Методическая статья

Направлено дифференциация примитивные и окончательного гемопоэтических прародителей от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/55196

⸱

1 ноября 2017 г.

 , 
1Department of Internal Medicine, Hematology Division, Washington University in St. Louis

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) культуры протоколы, используемые для различения hPSCs в CD34+ кроветворные прародителями. Этот метод использует стадии конкретных манипуляции канонических WNT, сигнализации для указания клетки исключительно для окончательного или примитивных гемопоэтических программы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одна из основных целей для регенеративной медицины является создание и поддержание гемопоэтических стволовых клеток (СКК) от человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs). До недавнего времени усилия по дифференциации hPSCs в СКК преимущественно породили гемопоэтических прародителей, которые не имеют потенциал HSC и вместо этого напоминают желточного мешка кроветворения. Эти результирующие гемопоэтических прародителями может ограниченную полезность в vitro болезни моделирования различных взрослых гемопоэтических расстройств, особенно те из лимфоидных линий. Однако мы недавно описал методы для создания Эритрею myelo лимфоидных мультилинейного окончательного гемопоэтических прародителей из hPSCs, используя протокол стадии конкретных направленного дифференцирования, который мы приводим здесь. Посредством ферментативного диссоциации hPSCs на базальной мембраны матрица покрытием пластик образуются embryoid органов (EBs). EBs различаются в мезодермы рекомбинантных BMP4, который впоследствии определяется в программе окончательное гемопоэтических ингибитором GSK3β, CHIR99021. В качестве альтернативы примитивных кроветворения определяется ингибитором PORCN, IWP2. Кроветворения далее управляется через помимо рекомбинантного VEGF и поддерживает кроветворную цитокинов. Результате гемопоэтических прародителями, созданные с помощью этого метода имеют потенциал, чтобы быть использованы для развития моделирование, в пробиркеи болезни.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) определяются как включающие в себя как человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), так и человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) и имеют уникальную возможность не только проходят самообновления в условиях соответствующего роста, но Кроме того, способность отличать в все типы клеток от трех зародышевых:1энтодермы и мезодермы эктодермы. Из-за этих уникальных способностей hPSCs провести большие перспективы для регенеративной медицины, болезни моделирования и терапии на базе ячеек2. В то время как несколько типов клеток были успешно дифференцированы от hPSCs, одна из существенных проблем является спецификацией в vitro исключительно взрослого как hPSC производные гемопоэтических стволовых клеток (СКК) и окончательное гемопоэтических прародителями.

Скорее всего препятствием для развития человека СКК от hPSCs является наличие нескольких гемопоэтических программ внутри эмбриона человека3. Первая программа, которая возникает, называют «примитивных кроветворения,» происходит в пределах extraembryonic желточный мешок ткани и лучше всего характеризуется его переходных производства erythroblast прародителями (EryP-ХФУ), макрофаги и megakaryocytes. В частности эта программа не приводить к СКК, ни это дает подъем к T и B лимфоидные предшественники. Однако желточного мешка временно привести к ограниченным окончательного гемопоэтических прародителями, например Эритрею миелоидного progenitor (EMP4,5,6,,78) и эритроидные недостаточным лимфоидных загрунтовать Multipotent с прародителем (LMPP9). Однако ни EMPs ни LMPPs полностью Multipotent с, или способных приживления HSC-как взрослых получателей. В противоположность этому позже в процессе развития, классически определенных «окончательное» гемопоэтических программа указана в регионе аорто Гонада мезонефрос эмбриона надлежащего, рождая всех взрослых гемопоэтических линии, включая HSC. Спецификации этих внутри эмбриональных окончательного гемопоэтических клеток происходит в паз-зависит от моды, через эндотелиальные и кроветворная переход от кроветворения эндотелия (он)3,10,11 ,12,,1314. Помимо воссоздания потенциала multilineage потенциал и паз зависимость этих клеток могут использоваться различать эти окончательные гемопоэтических прародителей от Эми и LMPP (Обзор ссылки3,13 ).

Понимание механизма(ов), управляющих примитивных и окончательного гемопоэтических спецификации от hPSCs вероятно, решающее значение для воспроизводимых производства окончательного гемопоэтических прародителями через разнообразные hPSC линии. До недавнего времени, hPSC дифференциация протоколы, разделяющие Multipotent с примитивным и окончательного гемопоэтических предшественники не существует,15,16,17,18 19,20,21,,2223,24,25. Многие подходы, с помощью плода бычьим сывороточным (ФБС) и/или стромы Сопредседатель культуры впервые изложил гемопоэтических потенциал hPSC дифференциации, с смеси примитивных и окончательного гемопоэтических потенциальных15,16, 17,-19,-22,-23,-25. Кроме того, многие сыворотки бесплатно гемопоэтических протоколы описал сигнал требования к спецификации мезодермы от hPSCs, который затаивает гемопоэтических потенциальных18,20,21, 24. Однако, поскольку эти методы по-прежнему вызывают гетерогенной смеси обеих программ, их использование в клинических приложений и понимание развития механизмов могут быть ограниченными.

