Методическая статья

Анализ Synaptic модуляция Дрозофилы Фоторецепторы после экспозиции продолжительному воздействию света

DOI:

10.3791/55176

⸱

10 февраля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience of Disease, Center for Transdisciplinary Research, Niigata University, 2Brain Research Institute, Niigata University, 3Image and Data Analysis Facility, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 4Graduate School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology (Titech), 5Dendrite Differentiation, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы покажем , как определить число и пространственное распределение синаптических активных зон в дрозофилы фоторецепторов, выделенный с генетически закодированного молекулярным маркером, и их модуляция после длительного воздействия света.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нервная система обладает замечательной способностью приспосабливаться и реагировать на различные стимулы. Эта нейронная регулировка во многом достигается за счет пластичности на уровне синапса. Активная зона (АЗ) является областью на пресинаптической мембране, который опосредует высвобождение нейромедиаторов и состоит из плотной коллекции каркасных белков. AZS дрозофилы (Drosophila) фоторецепторы подвергаются молекулярной ремоделирования после продолжительного воздействия естественного окружающего света. Таким образом, уровень активности нейронов может перестраивать молекулярную состав AZ и внести свой вклад в регулирование функционального выхода.

Начиная с подготовки экспозиции света установленный вплоть до иммуногистохимии, этот протокол подробно описано , как определить число, пространственное распределение и уровень делокализации синаптических молекул на AZS в Drosophila фоторецепторов. С помощью анализа изображений SOFtware, были идентифицированы кластеры GFP-плавленого AZ компонент Bruchpilot для каждого R8 фоторецепторов (R8) аксона. Обнаруженные пятна Bruchpilot были автоматически присвоены отдельным аксонов R8. Для того, чтобы вычислить распределение частоты пятна вдоль аксона, мы реализовали плагин заказного программного обеспечения. старт-очку AXON и конечной точки были вручную определены и положение каждого пятна Bruchpilot проецировалось на соединительной линии между начальной и конечной точкой. Кроме того, количество кластеров Bruchpilot, мы также количественно уровень делокализации Bruchpilot-GFP внутри кластеров. Эти измерения отражают в деталях пространственно разрешенная динамика синаптические в одном нейроне при различных условиях окружающей среды на раздражители.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модуляция синаптической функции способствует замечательной способности нервной системы, чтобы точно реагировать или адаптации к изменению внешних стимулов. Регулировка пресинаптического вероятность выхода пузырек является одним из способов управления синаптическую силу 1. Synaptic релиз везикулы происходит в активной зоне (АЗ), специализированной области пресинаптической мембраны 2. АЗ характеризуется кассетой специфических белков 3, 4. Большинство белков , способствующих сборке AZ высоко консервативны у нематод, насекомых и млекопитающих 5. Недавние исследования показали, что уровень активности нейронов регулирует молекулярный состав АЗ, что в свою очередь способствует регуляции функционального выхода в пробирке и в естественных условиях 6, 7,> 8. Ранее мы обнаружили , что фоторецепторов AZS подвергаются молекулярной ремоделирования у дрозофилы после продолжительного воздействия естественного окружающего света 9. В этом состоянии, мы обнаружили, что количество Bruchpilot (BRP) -положительным AZS была снижена в фоторецепторных аксонов.

БРП / CAST / семьи ELKS белки являются основными строительными блоками AZS в позвоночных и беспозвоночных синапсах 10. В BRP мутантов Drosophila, вызванных релиз везикулы подавляется 11, 12. 17 С-концевые аминокислотные остатки BRP имеют важное значение для синаптической везикулы кластеризацию в Drosophila нервно - мышечном соединении (НМС) , 13, 14. Эти исследования показали центральную роль этой молекулы в организации и функции AZ. С помощью недавно разработанного генетического инструмента, Synaptic мечения с рекомбинацией (СтАР), BRPможно наблюдать в естественных условиях в конкретных типах клеток, на эндогенные уровни экспрессии и в одном разрешении синапса 15. Этот инструмент делает возможным оценить эндогенные динамику синапсов количественно в сложной центральной нервной системы.

