Модель уха безволосой SKH1-Hr ч мыши позволяет прижизненную флуоресцентную микроскопию микроциркуляции и фототоксической индукции тромба без предварительного хирургического препарата в исследуемом микрососудистом русле. Таким образом, ухо безволосой мыши является отличным в естественных условиях модели для изучения сложных взаимодействий в процессе образования тромба, микрососудистой эволюции тромба, и тромболизис.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Прижизненные микроскопии и Тромб индукция в мочке из безволосой мыши
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Тромботический осложнения сосудистых заболеваний являются одной из ведущих причин заболеваемости и смертности в промышленно развитых странах. Из - за сложные взаимодействия между клеточными и не-клеточными компонентами крови во время образования тромба, надежные исследования физиологии и патофизиологии тромбоза могут быть выполнены только в естественных условиях. Таким образом, эта статья представляет собой модель уха в безволосых мышей и фокусируется на анализе в естественных условиях микроциркуляции, образования тромбов и развития тромбов. С помощью прижизненной флуоресцентной микроскопии и внутривенного (IV) применения соответствующих флуоресцентных красителей, повторяющийся анализ микроциркуляции в предсердии легко может быть выполнен без необходимости хирургической подготовки. Кроме того, эта модель может быть адаптирована для исследований в естественных условиях различных проблем, включая заживление ран, реперфузионного повреждения, или ангиогенеза. Таким образом, ухо безволосых мышей является идеальной моделью для в ЛьвовО исследовании микроциркуляции кожи в физиологических или патофизиологических условиях и для оценки его реакции на различное системное или местное лечение.
Введение
Целью данной статьи является описание методики прижизненной микроскопии, приложенной к ушной раковине безволосой мыши для прямого наблюдения и анализа микроциркуляции, образования тромбов и эволюции тромба. При скорости падения 1 в 1000, венозный тромбоз по-прежнему является частой причиной заболеваемости. Несмотря на то, диагностика, профилактика, стратегии и методы лечения были разработаны в последние годы, одна треть венозного тромбоза проявляется как эмболии легочной артерии 1. Артериальный тромбоз играет важную роль в сердечно-сосудистых заболеваниях, которые являются наиболее частой причиной смерти в промышленно развитых странах. Артериальный тромбоз на основе разрыва атеросклеротических бляшек участвуют в инфарктах, мезентериальных инфарктах и апоплексии. Каждая операция предоставляет субэндотелиальную структуру для компонентов крови, изменяет динамику кровотока и удерживающая пациента. В эндопротезе хирургии нижних конечностей, органы тransplantation и тромбоз лоскута хирургии являются частыми причинами осложнений. тромбоз микрососудов, в частности, часто приводит к необратимым повреждениям, из-за отсутствия клинических симптомов. Точно так же, микрососудистых тромбозов играет решающую правило в нескольких заболеваний, в том числе тромботической тромбоцитопенической пурпуры, сепсис, диссеминированного внутрисосудистого свертывания, антифосфолипидного синдрома и хронической венозной недостаточности, среди других.
Несколько новых препаратов для лечения и профилактики тромбоза были разработаны в последние годы, но антиагреганты и антикоагулянты до сих пор имеют побочные эффекты, отсутствие антагонистов, и имеют длительные эффекты продолжительности. Эти недостатки приводят к проблемам в неотложной медицинской помощи. Таким образом, необходимы дополнительные исследования, чтобы раскрыть сложные процессы , которые происходят во время тромбоза, что вряд ли может быть смоделировано в лабораторных условиях .
Голая SKH1-Hr час мыши была обнаружена в 1926 году в зоопарке в Лондоне.Из-за генный дефект на хромосоме 14, животное теряет шерсть после постнатального дня 10. Это делает хорошо кровоснабжение предсердия доступного для прижизненной микроскопии сосудов. Средняя толщина уха составляет 300 мкм. Она состоит из двух слоев дермы, которые отделены друг от друга хряща. На выпуклой спинной стороне хряща, 3 сосудистых пучков ввести мочку. Апикальные сосудистые дуги и базальные шунты соединяют три пачки. Венул имеют диаметры в диапазоне от 200 мкм (базальной) и 10 мкм (апикальный). Мелкоячеистые капилляры окружают пустые фолликулы волосы 2. Анатомия голой SKH1-Hr часа мышей делает предсердие мощной и экономически эффективной модель для исследования тромбоза.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты в естественных условиях (7221.3-1-006 / 15) были проведены в соответствии с немецким законодательством о защите животных и Руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных (Институт лабораторных животных ресурсов, Национальный исследовательский совет).