Недавно мы построили на эти исследования, обозначив сигнала стадии конкретных требований для ACTIVIN/NODAL и WNT сигнализации в примитивных и окончательного гемопоэтических спецификации от hPSC производные мезодермы18,26 . Последний был особенно уникальным, как его использование стадии специфичных WNT сигнал манипуляции позволяет для спецификации исключительно примитив или исключительно окончательного гемопоэтических прародителями26. Во время спецификации мезодермы, ингибирование канонических WNT сигнализации с PORCN ингибитор IWP2 приводит к спецификации CD43+ EryP-ХФУ и миелоидного прародителями, не поддающиеся обнаружению лимфоидных потенциал. В противоположность, стимуляции канонических WNT сигнализации с ингибитором GSK3β, CHIR99021, во время той же стадии дифференцировки привело к полное отсутствие обнаружению CD43+ EryP-ХФУ, одновременно ведя к Спецификация CD34+CD43− он. Это население обладает миелоидного, С.Петербург-выражая эритроидные и T-лимфоидных потенциал. Последующий анализ определил это как отсутствие выражение CD7327,28 и CD18428и ее потенциал гемопоэтических был NOTCH-зависимых от28. Кроме того, одноклеточных Клональный анализ показал, что эти окончательные гемопоэтических линии может быть получен из28Multipotent с одной клетки. Взятые вместе, эти исследования показывают, что этап конкретных WNT сигнализации манипуляции можно указать чистой примитивных гемопоэтических прародителями, либо Multipotent с NOTCH-зависит от окончательного гемопоэтических прародителями.

Здесь мы приводим Наша стратегия дифференциации, которая дает исключительно примитивных или окончательного гемопоэтических прародителями, через манипуляции канонических WNT, сигнализации во время mesodermal патронирования и их вниз по течению гемопоэтических линии анализов. Этот протокол имеет большую ценность для исследователей, которые заинтересованы в производстве примитивных или окончательного гемопоэтических прародителей от hPSCs для регенеративной медицины приложений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. реагенты