Там было несколько исследований, в том числе синапсов количественными на основе данных, полученных из конфокальной микроскопии. Синаптические изменения были оценены путем измерения длины, площади, объема, плотности и подсчета числа, основанные на сложных программных приложений. Например, бесплатное программное обеспечение ImageJ предоставляет метод для количественного определения общей синаптической области и меры синаптической плотности в Drosophila NMJ 16. Число колокализации участков до и постсинаптических маркеров были количественно с помощью плагина "Puncta Analyzer" , доступных на ImageJ программной платформы 17. С другой стороны, несколько парПрограмма на основе adigm числовая вычислительная среда, синапс детектор (Synd), может автоматически отслеживать дендритов нейронов , меченных флуоресцентным маркером, а затем квантифицирует синаптические уровни белка в зависимости от расстояния от тела 18 клеток. Программное обеспечение Synaptic Puncta анализ (SynPAnal), был разработан для проведения экспресс-анализа 2D-изображений нейронов, полученных из конфокальной или флуоресцентной микроскопии. Основная функция этого программного обеспечения является автоматическое и быстрое количественное определение плотности и интенсивности белка Puncta 19. В последнее время , автоматический алгоритм обнаружения синапс обучения на основе был создан для количественного определения синаптической числа в 3D 20, воспользовавшись 3D визуализации-Assisted анализа (Vaa3D) программного обеспечения 21.

Программное обеспечение для анализа коммерческих изображений также являются мощными инструментами для синаптических количественными. Например, флуоресцентномеченые рецепторы нейротрансмиттеров или пресинаптический компонент АЗ измерялись количественно в трех измерениях с разрешением одного синапса в C. Элеганс 22 или обоняния дрозофила 23, 24, позволяя сотни синапсов, быстро охарактеризовать в пределах одного образца.

Здесь мы представляем метод с помощью специального программного обеспечения для анализа изображений плагин реализован в несколько парадигм численного вычислительной среды, которая позволяет анализировать полуавтоматически несколько аспектов AZS, в том числе их количество, распределение и уровень обогащения молекулярных компонентов в нажатия кнопки АЗ. Таким образом, этот комплексный анализ позволил нам оценить динамику синаптических компонентов в аксонов терминалов в различных экологических условиях. Мы исследовали влияние освещенности на выходных синапсах взрослых фоторецепторов мух. Процедура выполняется в три этапа: 1)подготовка к освещённости, 2) рассечение, иммуногистохимии и конфокальной микроскопии, и 3) анализа изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальные методики , описанные в данном протоколе включают исключительно работать с дрозофилы и не подвергаются законы по защите животных в Германии и Японии.

1. Легкие условия экспонирования

  1. Подготовьте мух , которые переносят sensless-флиппазы (SENS-ФЛП) и bruchpilot-FRT-СТОП-FRT-GFP (БРП-FSF-GFP) 15 для визуализации BRP-GFP в фоторецепторов R8 нейронов (R8s). Геномные кодирующий локус BRP в бактериальный искусственную хромосому (BAC) был модифицирован для генерации этого BRP-FSF-GFP конструкции. В мух , несущих этом модифицированном BAC экспрессию BRP-GFP находится под контролем эндогенных регуляторных последовательностей, но ограничивается R8 фоторецепторов после sensless-флиппазы опосредованной удаления FRT-СТОП-FRT кассеты 15. Обратите внимание , что SENS-ФЛП редко выражает флиппазы в R7s.
  2. Держите мух в течение 12 ч LiGHT / 12 ч темнота (LD) при 25 ° C от стадии личинки до вылупления (фиг.1А).
  3. Сбор мух 0 - 6 ч после вылупления и поместить их в новый флакон, содержащий летучую пищу.
  4. Установить чаш в прозрачную стойку из акриловой смолы с тремя ступенями (с высоты 41 см, основание 21 см, толщиной 4 см и высотой 13 см для каждого шага) (рис 1b).
  5. Отрегулировать расстояние между стойкой и светодиодной панели , чтобы обеспечить освещение со средней интенсивностью 1000 люкс с использованием цифрового люксметр (фиг.1С).
  6. Держите мух в течение 1 - 3 дней при одном из следующих условий: постоянная темнота (DD), 12 ч свет / 12 ч темнота (LD), или постоянный свет (LL) при 25 ° С в небольшом инкубаторе (1А и 1С).