1. Общие Keeping животных
- Выполните эксперименты с самцам мышей ч SKH1-Hr в возрасте от 4 до 6 недель. Использование животных с весом от 20 до 25 г.
- Хранить животное в патогена объекта и в стандартных условиях от 24 до 26 ° C и примерно 60% относительной влажности, с устойчивым доступом к воде и пищи неограниченных объявлений.
- Продолжайте до пяти самцов животных в одной клетке. Обеспечить подстилку и обогащение материала во корпусе животных для их благополучия.
2. предварительная договоренность о животных
- Взвесь мышь и загрузить соответствующее лекарственное средство (например, каннабиноиды, 5 мг / кг веса тела (м.т.)) в шприц инсулина. Администрирование препарат за 30 мин до индукции тромба.
- Удерживая шею мыши между большим пальцем и указательным пальцем и хвостовой частью мыши с мизинцем, растянуть животное и вводят лекарственное средство внутрибрюшинно (IP) в левый нижний квадрант живота. Положите животное обратно в клетку в течение 15 мин.
- Подготовка анестезии кетамином (90 мг / кг м.т.) и ксилазина (25 мг / кг веса тела). 15 мин до индукции тромба, анестезию мыши. Поместите мышь в клетке, слегка потянуть за хвост и впрыснуть анестетиков внутрибрюшинно инсулиновый шприц.
- Положите мышь обратно в клетку до начала анестезии. Для проверки достаточной анестезии, зажать хвост с пинцетом.
- Нагрузка 0,05 мл размороженной флуоресцеина изотиоцианат-меченого декстрана (FITC-декстрана, 5%, 150 кДа) в инсулиновый шприц. При заполнении шприца, убедитесь, что пузырьки воздуха не остаются, потому что даже небольшой intravenouslу (IV) -administered пузырьки воздуха могут привести к летальному исходу для животного.
- Поместите наркозом мыши на нагревательной пластине в положении лицом вниз. Регулировка нагрева пластины до 37 ° C.
- Поместите глазную мазь на роговице мыши. Дезинфекция кожи и использовать стерильные инструменты.
- Вышивание две шовных материалов из полипропилена 7/0 в краниальный и каудальный край правого уха. Поместите стежки как можно ближе к краю , и как проксимально к основанию , насколько возможно (фиг.).
- Сдвиг мыши дорсальной позиции. Закрепить все ноги на платформу acrylglass с помощью скотча. Крюк шовного материала под передними зубами и поместите голову в сгибание, придерживаясь шовного материала к acrylglass с клейкими полосками.
- Транслоцироваться животное на платформе под стереоскопическим операции. Используйте 16X увеличение.
3. Подготовка левой яремной вены и инжекции FITC-декстрана
Примечание: Для микрофонаroscopy правого уха, подготовить левую яремную вену.
- Используя скальпель, создать 5-мм разрез в коже на левой стороне шеи в кранио-каудальном направлении. Проанализируйте подкожную ткань с microforceps и microscissors. Либо перевязать сосуды пересечения с полиэфирной 8/0 швами или с электрокоагуляции.
- Освободить вены от его адвентиции с помощью microforceps и microscissors, не касаясь судна.
- Используйте подготовленный инсулиновый шприц для инъекции флуоресцентного красителя. Осторожно возьмите стенку сосуда с microforceps, без прокалывания вены. Проникнуть Надуваемые стенки сосуда с шприц и вводят FITC-декстран внутривенно.
- Остановить кровотечение после снятия шприца с помощью ватного тампона. Избегайте крови и окрасить загрязнение уха.
4. Позиционирование правого уха прижизненной флуоресцентной микроскопии
- Передача животное на нагревательной плите до acrylglass сonstruction с прорезью для нагревательной плиты и 0,5 см высоты плоскости для позиционирования уха.
- Закрепить животных лицевой стороной вниз на нагревательной пластине с помощью скотча. Поместите относительно сильный и выпуклого хряща у основания уха рядом с 0,5 см высоты плоскости для уха (рис 1B) , так что апикальная часть уха может быть расположена на плоской плоскости.
- Добавьте одну каплю при комнатной температуре 0,9% NaCl в acrylglass плоскости для того, чтобы расположить ухо. Поместите правое ухо, с заранее подготовленные швы на вогнутой вентральной стороне, обращенной вниз, на каплю 0,9% NaCl. Используя ватные тампоны, впитывать капли NaCl и пусть капиллярные силы прикрепить плоскость уха к acrylglass.
- Лента швы на acrylglass, чтобы зафиксировать положение уха.