  1. получить клетки линии; ЭСК или hiPSCs 1, мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) 29, OP9-DL4 стромы 30 , 31.
  2. Подготовка реагента
    1. приготовляют раствор 0,1% w/v желатина в PBS. Стерилизация автоклавированием и хранить при 4 ° C после aliquoting.
      1. Подготовить желатин покрытием пластик. Покройте 6-ну блюда с 1,5 мл 0,1% раствора желатина. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре. Непосредственно перед применением, аспирационная оставшийся раствор желатина.
    2. Подготовить MEF СМИ, сделав IMDM с 15% v/v FBS и 1 x антибиотиков. Дополнение с 2 мм L-глютамина и 400 мкм monothioglycerol (MTG) до использования и хранить при 4 ° C.
    3. Подготовить hPSC Культура СМИ как решения в среде DMEM/F12 с 20% v/v нокаут сыворотки замена (KOSR), 1 x несущественные аминокислот (NEAA), 1 x антибиотики, 55 мкм β-меркаптоэтанол, 2 мм L-глютамина и bFGF 10 нг/мл. Фильтр для стерилизации с 2 мкм фильтром и хранить в темноте при 4 ° C.
    4. Подготовка сыворотки бесплатно мыть СМИ как решение DMEM/F12 с 5% v/v KOSR и 4 мм HCl. фильтр для стерилизации с 2 мкм фильтром, аликвота и хранить в темноте на 4 ° C.
    5. Сделать 1 мг/мл DNase я решение путем растворения DNase I для 3-4 ч в ледяной, стерильные деионизированную воду на льду. Фильтр для стерилизации с 2 мкм фильтром и хранить аликвоты при -20 ° с.
    6. Подготовить решение остановить с мыть СМИ: добавить 10% FBS и 10 мкг/мл DNase I. Стоп раствор следует готовить непосредственно перед использованием.
    7. Подготовить матрицы базальной мембраны (например, matrigel, именуемый мат расписка) смесь раствор.
      Примечание: Все этапы подготовки и использования мат смесь должна производиться на льду или на 4 ° C. оттепель замороженных мат в льда при температуре 4 ° C на ночь. Разбавить мат 1:1, добавив 10 мл ледяной IMDM и холод льда при температуре 4 ° C на ночь. Разбавить мат смесь с еще 20 мл ледяной IMDM и холод льда при температуре 4 ° C на ночь. Алиготе в предварительно охлажденные трубы и хранить при температуре-20 ° C до использования. Когда все будет готово для использования, оттепель мат смесь на ночь при 4 ° C.
      1. Слой ковра клетки культуры пластин.
        Примечание: Все шаги мат плит покрытия должны выполняться на льду. Предварительно охладите 6-Ну и 24-ну пластины при-20 ° C для по крайней мере 1 час. Когда будете готовы Пальто плиты, разместите их на льду. Герб каждой скважины с 4 x разбавленный мат, удаление и повторное использование любой избыток раствора. Оставить на льду за 30-60 мин и удалить избыток мат. Химчистка ковра пластины с покрытием в 37 ° C 5% CO 2 инкубатора для минимум 3 ч. использование в течение 72 ч покрытия.
    8. Приготовляют раствор 10% бычьего сывороточного альбумина (BSA), растворяя 10% w/v BSA в ледяной, дистиллированной деионизированной воды при 4 ° C для 3-4 ч. фильтр для стерилизации с 2 мкм фильтром в бутылку, свет блокирование и магазин на 4 ° C.
    9. Подготовить раствор аскорбиновой кислоты. Медленно растворяют 5 мг/мл раствора L-аскорбиновой кислоты в ледяной, дистиллированной деионизированной воды на льду для 3-4 ч. вихревой иногда до растворения. Фильтр для стерилизации с 2 мкм фильтром и хранить аликвоты при -20 ° с.
    10. Подготовить сыворотки свободный дифференциации (СФР) СМИ, сделав решение предусмотрено IMDM:Ham ' s F-12, затем добавить 0,5% BSA, 1 x B27 и 0,5 x N2 добавки. Хранить при 4 ° C. Добавить 1 x L-глютамина, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 400 мкм MTG и 150 мкг/мл Холо трансферрина непосредственно перед использовать.
    11. Подготовить стволовых клеток сыворотки свободной культуры СМИ (например, StemPro, именуемые SP34 расписка) за производителя ' s инструкции. Хранить при 4 ° C. Добавить 1 x L-глютамина, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 400 мкм MTG и 150 мкг/мл Холо трансферрина непосредственно перед использовать.
    12. Подготовить 0,2% раствор коллагеназы II путем растворения коллагеназы II до конечной концентрации 0,2% w/v в FBS:PBS растворе 1:4. Распустить на водяной бане 37 ° C для по крайней мере 15 минут фильтр для стерилизации решение с 2 мкм фильтром и хранить аликвоты в -20 ° с.
    13. Подготовить флуоресценции активирован ячейку Сортировка (FACS) буфера как раствор 5% FBS в IMDM непосредственно перед использовать.
    14. Подготовить OP9 средства массовой информации в качестве решения α-MEM, 20% FBS, 2 мм L-глютамин и 1 x антибиотиков. Фильтр для стерилизации с 2 мкм фильтром и хранить при 4 ° C.
    15. Получить на основе метилцеллюлоза СМИ (например, MethoCult, именуемые MeC расписка) как pre-aliquoted 3 мл количествах или бутылка 100 мл. Если с помощью 100 мл MeC, по прибытии, разделить на 2,5 мл аликвоты в 14 мл конические трубы.
      Примечание: Все аликвоты должны храниться при-20 ° C. MeC среднего аликвоты следует разморозить непосредственно до использовать.

