 и MgSO4 1,26 и 0,5 мМ соответственно.
RPMI 1640 без глюкозыThermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA11879-020Глюкозу необходимо добавлять до определенного уровня, чтобы не мешать последующему использованию островков
ГлюкозаСигма Олдрич, Сент-Луис, МиссуриG-7021 
полисахарозы и раствор диатризоата натрияSigma Aldrich, Сент-Луис, МиссуриHistopaque-10771
СтереоскопCarl-Zeiss, Оберкохен, ГерманияStemi2000
СтереоскопLeica, Вецлар, ГерманияLeica M165
МикроцентрифугаEppendorf, Хауппаге, Нью-ЙоркЦентрифуга 5417C
ЦентрифугаEppendorf, Hauppauge, NYCentrifuge 5810R
15-мл центрфуге пробиркиVWR, Radnor, PA89039-666
50-мл центрфуге пробиркиVWR, Radnor, PA89039-658
Прецизионные весыVWR, Radnor, PAVWR-225AC
Microfugetubes VWR, Radnor, PA87003-294
Pipetman P1000Fisher Scientific,  Уолтем, МассачусетсF123602
Пипетман P20Fisher Scientific,  Уолтем, МассачусетсF123600
100 x 15 мм тарелкаVWR, Раднор, Пенсильвания25384-088
Тарелка 60 x 15 ммVWR, Раднор, Пенсильвания25384-168
12-луночные тарелкиVWR, Раднор, Пенсильвания665-180
НожницыТонкие научные инструменты, Фостер-Сити, Калифорния14080-11
ПинцетТонкие научные инструменты, Фостер-Сити, Калифорния5708-5
мыши CD1Charles River Laboratories, Уилминтон, Массачусетс;CD-1
C57BL/6JЛаборатория Джексона, Фармингтон, Коннектикут;C57BL/6J
B6CBAF1/JЛаборатория Джексона, Фармингтон, Коннектикут;B6CBAF1/Дж
.

Ссылки

  1. Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
  2. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
  3. Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
  4. Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
  5. Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
  6. London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
  7. Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
  8. Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
  9. Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
  10. Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
  11. Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445(2015).
  12. White, J., White, D. C. Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , C.R.C. Press. (1997).
  13. Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
  14. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

HBSS
Эффективная изоляция функциональных островках из неонатальной мыши Поджелудочная железа
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.