2. Вскрытие, Immunohistochemistry и обработка изображений

  1. Рассеките летать мозги с пинцетом, исправить их с 4% Formaldehyde и immunostain с первичным антителом против Chaoptin (1:50) и второе антитело , для визуализации фоторецепторов , основанных на ранее экспериментальных процедур 25. Кратко:
    1. Готовят 0,1% Тритон Х-100 в PBS (0,1% ПБТ). Этот раствор используют для улучшения проникновения антител ткани.
    2. Обезболить мух на CO 2 площадки, разобраться правильно генотип и перевести их в чашку Петри , заполненную 0,1% PBT.
    3. Палка щипцов под хоботка и снять правый и левый глаз соответственно с другими щипцами.
    4. Удалите хоботок и трахею, прикрепленную к мозгу.
    5. Передача мозга с пинцетом в пробирку, содержащую 1,5 мл 150 мкл 0,1% PBT при комнатной температуре.
    6. В течение 10 мин повторяют от 2.1.3 - 2.1.5, чтобы получить как можно больше мозгов, как это возможно.
    7. Добавить 50 мкл 16% формальдегида в пробирку и перемешать с помощью пипетки.
    8. Выдержите мозги в закрепителя в комнатетемпература в течение 50 мин.
    9. Промыть три раза с 200 мкл 0,1% PBT с микропипетки, обращая внимание, чтобы оставить мозги в трубке.
    10. После последней промывки удалите 0,1% PBT и добавляют раствор первичного антитела, получали следующим образом: добавляют к 196 мкл 0,3% PBT (0,3% Тритон Х-100 в PBS) 4 мкл анти-Chaoptin антител (конечное разведение 1 : 50) для визуализации фоторецепторов.
    11. Выдержите мозги в растворе первичного антитела при 4 ° CO / N.
    12. Промыть 3 раза с 200 мкл 0,1% PBT с помощью микропипетки.
    13. После последней промывки удалите 0,1% PBT и добавляют 200 мкл 0,3% PBT, содержащее вторичное антитело.
    14. Инкубируют в темноте при 4 ° CO / N.
    15. Промыть три раза с 200 мкл 0,1% PBT с помощью микропипетки.
  2. Для монтажа, поставить два маленьких капель (2 мкл каждая) монтажной среды с помощью микропипетки в центре предметного стекла микроскопа приблизительно 2 см Количессть друг от друга.
  3. Поместите два покровных, по одному на каждую каплю и оставить узкую щель между покровные приблизительно на 0,2 мм.
  4. Поместите 15 мкл монтажной среды на верхней части покровного стекла и добавить мозг с помощью микропипетки в монтажную среду.
  5. Под микроскопом рассекает, поместите мозг с вентральной стороной вверх в узкий промежуток между двумя покровные (рис 2).
  6. Поместите покровное сверху и запечатать края покровного стекла с помощью прозрачной лак для ногтей , чтобы исправить образца (рисунок 2).
  7. Получение изображений головного мозга с помощью конфокальной микроскопии. Используйте 63X масло погружения линзы объектива (NA) 1.4 и цифровым зумом 2.6x. Генерирование более 20 оптических секций второго оптического ганглия мозговом с размером шага 0,5 мкм.