2. Мезодерма дифференциация hPSCs

  1. растут hPSC клеточных линий на MEFs до 70-80% confluency, в 37 ° C инкубатор с 5% CO 2.
    Примечание: HPSCs должны быть острыми, недифференцированные границ.
  2. Подготовить мат-покрытием пластик 24 h перед пассированый hPSCs.
    Примечание: Общее количество мат покрытием 6-ну блюд варьируется по hPSC линии. Как правило три 6-ну блюда достаточно за 6-ну блюдо вырожденная hPSCs на MEFs.
    1. Выполнить пробную фидер истощение с различных соотношениях вырожденная hPSCs:MAT скважин (1:4, 1:3, 1:2, и т.д.) до первая дифференциация определить, сколько мат покрытием 6-ну блюда должны использоваться для последующего дифференцирования.
      Примечание: 24 ч после покрытия на мат, hPSCs должно быть 80-90% притока, скопления клеток примерно 10-20 клеток в размер с.
  3. Аспирационная hPSC СМИ и добавить 1 мл 0,25% 37 ° C трипсина-ЭДТА каждому хорошо для 1 min. аспирата и добавить 1 мл стоп СМИ в каждой скважине. С помощью скребка ячейки, скрести клетки от пластины. Добавить 1 мл мыть буфера в каждой скважине.
    1. С 2 мл Серологические Пипетки, нарезанных 3 - 5 раз разбивать большие скопления клеток и клеток передать 50 мл Конические трубки. Центрифуга hPSCs на 330 x g 5 мин
  4. Ресуспензируйте клетки в общем объеме hPSC СМИ эквивалент 2 мл за хорошо покрытием мат пластик для использования. Добавить 2 мл/хорошо hPSCs в пластик и инкубировать на ночь в инкубаторе 37 ° C с 5% CO 2 и.
  5. 24 h позже, аспирационная СМИ и заменить с 37 ° C 0,05% трипсина-ЭДТА на 1 мин аспирационная трипсина-ЭДТА и добавить 1 мл стоп медиа. Скрип клетки активно с скребок ячейки. Добавьте 1 мл мыть СМИ в каждой скважине. С 2 мл Серологические Пипетки нарезанных клетки 1 - 2 раза и передачи 50 мл Конические трубки. Центрифуга клетки на 220 x g 5 мин
    Примечание: Продолжительность времени трипсина-ЭДТА лечения СёLD определяться следователь для каждой линии hPSC. Трипсин лечения следует применять для как можно дольше не вызывая диссоциации одной ячейки. Этот шаг следует отсоединить все hPSCs из пластины с покрытием мат, но не привести к диссоциации одной ячейки. Результирующая EBs должна быть в среднем 6-10 клеток,.
  6. Аспирационная средств массовой информации. С помощью 5 мл Серологические Пипетки, нежно ресуспензируйте клетки в 20 мл мыть СМИ. Центрифуга на 220 x g 5 мин
  7. Нежно ресуспензируйте EBs в день 0 СМИ (Таблица 1). Отказаться от 2 мл дифференциации носителя, содержащего EBs в каждой скважине ячейки 6-ну низким сторонник культуры блюдо с помощью Серологические Пипетки 10 мл. Место в 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 (мульти газ) инкубатора.
    Примечание: День 0 СМИ: СМИ СФР, дополнена 10 нг/мл BMP4 (Таблица 1). Для каждые две пластины hPSCs, используйте один из 6-ну низким сторонник клетки культуры блюдо.
  8. 24 h позже, добавить 2 мл 1 день СМИ (Таблица 1). Инкубировать клетки на ночь в нескольких Газовый инкубатор.
    Примечание: День 1 СМИ: СМИ СФР, дополненная 10 нг/мл BMP4 и 10 нг/мл bFGF для каждой скважины (Таблица 1).
  9. 18 h позже, аккуратно урожай EBs с 5 мл Серологические Пипетки и спина на 100 g x 5 мин мыть и объединить всю культуру с 10 мл IMDM. Закрутка на 100 g x 5 мин аспирата СМИ.
    Примечание: Мусора будет существовать в культурах. Этот шаг центрифугированием на низкой скорости (100 x g) будет удалить мусор.
  10. Нежно ресуспензируйте EBs в ЮФО СМИ с 2 день СМИ (таблица 1), а затем отказаться от 2 мл на колодец в ячейки 6-ну низким сторонник культуры пластин. Инкубировать в 37 ° C участием Газовый инкубатор для 30 ч.
    Примечание: День 2 СМИ: 10 нг/мл BMP4 и 5 нг/мл bFGF и соответствующие WNT агонистов или антагонист (Таблица 1).
    1. Добавить 3 мкм CHIR99021 для указания окончательного гемопоэтических прародителями. Кроме того, добавить 3 мкм IWP2 и 1 нг/мл Activin для указания примитивных гемопоэтических прародителями.
  11. Продолжать раздела 3 для спецификации гемопоэтических предшественников.