- Добавьте одну каплю 0,9% NaCl при комнатной температуре к выпуклой спинной стороне уха. Осторожно положить одну покровные (0,5 см диаметра) на ухе, не сжимая базальные сосуды, входящих тысе ухо. Используя ватные тампоны, удалить как можно больше NaCl, как это возможно из-под покровным, чтобы минимизировать расстояние между покровным и целевым ухом сосудами.
5. витальных флуоресцентной микроскопией и тромбов Индукционная правого уха
- Регулировка прижизненной флуоресцентного микроскопа для FITC-декстран визуализации (450 - 490 нм; FT: 510; LP: 520). Используйте переменную 100 Вт ртутной лампы в качестве источника света. Подключение высокого разрешения, черно-белая ПЗС-камеры на DVD-рекордер.
- Передача животных на acrylglass, содержащей нагревательную пластину с фиксированным похищены ухом к столу прижизненного флуоресцентного микроскопа.
- Используя 20X увеличение (20X / 0.95 числовой апертуры) и интенсивность света 20%, поиск венозного сосуда 50 - 60 мкм в диаметре и с антероградным кровотоком 400 - 600 мкм / с.
- Добавьте одну капли воды комнатной температуры на покровный для воды погружения 63x magnificatioп цель (63X / 0.95 числовой апертуры). Используйте шприц с канюлей диаметром 1 мм и поместите каплю на цели микроскопа. Добавить достаточно воды, чтобы связаться с покровным и целью с каплей воды.
- Сразу же после нанесения капли воды, начать запись судна в течение 20 с 20% -ной интенсивности света для измерения в автономном режиме потока диаметра и крови.
- Начало тромба индукции через 5 мин после инъекции FITC-декстрана. С этой целью повысить интенсивность света до 100%.
- Во время индукции тромба, закрыть отверстие микроскопа в течение 2 с в течение 30-х лет, чтобы проверить поток крови. В случае возникновения кровотока, откройте диафрагму снова. В случае остановленного потока крови, наблюдать за судном в течение 30 сек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Судно классифицируется как окклюзировано если поток замирает в течение 30 секунд или более, или если кровь течет ретроградно. Если прямоходящий поток крови начинается снова, полностью открыть диафрагму и Contin ие индукции тромба до окклюзии сосуда происходит, как описано выше. Во время ранней индукции тромба, гарантировать, что время, когда отверстие было закрыто, чтобы проверить поток крови как можно короче, чтобы поддерживать почти непрерывный эпи-освещение. Позже, во время роста тромба, судно перфузии с меньшим флуоресцентным красителем, так что можно наблюдать непрерывно. - Выбор и закупорить 5 судов в ухо. Ограничение времени индукции тромба под микроскопом приблизительно 1 ч после инъекции FITC-декстрана.
6. Последующая деятельность
- Выполните закрытие раны шеи с помощью чрескожного полипропилена 6/0 швов.
- Во время восстановления после анестезии, положить мышь обратно в клетку и согревать животное с помощью инфракрасного света.
- Передача записанных данных с DVD-рекордера программного обеспечения, позволяющего измерение диаметра сосудов и скорости кровотока.
- Пусть животное восстановить и устранить все вводили FITC-декстрана в течение 48 часов.
- Перезапустите шаги, описанные выше, на этот раз готовит правую яремную вену и левое ухо.
8. Ткань Asservation
- После того, как прижизненная флуоресцентной микроскопия левого уха, пробы 0,5 мл крови из вены ретробульбарного сплетения глаза с использованием стеклянного капилляра. Осторожно проникнуть во внутренний угол глазной с завинчивания движениями, пока венозную кровь не течет через капилляр. Собрать зонд в пробирку крови этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
- После забора крови, принести в жертву животное путем инъекции 500 мг / кг веса тела кетамина в хвостовую вену.
- Граф клеток крови с помощью гематологического анализатора для количественной оценки лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, гемоглобина, и гематокрита.
- Центрифуга оставшейся крови ЭДТА при 2500 XG и комнатной температуре в течение 10 мв. Пипетке и заморозить плазму крови для дальнейших исследований.
- Используя ножницы, разрезать предсердия и зафиксировать их в 4% -ном формалине для гистологического исследования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эффекты каннабиноидов лечения на тромбообразование
После инъекции 0,05 мл FITC-декстрана, фототоксические индукции тромба приводит к повреждению эндотелия и образованию пристеночного тромба (фиг.2 и 3). В настоящем исследовании, тромб индукции после внутрибрюшинной инъекции каннабиноидов (5 мг / кг веса тела) или транспортного средства приводит к тромботической окклюзии сосуда во всех венул
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Есть несколько важных шагов для успешной индукции тромба в мочке уха мышей ч SKH1-Hr. Для устранения неполадок, соответствующие этапы протокола, указаны в скобках.