3. Генерация пятнах, надводных объектов, запуск точек и конечных точек

  1. Для того, чтобы определить число, в Distribution и уровень Делокализация BRP-GFP Puncta, открыть стек , полученный с помощью конфокальной микроскопии в области программного обеспечения для анализа изображений и воссоздавать 3D - изображений (рис 3А). Обратите внимание, что шаг в этом исследовании проводили с Imaris.
  2. Определение Puncta BRP-GFP модулем обнаружения пятна для каждого аксона R8.
    1. Выберите "Добавить новые места".
    2. Выберите "Сегмент только интересующей области" в настройках алгоритма. Выберите аксона R8 в мозговом вручную.
    3. Выберите канал источника сигнала BRP-GFP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: фоторецепторов аксоны R7 и R8 были immunolabeled с анти-Chaoptin (рис 3А). Только R8, хотя, содержит BRP-GFP Puncta и , таким образом , можно было бы легко отличить (Фиг.3А). Кроме того, конечная точка R8 может быть идентифицирован истончением анти-Chaoptin-позитивных аксонов в точке входа в продолговатом слой М3.
    4. Установить оценочную диаметр XY тO 0,35 мкм и галочкой "вычитание фона" в обнаружении пятна.
    5. Выберите "Качество" в тип фильтра и фильтр автоматически. Затем нажмите кнопку Готово.
    6. Повторить от 3.2.1 t- 3.2.5 для других аксонов R (рис 3B).
  3. Для измерения уровня делокализации BRP-GFP в R8 аксонов, создавать объекты на поверхности с помощью функции "Поверхность" для каждого аксона (рис 3C).
    1. Выберите "Добавить новые поверхности".
    2. Выберите "Сегмент только интересующей области" в настройках алгоритма. Затем выберите аксона терминалов R8 в мозговом веществе вручную.
    3. Выберите исходный канал фоторецепторов.
    4. Отметьте "Smooth".
    5. Выберите "Абсолютная интенсивность" порога.
    6. Установите флажок "Включить". "Семенной Диаметр точек" составляет 0,5 мкм.
    7. Выбор типа фильтра "Качество" и "Количество вокселей", а затем фильтровать автоматизацчески.
    8. Перейдите к пункту "Edit" и удалить куски поверхностей, образующихся на других неинтересные аксонов.
    9. Повторите с 3.3.1 - 3.3.8 для других аксонов R (рис 3C). Примечание Некоторые объекты поверхности были прерваны из-за худобы и слабого сигнала в фоторецепторов в слое M2, но они по-прежнему рассматриваются как единый объект от начала до конечных точек.
  4. Для того, чтобы определить распределение BRP-GFP Puncta вдоль каждого нейрона в продолговатом нейропиля, определить начальную точку и конечную точку с функцией точки измерения (рис 3D).
    1. Выберите "Добавить новые точки измерения". Затем выберите "Edit" и выберите "Поверхность объекта" до пересечения с верхней части объектов поверхности.
    2. Помещенный точек измерения на верхней поверхности объектов R аксонов в слое M1 в порядке. Они в настоящее время определяется как старт-точек (рис 3D).
    3. Выберите "Добавить новые точки измерения".Затем выберите "Edit" и выберите "Поверхность объекта" до пересечения с нижней части объектов на поверхности.
    4. Помещенный точек измерения на нижней поверхности объектов R аксонов в слое М3 в порядке. Они теперь определяются как конечные точки (рис 3D).
  5. Для вычитания фонового сигнала из канала GFP, создавать объекты на поверхности, пятна, запуск точки и конечные точки для двух R аксонов в слое M6 (рис 3Е).
    1. Выберите "Добавить новые поверхности".
    2. Выберите "Сегмент только интересующей области" в настройках алгоритма. Затем выберите аксона R7 между M5 и M6 слой вручную.
    3. Выберите исходный канал фоторецептора.
    4. Отметьте "Smooth".
    5. Выберите "Абсолютная интенсивность" порога.
    6. Выбор типа фильтра "Качество" и "Количество вокселей", затем фильтр автоматически.
    7. Выберите "Добавить новые пятна";.
    8. Выберите "Пропустить автоматическое создание, редактирование вручную".
    9. Выберите "Центр Object" и добавить место во внутренней области поверхности объекта генерируется из 3.5.1 - 3.5.6.
    10. Повторить от 3.5.1 - 3.5.9 для другого аксона R7.
    11. Выберите "Добавить новые точки измерения". Затем выберите "Edit" и поставить точки измерения на вершине двух поверхностных объектов кончика аксона R7 в слое M6. Они в настоящее время определяется как старт-точек.
    12. Выберите "Добавить новые точки измерения". Затем выберите "Edit" и поставить точки измерения на дне двух поверхностных объектов кончика аксона R7 в слое M6. Они теперь определяются как конечные точки (рис 3e).