3. спецификации CD34 гемопоэтических прародителями +

  1. после 30 h, изолировать EBs с Серологические Пипетки 2 мл в день 3 дифференциации. Передача 50 мл Конические трубки и центрифуги на 330 x g 5 минут нежно ресуспензируйте и мыть с 10 мл IMDM. Центрифуга клетки снова на 330 x g 5 мин
  2. Ресуспензируйте EBs в день 3 СМИ (Таблица 2) и отказаться от 2 мл в каждую скважину низкой сторонник 6-ну плит. Инкубировать ячейки в нескольких газов инкубатора 37 ° C за 72 ч.
    Примечание: День 3 СМИ: SP34, дополненный 15 нг/мл VEGF и bFGF 5 нг/мл (Таблица 2). Добавьте больше средств массовой информации за хорошо если рН СМИ, найденным на 3 день дифференциации (т.е., желто оранжевый СМИ) значительно изменился. Кроме того, использовать меньше EBs в колодец на день 0.
  3. После 72 ч инкубации, добавить 2 мл 6 день СМИ (Таблица 2) в каждой скважине. Инкубировать в 37 ° C участием Газовый инкубатор для дополнительных 48 ч
    Примечание: День 6 СМИ: СМИ SP34, дополненная 15 нг/мл VEGF, bFGF 5 нг/мл, 200 нг/мл SCF, 4 МЕ ЕПВ, 20 нг/мл ИЛ-6, 10 нг/мл Ил-11 и 50 нг/мл IGF-1 (Таблица 2). Если больше средств массовой информации была добавлена в шаге 3.1, затем добавить эквивалентное количество средств массовой информации в шаге 3.2, так что окончательный цитокина концентрации остаются теми же.
  4. Изоляции CHIR99021-лечение EBs на 8 день дифференциации. Перейдите к разделу 4.
  5. IWP2-лечение EBs собирают на 8 день дифференцировку в 50 мл Конические трубки. Центрифуги на 330 x g для 5 минут нежно ресуспензируйте в день 8 СМИ (Таблица 2). Проинкубируйте 24 ч в 37 ° C 5% CO 2 инкубатора в низкой адэрентных блюда. Перейдите к разделу 4.
    Примечание: День 8 СМИ: СМИ SP34, дополненная SCF 100 нг/мл, 2 ме ЕПВ, 10 нг/мл ИЛ-6, 5 нг/мл Ил-11, 25 нг/мл IGF-1, 30 нг/мл ТПО, 10 нг/мл Flt3-L и 30 нг/мл Ил-3 (Таблица 2).

4. Ферментативный диссоциации EBs и гемопоэтических предшественников изоляции

  1. изолировать EBs с Серологические Пипетки в 50 мл Конические трубки. Центрифуга на 330 x g 5 мин аспирата покинуть супернатант.
  2. Добавить 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в EBs. Вортекс для 5 s. инкубировать в ванну воды 37 ° C для 8 мин добавить 5 мл раствора стоп. Центрифуга на 330 x g 5 мин аспирата покинуть супернатант.
  3. Ресуспензируйте EBs в 5 мл коллагеназы II. Вортекс для 5 s и инкубировать в ванну воды 37 ° C и. После 60 мин, вихревые для 5 s и добавьте 5 мл раствора стоп. Спина на 330 x g 5 мин аспирата покинуть супернатант.
  4. В 1 мл буфера СУИМ, Ресуспензируйте клетки. Клетки проходят через стрейнер клеток 40 мкм. Это удаляет любые undissociated клеток сгустки.
  5. Подсчитать количество ячеек. Аликвота 1 x 10 6 клеток в коническую пробирку 14 мл. Вращайте клетки на 330 x g 5 мин Ресуспензируйте клетки в концентрации 5 х 10 6 клеток/мл в буфере СУИМ. Алиготе и бассейн 10% ячеек в каждое условие для потока гранулярных цвет элементов управления. Инкубировать клетки в антител на 30 минут на льду, в темноте.
    : Примечание предложил Флюорофор комбинации в Таблице материалов.
    1. Для IWP2-лечение клетки, используйте антитела анти CD34 и анти CD43.
    2. Для CHIR99021-лечение клетки, используйте антитела анти CD34, анти CD43, анти CD73 и анти CD184.
  6. Промывать ячейки, дважды с помощью СУИМ буфера. Спина на 330 x g за 5 мин Ресуспензируйте клетки в конечной концентрации 5 х 10 6 клеток/мл.
  7. Анализ или изолировать клетки подачей cytometry. Для примитивных гемопоэтических прародителями Проанализируйте выражение CD34 и CD43 ( рис. 2A). Для окончательного гемопоэтических прародителями, изолировать он (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −), СУИМ ( рис. 2B). Собрать клетки в пробирки, содержащие охлажденные СУИМ буфера.
  8. Оценить окончательный потенциал гемопоэтических от изолированных он, продолжать раздел 5 эндотелия в кроветворных перехода, либо раздел 7 для T-лимфоидных assay. Для примитивных гемопоэтических ХФУ анализов, продолжать раздел 6.