условия Экзаменационные идеальны у молодых животных в возрасте 4 - 6 недель и с низким ороговения эпидермиса. В более старых животных, качество визуализации сосудов хуже и менее сопоставимы за счет более высокой расстояния между поверхностью кожи и целевых сосудов (этап 1.1).
Для того, чтобы...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Авторы не имеют никаких подтверждений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Мышки СХ-1/ч | Charles River | 477 | можно приобрести у других продавцов |
| стандартный | лабораторный пищевой ssnuff Spezialdiaeten | V1594-0 | можно приобрести у других продавцов; |
| операционный стереомикроскоп | Leica | M651/M655 | можно приобрести у других продавцов; |
| прижизненный микроскоп | Zeiss | Axiotech Vario 100 | можно приобрести у других продавцов; |
| цель (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 Вт; План-НЕОФЛУАР | можно приобрести у других продавцов; |
| объектив (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 Вт; ACHROPLAN | можно приобрести у других продавцов; |
| черно-белая CCD-камера | Пипер | FK 6990 IQ-S | можно приобрести у других продавцов; |
| DVD-рекордер | Panasonic | DMR-EX99V | можно приобрести у других продавцов; |
| натрия хлорид | Braun | 5/12612055/1011 | можно приобрести у других продавцов |
| Кетамин 10% | Bela pharm | F3901-6 | можно приобрести у других продавцов |
| Ксилазин 2% | Bayer | 6293841.00.00 | можно приобрести у других продавцов |
| ФИТК-дестран 5% | Сигма | 46945-100MG-F | можно приобрести у других поставщиков |
| дексапантенол 5% глазная мазь | Bayer | 6029009.00.00 | можно приобрести у других продавцов |
| формальдегид 4% | Sigma | HT501128-4L | можно приобрести у других продавцов; |
| DMSO | Sigma | 472301 | можно приобрести у других поставщиков; |
| накладки 5 x 5 x 1 мм | Menzel | L4339 | можно приобрести у других продавцов; |
| Клейкие ленты | Leukosilk | 4683400 | можно приобрести у других производителей |
| центрифуга | Beckman Coulter | CLGS 15 | можно приобрести у других продавцов; |
| гематологический анализатор | Sysmex | KX-21 A6980 | можно приобрести у других вендоров; |
| ЭДТА-пробирка для крови | Sarstedt | 201,341 | можно приобрести у других продавцов |
| ватные палочки | Sanyo | 604-A-1 | можно приобрести у других продавцов; |
| инфракрасный фонарь | Beurer | 5/13855 | можно приобрести у других продавцов; |
| одноразовый синринг | Braun | 2020-08 | можно приобрести у других поставщиков |
| инсулиновый шприц | Braun | 9161502 | можно приобрести у других продавцов; |
| одноразовые иглы для подкожных инъекций | Braun | 465 7640 | можно приобрести у других продавцов; |
| сквозной капиллярный | Sarstedt | 19,447 | можно приобрести у других продавцов |
| нагревательную плиту | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | можно приобрести у других производителей |
| ножницы 14,5 см | Aesculap | BC259R | можно приобрести у других вендоров |
| иглодержатель | Aesculap | BM081R | можно приобрести у других продавцов |
| микрощипцы | Aesculap | BD331R | можно приобрести у других вендоров; |
| микроножницы | Aesculap | OC496R | можно приобрести у других вендоров; |
| скальпель 21 | Дальхаузен | 11.000.00.511 | можно приобрести у других продавцов |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | можно приобрести у других поставщиков |
| Пролен 6-0 | Ethicon | XN8706. P33 | можно приобрести у других вендоров |
| электрокаутер | Servoprax | H40140 | можно приобрести у других вендоров; |
| Прокладка | со встроенным подогревом, 0,5 см высотой |
Ссылки
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity. Biofactors. , (2016).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).
- Goertz, O., et al. Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing. Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).
- Goertz, O., et al. Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo. J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).
- Roesken, F., et al. A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse. Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).
- Sorg, H., et al. Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model. Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).
- Sorg, H., et al. Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study. Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).
- Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells. Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331(1975).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).
- Grambow, E., et al. Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice. Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).
- Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).
- Harder, Y., et al. Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin. Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).
- Langer, S., et al. Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice. Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).
- Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction. Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).
- Herrmann, K. S., et al. Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran. Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).
- Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo. Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).
- Lee, W. M., Lee, K. T. Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding. Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).
- Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels. Angiology. 11, 35-39 (1960).
- Rosen, E. D., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).
- Agero, U., et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).
- Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels. Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).
- Bilheiro, R. P., et al. The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis. Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).
- Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases. Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