4. Расчет числа пятен, распространение пятна Частота и уровень обогащения BRP-GFP с Customized Image Анализ данных программного обеспечения

  1. Скопируйте файл"XtquantifySynapseSNR.m" и папка "функции" в папку Imaris XT Matlab. Обратите внимание, что расчет в данном исследовании был проведен с заказной плагин реализован в Matlab. Скачать плагин с веб - сайта ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo~~HEAD=pobj ).
  2. Откройте набор данных с п точек, п поверхностей и 2 точечных объектов измерения, каждая из которых содержит точек измерения (п, полученные из 3.1 - 3.4). Первый объект точка измерения определяет стартовые позиции для всех аксонов. Второй объект точка измерения определяет конечное положение всех аксонов. Оба объекта точка измерения должны иметь одинаковое число точек измерения (то есть число аксонов).
  3. Выполнение обработки изображений >> CUSTOM> atsushis обнаружения синапс Vs 6.
  4. Проверьте метаданные и изменять размеры пикселов в области программного обеспечения для анализа изображений в случае, если это не правильно.
  5. Выберите канал для перфорацияormance анализа интенсивности пятен регионов и цитоплазматических регионов (канал с BRP-GFP).
  6. Определите имя файла для экспорта результатов.
  7. Определить количество бункеров и длины аксонов в процентах. Введите количество бункеров , как "10" и диапазон бункеров , как "100%" (фиг.4А и 4В).
  8. Определить регионы пятен и других цитоплазматических регионах для анализа делокализации BRP-GFP. Введите пятна радиуса как "0,35 мкм" и шириной окружающего пространства, как "50 мкм". Радиус пятна определяет область для сигнала Puncta GFP (диаметр 0,35 мкм, с центром на одном Punctum). Ширина его окрестностей определяет область для сигнала GFP в цитоплазматической области (диаметром 50 мкм, с центром на Punctum, но в том числе и только R8 и исключая все выборочные участки в цитоплазме) (рис 4A и 4С).
  9. Подождите, пока все нейронные маски не будут обработаныи экспортируются в виде PDF - файлов (рис 4В и 4С) и таблицы в формате CSV для дальнейшего анализа в таблице. Таблица CSV включает в себя количество пятен, средняя интенсивность сигнала в "цитоплазматическую области" и максимальной интенсивности сигнала в "пятно" в каждом бункере для всех аксонов R8.
  10. Откройте набор данных, подготовленный в 3.5 для вычитания фонового сигнала.
  11. Выполните обработку изображения, как описано в 4.3 - 4.9.
  12. Вычислить среднее значение общего количества и распределение Puncta BRP-GFP в таблице (рис 4D и 4E).
  13. Рассчитывают среднее значение делокализации сигнала BRP-GFP в электронной таблице отношением средней интенсивности в "цитоплазматическую области" , разделенному на максимальную интенсивность в «пятна» вычитают средней интенсивности в фоновый сигнал (рис 4F) ,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Соединение глаз дрозофилы содержит ~ 780 омматидиев, каждая из которых содержит восемь типов фоторецепторов (R1-8). R7 и R8 , проект свои аксоны второго оптического ганглия, костный мозг, где они образуют синапсы в слоях M6 и M3, соответственно 26. Для исследования влияния длительного воздействия света на молекулярный состав фоторецепторов R8 активных зон, мы воспользовались методом 15 - звездочных. Эндогенные уровни экспрессии BRP...