5. Эндотелия в кроветворных переход

  1. спина изолированных CD34 + CD43 − CD73 − CD184 − клетки на 330 x g 5 мин Ресуспензируйте клетки в он СМИ на 200 000 клеток/мл ( Таблица 2). Распространите клетки в 50 мкл аликвоты в пластине культуры клеток 96-луночных низким сторонник. Инкубировать клетки на ночь в 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 мульти Газовый инкубатор.
    Примечание: Он СМИ: СМИ SP34 дополнена 5 нг/мл VEGF, bFGF 5 нг/мл, SCF 100 нг/мл, 2 ме ЕПВ, 10 нг/мл ИЛ-6, 5 нг/мл Ил-11, 25 нг/мл IGF-1, 30 нг/мл ТПО, 10 нг/мл FLT3-Л, 30 нг/мл Ил-3, 10 нг/мл BMP4, 20 нг/мл SHH, ангиотензин II 10 мкг/мл и 100 мкм лозартана калия в 2 x 10 5 клеток/мл (Таблица 2).
  2. Подготовить (см. шаг 1.2.7.1) пластины с покрытием мат 24-Ну, как требуется.
  3. Клетки будет совокупности в купе 6-10 клеток на ночь. Для каждого 50 мкл тома реагрегироваться клеток мягко перенесите клетки в центр 24-ну мат покрытием плиты на следующее утро. Осторожно поместите пластины в 37 ° C участием Газовый инкубатор для 4-6 ч, до тех пор, пока клетки прикрепляются.
  4. Добавить 1 мл свежего он СМИ для каждой скважины, после того, как клетки прикрепляются. Инкубировать клетки в 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 мульти Газовый инкубатор, до тех пор, пока гемопоэтические клетки являются видимыми (обычно 5-7 дней; 2D фигуры). Визуализировать 100 кратном увеличении с помощью световой микроскоп.
  5. Урожай окончательное гемопоэтических прародителями, аккуратно удалив СМИ он из клеток. Пройти этот СМИ через стрейнер клетки 40 мкм и собирать. Для адэрентных клеток в колодец, добавить 0,5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в клетки и инкубировать при 37 ° C за 5 минут добавить 0,5 мл универсальное решение для каждой скважины. Пройти через же 40 мкм клеток стрейнер объединить все сторонник и non сторонник ячейки вместе. Спина на 330 x g 5 мин
    1. Оценить ХФУ потенциал этой массовой культуры, перейдите к разделу 6.
  6. Вымыть клетки дважды в буфере СУИМ. Спина на 330 x g 5 мин
  7. Ресуспензируйте клетки в buffer СУИМ, 5 х 10 6 клеток/мл. Запятнать клетки с анти CD45 и анти CD34 антитела для 30 мин на льду в темноте (флуорофоров находятся в Таблице материалы по предложению).
  8. Мыть клетки дважды в буфере СУИМ. Спина на 330 x g 5 мин
  9. Изолировать CD34 + CD45 + клеток путем СУИМ ( Рисунок 2E). Сортировать клетки в охлажденной буфер СУИМ.
  10. Оценить окончательный CD34 + CD45 + кроветворные прародителями как необходимое (пробирного ХФУ в разделе 6, лимфоидных потенциал в разделе 7 или другой инициативе следователя пробирного).

6. ХФУ Assay

  1. оттепель аликвоты MeC для каждого образца, используемого для ХФУ assay.
  2. Добавить клетки быть Оксиметрический анализ (шаги 4.5, 4.7, 5.5 или 5.9) в MeC. Вихревой тщательно и пусть MeC культур стоять за 5-10 мин, пока пузырьки воздуха рассеиваться, в соответствии с производителем ' s инструкции. С помощью 16 ½ калибровочных иглу на шприц 3 мл, тщательно удалить 2 мл MeC.
    Примечание: Типичный обшивка плотности в диапазоне от 1000-20,000 кл/мл, в зависимости от частоты ожидаемых прародителю.
  3. Тщательно, отказаться от 1 мл смесь MeC клеток в каждом из двух блюд культуры ткани 35 мм. Равномерно распределять MeC блюдах 35 мм, осторожно нажав и поворачивая блюдо. Место каждого из вышеуказанных блюд в 15 см ткани культуры блюдо с водой. Инкубировать в 37 ° C 5% CO 2 инкубатора.
  4. Визуализация MeC культур с использованием световой микроскоп, используя 40 кратном. Количественную оценку различных ХФУ получены. Анализируйте примитивных ХФУ анализов 8-10 дней после покрытия ( рис. 2 c). Анализируйте окончательные ХФУ анализов через 14 дней после покрытия. Представитель ХФУ пробирного колонии морфологии можно увидеть в рисунке 2F.

