Method Article

Обнаружение Inter-хромосомных аберраций Стабильные многократными флюоресценции В Ситу Гибридизация (mFISH) и спектральное кариотипирование (SKY) в облученных мышей

DOI:

10.3791/55162

⸱

January 11th, 2017

 ,  , 
1Division of Radiation Health, Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Environmental Health, Fay W. Boozman School of Public Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Surgical Service, Central Arkansas Veterans Healthcare System

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает полезность множественной флуоресцентной гибридизации in situ (mFISH) и спектрального кариотипирования (SKY) для идентификации межхромосомных стабильных аберраций в клетках костного мозга мышей после воздействия тотального облучения тела.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ионизирующее излучение (ИК) индуцирует многочисленные стабильные и нестабильные хромосомные аберрации. Нестабильные аберрации, при которых морфология хромосом существенно нарушена, могут быть легко идентифицированы с помощью обычных методов окрашивания хромосом. Тем не менее, обнаружение стабильных аберраций, которые включают обмен или транслокацию генетических материалов без существенных изменений морфологии хромосом, требует сложных методов рисования хромосом, которые основаны на гибридизации in situ флуоресцентно меченых ДНК-зондов, технике рисования хромосом, широко известной как флуоресценция in situ гибридизация (FISH). FISH-зонды могут быть специфичными для целой хромосомы/ов или для точной субобласти хромосомы. Этот метод позволяет не только визуализировать стабильные аберрации, но и обнаружить хромосомы/хромосом или конкретные последовательности ДНК, участвующие в формировании конкретной аберрации. В цитогенетике доступны различные техники рисования хромосом; Здесь обсуждаются два высокочувствительных метода, множественная флуоресцентная гибридизация in situ (mFISH) и спектральное кариотипирование (SKY), для выявления межхромосомных стабильных аберраций, которые формируются в клетках костного мозга мышей после воздействия тотального облучения тела. Хотя оба метода основаны на флуоресцентно меченых зондах ДНК, метод обнаружения и процесс получения изображений флуоресцентных сигналов различаются. Эти два метода использовались в различных областях исследований, таких как радиационная биология, цитогенетика рака, ретроспективная радиационная биодозиметрия, клиническая цитогенетика, эволюционная цитогенетика и сравнительная цитогенетика.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двумя наиболее надежными методами выявления радиационно-индуцированных межхромосомных стабильных аберраций являются множественная флуоресцентная гибридизация in situ (mFISH), которая позволяет окрашивать две или более хромосом одновременно, и спектральное кариотипирование (SKY), которое придает особый цвет каждой гомологичной паре хромосом в геноме. В отличие от нестабильных аберраций, стабильные аберрации являются стойкими по своей природе и могут распространяться в течение нескольких поколений в облученных популяциях1 и рассматриваются как критические молекулярные «сигнатуры» радиационно-индуцированных цитогенетических поражений2. Иссл....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все исследования на животных проводились в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол животных был одобрен Institutional Animal Care и использование комитета Университета Арканзаса для медицинских наук по. Все животные были размещены под стандартным кондиционированном вивария при температуре 20 ± 2 ° С с 10 - 15 часовых циклов свежего воздуха и свободный доступ к стандартной пище с грызунами и воды. По прибытии, были проведены мышей в карантине в течение 1 недели и при условии, сертифицированный корм для грызунов.

1.Radiat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общее облучение тела вызывает многочисленные хромосомных аберраций в клетках костного мозга облученных мышей. Текущий протокол оптимизирован для в естественных условиях митоза клеток костного мозга после радиационного облучения, урожай клеток костного мозга от задних ног облученных мышей, выделения мононуклеарных клеток костного мозга путем центрифугирования в градиенте плотности, подготовка метафазы клеток спредов и последующего обнаружение радиационно-индуцированных стабильных.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несколько важных шагов определяют успех mFISH и SKY. Первый и самый важный шаг заключается в оптимизации лечения Колхицин в естественных условиях для митоза из мононуклеарных клеток костного мозга. Концентрация и лечение колхицином время индивидуально или совместно определяют митотический индекс, а также конденсации хромосом-два важных предпосылок для эффективного хромосомной живописи. Высокая концентрация колхицин или более длительное время обработка приводит к весьма кариосферы, несовместимыми для правильной .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Арканзас космических грантов консорциума и Национального института космических исследований биомедицинской через Национальное управление по аэронавтике и исследованию космического пространства, предоставляет NNX15AK32A (RP) и RE03701 (MH-J), и P20 GM109005 (MH-J), и администрация США ветеранов ( MH-J). Мы благодарим Кристофера Fettes, координатора программы Департамента охраны окружающей среды и гигиены труда в университете Арканзаса для медицинских наук, за редакционную помощь в подготовке рукописи.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ФормамидСигма-Олдрич221198-100мл
SSC буфер 20&раз; концентратSigma-AldrichS6639-1L
SKY Laboratory реагент для мышейApplied Spectral ImagingFPRPR0030/M40
CAD - набор для обнаружения концентрированных антителApplied Spectral ImagingFPRPR0033
одиночные краски по индивидуальному заказу - 3 цвета; Хромосома мыши 1: Красная, Хромосома мыши 2: Зеленая, Хромосома мыши 3: AquaApplied Spectral ImagingFPRPR0182/10
Стеклянные покровные стеклаFisher Scientific12-545B
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
Соляная кислота, 37%, Acros OrganicsFisher ScientificAC45055-0025 
Посуда для окрашивания стекла Fisherbrand  с завинчивающейся крышкойFisher Scientific08-816
KaryoMAX Раствор хлорида калия Life Technologies10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Микроскоп СлайдыFisher Scientific12-550-15
Порошок колцемидаFisher Scientific50-464-757 
Histopaque-1083 Sigma-Aldrich10831
Shepherd Mark I, модель 25 137Cs облучательJ. L. Shepherd & AssociatesModel 484B
Шприц 1 млBD Biosciences647911
этиловым спиртом, 200 ProofFisher ScientificMEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), без кальция и магнияFisher ScientificICN1860454
фетальная бычья сывороткаFisher Scientific10-437-010
МетанолFisher ScientificA454SK-4
Ледяная уксусная кислотаFisher ScientificAC295320010
Zeiss MicroscopeZeissAXIO Imager.Z2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Inter chromosomal Stable AberrationsMultiple Fluorescence In Situ HybridizationSpectral KaryotypingBone Marrow CellsTotal Body IrradiationMetaphase Cell SpreadsFluorescence MicroscopyChromosome PaintingCytogenetic AnalysisRadiation Biology

Related Articles