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании мы показали, как приготовить легкие условия, чтобы выставить мух равной интенсивности света. Мы не только количественно число синаптических маркеров Puncta, но и может пространственно решить плотность синапсов вдоль аксонов и измерить уровень делокализации маркерного белка в цитоплазме областях. Эти три оценки позволяют оценить детали синаптических динамики на одном уровне нейронов в различных условиях окружающей среды. Наш протокол может быть адаптирован к различным синаптических белков, но и к лю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны Т. Sturner за полезные корректировки, обсуждения и замечания по рукописи; SL Zipursky для обеспечения запасов мух; M Schölling для выполнения обработки изображений. Часть анализа изображений была выполнена в лаборатории А. Kakita в. Эта работа была поддержана Александра фон Гумбольдта и стипендий JSPS по научным исследованиям за рубежом (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Грант-In- помощи для запуска (24800024), по инновационным районам (25110713), Мотида, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE основное финансирование (GT) и DZNE световой микроскопии Facility (CM).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ФлаконHightech, ЯпонияMKC-20
PlugThermo Fisher Sciehtific, СШАAS-275
Индивидуальный прозрачный штатив из акриловой смолы Shin-Shin Corporation, Япониявысота 41 см, основание 21 см, толщина 4 см и высота 13 см для каждой ступени
Cool инкубаторMITSUBISHI ELECTRIC, ЯпонияCN-40A
Светодиодная панельMISUMI, ЯпонияLEDXC170-W
Цифровой экспонометрCEMDT-1301
Площадка для мухиTokken, ЯпонияTK-HA03-S Чашка
Петри (35 x 10 мм)Greiner Bio-One International, Германия627102
PBS таблеткаTakara, ЯпонияT900
Triton X-100Wako, Япония160-24751
Dumont #5 ЩипцыFine Science Tools11251-20
1,5 мл тубаSarstedt, ГерманияA. 152X
Формальдегид 16%NEM, Япония3152
Pipetman P-200GilsonF123601 
Пипетман P-20GilsonF123600
Pipetman P-2GilsonF144801
антихаоптиновое антителоDSHB24B10
Alexa568-конъюгированное антитело против мышиLife TechnologiesA-11031
VECTASHIELD Mounting MediumVector Laboratories, Inc.H-1000
(76 x 26 мм)Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Германия
Покровное стекло (18 x 18 мм, 0,17 мм)Zeiss, Германия474030-9000-000
Промышленные микроскопыOlympus, ЯпонияSZ61-C-SET
Освещение стереомикроскопа Olympus, ЯпонияKL 1600 LED
конфокальная микроскопияZeiss, ГерманияLSM780
ImarisBitplane, ШвейцарияВерсия 7.6.4 или выше
MatlabThe MathWorks, Inc., США
Excel для Mac Майкрософт
Предметное стекло для микроскопа

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
  2. Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
  3. Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
  4. Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
  5. Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
  6. Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
  7. Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
  8. Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
  9. Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
  10. Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
  11. Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
  12. Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
  13. Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
  14. Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
  15. Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
  16. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
  17. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
  18. Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
  19. Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298(2014).
  20. Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177(2015).
  21. Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
  22. Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
  23. Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
  24. Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726(2014).
  25. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  26. Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
  27. Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732(2013).
  28. Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
  29. Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
  30. Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DrosophilaBruchpilot

Похожие статьи