7. Assay клетки T до установления окончательного гемопоэтических потенциальных

  1. , расти OP9-DL4 клетки до притока в 100 мм тканевой культуры блюдо 30 31 , 32.
    1. OP9-DL4 оттепель клетки 72-96 h до покрытие анализов Т-клеток. Ресуспензируйте OP9-DL4 клетки в 10 мл OP9 СМИ и обойтись в 10 см пластины. Расти в инкубатор 2 CO 5% 37 ° C до 70-90% притока.
    2. Урожая OP9-DL4 клеток от 100 мм блюдо, удалите средства массовой информации и добавить 5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА на 5 мин остановить активность трипсина с 5 мл OP9 СМИ. Спина клетки на 330 x g 5 мин Ресуспензируйте клеток в 1 мл OP9 СМИ и подсчитать количество ячеек.
      Примечание: Одна пластина 10 см вырожденная клеток OP9-DL4 даст примерно 10 х 10 6 клеток OP9-DL4.
    3. 48 ч до assay клетки T, плита 2 x 10 6 клеток в 12 мл OP9 СМИ в 24-ну блюдо (0,5 мл/хорошо). Расти в 37 ° C 5% CO 2 инкубатора.
  2. Добавить 2000-10000 клетки, чтобы быть assayed (как полученное в 4.5, 4.7, 5.5 или 5.9) 1 хорошо OP9-DL4 клеток в OP9 массовой информации дополнена: 30 нг/мл SCF (первые 6 дней только), IL-7 5 нг/мл и 5 нг/мл FLT3-л инкубировать в 37 ° C 5% CO 2 inc ubator. Нет средств массовой информации изменения происходят на этом этапе.
  3. Каждые 4 - 5 дней, проход прародителями Т-клеток на свежие OP9-DL4 стромальных клеток в 6-ну блюдо. Нарезанных клетки с 1 мл пипетки и пройти через 40 мкм фильтр для удаления сгустков. Спина на 330 x g 5 мин аспирата от средств массовой информации. Ресуспензируйте клетки в 2 мл свежего OP9 СМИ, дополнена 5 нг/мл IL-7 и 5 нг/мл Flt3-L и место на свежие OP9-DL4 клетки.
    Примечание: 48 ч до пассированый, пластина 2 х 10 6 свежие OP9-DL4 клетки в 12 мл OP9 средств массовой информации и распространять 2 мл/колодец в 6-ну блюда.
  4. После по крайней мере 21 дней совместного культуры, нарезанных клетки энергично и пройти через 40 мкм фильтр для удаления мусора ячейки. Спина на 330 x g 5 минут и удалить супернатант.
  5. Мыть ячейки дважды в холодной СУИМ буфера. Спина на 330 x g 5 мин
  6. Ресуспензируйте клетки в buffer СУИМ, 5 х 10 6 клеток/мл. Пятно клетки с анти CD45, анти CD56, анти CD4 и CD8 анти антитела для 30 мин на льду в темноте (предлагаемые Флюорофор комбинации находятся в Таблице материалов). Применить жить/мертвые клетки пятно (DAPI и т.д.) для удаления мусора из анализа.
  7. Мыть клетки дважды в буфере СУИМ. Спина на 330 x g 5 мин
  8. Анализ клеток с помощью проточный цитометр оценить наличие Т-лимфоцит прародителями ( рис. 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематическое изображение изображением индукции примитивных и окончательного гемопоэтических прародителей от hPSCs показано на рисунке 1. Мезодерма кучность канонические WNT, сигнализации, происходит во время дней 2-3 дифференциации, следуют спецификации гемопоэтических предшественников.

Анализ гранулярных представитель потока и колонии, образуя метилцеллюлоза анализов hPSC производные гемопоэтическ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод быстрого, сыворотки, строма бесплатно для дифференциации примитивных или окончательного гемопоэтических прародителями. Mesodermal спецификации примитивных или окончательного гемопоэтических прародителей может достигаться надежно с помощью нашего протокола, который однозначно эксплуатирует малых молекул ингибиторов канонических WNT сигнализации. Этап конкретных активации WNT к GSK3β ингибитор CHIR9902133 рождает окончательного гемопоэтических мезодермы, ингибирование W...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана школы медицины университета Департамента внутренней медицины, отдела гематологии, Вашингтон. CD был поддержан T32HL007088 из национального сердца, легких и крови института. CMS была поддержана американского общества гематологии ученый премии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD)Corning10-016
Фетальная бычья сыворотка (FBS), ES клеточный рейтингGemini Bioproducts100-500
Фетальная бычья сыворотка (FBS)ГиклонSH30396,03
L-глутамина, 200 мМ растворLife Technologies25030-081
Пенициллин-стрептомицинLife Технологии15070-063
0,25% Трипсин-ЭДТАLife Technologies25200056
0,05% Трипсин-ЭДТАLife Technologies25300054
Желатин, свиная кожа, тип АSigma-AldrichG1890
Alpha-MEMLife Technologies12000-022
DMEM-F12Corning10-092-CV
Заменитель сыворотки с нокаутомLife Technologies10828028"KOSR"
Заменимые аминокислоты (NEAA)Life Technologies11140050
b-меркаптоэтанол, раствор 55 мМ LifeTechnologies21985023
Соляная кислотаSigma-AldrichH1758
Фракция V, сыворотка крупного рогатого скота АльбуминFisher ScientificBP1605
Ham's F12Corning10-080
N2 добавкаLife Technologies17502048
добавка B27, без витамина АLife Technologies12587010
Stempro-34 (SP34)Life Technologies10639011"SP34"
Фактор роста снижен MatrigelCorning354230"MAT"
L-абсорбционная кислотаSigma-AldrichA4403
Трансферрин сыворотки крови человекаSigma-Aldrich10652202001
Монотиоглицерин (MTG)Sigma-AldrichM6145
Коллагеназа BRoche11088831001
Коллагеназа IILife Technologies17101015
DNaseICalbiochem260913
фосфатно-солевой буфер (PBS)Life Technologies14190144
bFGFR& D Systems233-FB
BMP4R& D Systems314-BP
Activin AR& D Systems338-AC
VEGFR& D Systems293-VE
SCFR& D Systems255-SC
IGF-1НИР D Systems291-G1
Ил-3НИР D Systems203-IL
Ил-6НИР D Systems206-IL
ИЛ-7НИР D Systems207-IL
ИЛ-11НИР D Systems218-1L
ТПОНИР D Systems288-TP
EPOPeprotech100-64
Flt-3 лиганд (FLT3-L)R& D Systems308-FK
CHIR99021Tocris4423
IWP2Tocris3533
Ангиотензин IISigma-AldrichA9525
Лозартан КалийTocris3798
CD4 PerCP Cy5.5 Клон RPA-T4BD Biosciences560650Разведение 1:100; Анализ Т-клеток
CD8 PE Clone RPA-T8BD Biosciences561950Разведение 1:10; Т-клеточный анализ
CD34 APC Clone 8G12BD Biosciences340441разведение 1:100; Анализ EHT
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12BD Biosciences348801разведение 1:100; Гемогенный эндотелий
CD43 FITC Клон 1G10BD Biosciences555475разведение 1:10; Гемогенный эндотелий
CD45 APC-Cy7 Клон 2D1BD Biosciences557833разведение 1:50; Анализ Т-клеток
CD45 eFluor450 Клон 2D1BD Biosciences642284разведение 1:50; Анализ EHT
CD56 APC Clone B159BD Biosciences555518разведение 1:20; Анализ Т-клеток
CD73 PE Clone AD2BD Biosciences550257разведение 1:50; Гемогенный эндотелий
CD184 APC Clone 12G5BD Biosciences555976разведение 1:50; Гемогенный эндотелий
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)BD Biosciences564907разведение 1:10,000; Анализ Т-клеток
OP9 DL4Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034Stemcell Technologies4034MeC"
Milli-Q система очистки водыEMD Millipore
5% CO2 инкубаторSet at 37 C
Multigas incubatorSet at 37 C, 5% CO2, 5% O2
луночный планшет для культуры тканейCorning353046
24-луночная тарелка для культуры тканейCorning353226
6-луночная тарелка для культуры тканей с низкой адгезиейCorning3471
24-луночная тарелка для культуры тканей с низкой адгезиейCorning3473
чашки для культуры тканей 35 мм Corning353001
игла с тупым концом, 16 калибрCorning305198
шприцами3 куб. смCorning309657
5 мл полипропиленовая пробиркаCorning352063
5 мл полистирольная пробиркаCorning352058
15 мл полипропиленовая коническаяCorning 430791
50 мл полипропиленовая коническаяCorning430921
2 мл серологическая пипеткаCorning357507
5 мл серологическая пипеткаCorning4487
10 мл серологическая пипеткаCorning4488
25 мл серологическая пипеткаCorning4489
Скребки для клетокCorning353085
2,0 мл криовиалыCorning430488
5 мл пробирка с 40 & микро; Ситечко МCorning352235
40 &микро; Клеточный фильтр MCorning352340
Центрифуга
Биозащитный колпак
FACS AriaII или эквивалент
LSRii или эквивалент
программного обеспечения FlowJoTreeStar
Водяная баняНабор при 37 °C
0,22 & микро; M Система фильтрацииCorning
Autoclave
4 C Холодильник-20
C Морозильная камера-80
C Морозильная камера
на клетки " 6 для клеточных культур

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  3. Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
  4. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
  5. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  6. McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
  7. Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
  8. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  9. Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
  10. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  11. Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
  12. Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
  13. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  14. Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
  15. Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
  16. Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
  17. Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
  18. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  19. Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
  20. Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
  21. Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
  22. Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
  23. Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
  24. Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
  25. Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
  26. Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
  27. Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
  28. Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
  29. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, Unit 23.2 (2001).
  30. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
  31. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
  32. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
  33. Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
  34. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
  35. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
  36. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  37. Peschle, C., et al. Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GSK3PORCNVEGFFACS

Похожие статьи