Методическая статья

Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул

DOI:

10.3791/55199

⸱

10 марта 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 2Department of Pharmacology and Physiology, Université de Montréal, 3Molecular Biology Program, Université de Montréal

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем в настоящем исследовании нового флуоресцентного анализа на основе с использованием лимфоцитов, полученных из трансгенной мыши. Этот тест предназначен для высокопроизводительного скрининга (HTS) малых молекул, обладающих мощностью либо ингибирования или содействия активации лимфоцитов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокопроизводительный скрининг (HTS) в настоящее время является основой для идентификации химических соединений, способных модулировать биохимические реакции или клеточные процессы. С развитием биотехнологий и высокой поступательной потенциала малых молекул, ряд инновационных подходов в разработке лекарств развились, что объясняет возрождающийся интерес к использованию HTS. Поле онкология в настоящее время наиболее активные исследования области для скрининга лекарственных средств, без большой прорыв сделал для выявления новых иммуномодулирующих соединений, ориентированных на трансплантацию осложнений, связанных или аутоиммунных заболеваний. Здесь мы представляем роман в пробирке мышиного флуоресцентного на основе анализа лимфоцитов легко адаптирован для идентификации новых иммуномодулирующих соединений. В этом анализе используют Т- или В клетки, полученные из трансгенной мыши, в которой промотор Nur77 управляет экспрессией GFP при t- или стимуляции рецептора В-клеток. Как отражает интенсивность GFPактивация / транскрипционной активности клетки-мишени, наш анализ определяет новый инструмент для изучения влияния данного соединения (ов) на клеточных / биологических реакций. Например, первичный скрининг проводили с использованием 4,398 соединений в отсутствие "целевой гипотезы", что привело к идентификации 160 потенциальных хитов, отображающих иммуномодулирующей активностью. Таким образом, использование данного анализа является подходящим для программ поиска новых лекарственных препаратов, исследующих больших химических библиотек до дальнейших исследований в пробирке / в естественных условиях проверки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокая пропускная способность скрининга (HTS) является проверенным стратегия широко применяется для идентификации новых терапевтических молекул или репозиционирования FDA утвержденных препаратов в новых медицинских показаний. 1 До сих пор достигнутый успех HTS может быть измерена множеством ранее обнаруженных наркотиков. Например, ингибитор тирозинкиназы лапатиниба, используемый для лечения рака молочной железы, ситаглиптином; дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4) ингибитор используют в качестве анти-гипергликемии препарата, и пероральный BCR-ABL ингибитор тирозинкиназы дазатиниб используется для лечения хронического миелолейкоза представляют несколько примеров из длинного перечня утвержденных препаратов, первоначально обнаруженных HTS. 2 Хотя производительность фармацевтической промышленности в последнее время страдает от недостатка в открытии новых химических объектов, вероятность успешного открытия новых лекарств может быть повышена за счет увеличения числа доклинических кандидаTES отображающие модуляторные биологические / биохимические свойства. Соответственно, разработка новых HTS анализов, адаптированных для фенотипического скрининга могли бы предложить потенциал, чтобы обеспечить важные фармакологические средства для открытия новых хитов наркотиков. 3, 4, 5, 6 Кроме того, HTS теперь могут быть выполнены в более быстром темпе из - за значительных технологических преобразований в последние годы в том числе специально разработанных гибких роботизированных установок, новых технологий Считывание и обширной миниатюризации. 2, 7 Среди факторов , способствующих растущий интерес к использованию фенотипического скрининга (он же вперед ФАРМАКОЛОГИЯ) является восприятие , что акцент на функциональных эффектов , а не упрощенными редукционистских предположений относительно молекулярных мишеней (целевых на основе скрининга / биохимических реакций), скорее всего , шо ш клиническая эффективность. Таким образом, фенотипический скрининг держит обещание раскрыть новые потенциально терапевтических соединений и молекулярных механизмов в настоящее время неизлечимых заболеваний. 2

Для правильной идентификации ингибиторов или активаторов для данной молекулярной мишени или клеточной функции, высокочувствительным и надежным анализ необходим для того , чтобы различать добросовестных хитов FIDE и ложных срабатываний. Итак, что делает хороший анализ? Качество данного анализа должны быть сначала судить по соотношению сигнал-шум (отраженный через Z фактор). 8 Во- вторых, целенаправленный эффект или цель экрана должны быть четко определены. Например, функциональные клеточные подходы могут предложить значительные преимущества для скрининга рецепторов, в отличие от анализа, специально предназначенные для оценки связывания лиганд-рецептор. Причина этого заключается в том, что последний подход не может дифференцировать между агонистов и антагонистов лигандов.сс = "Xref"> 9 В отличие от этого , подход на основе клеток, вероятно, будет более эффективным , как функция рецептора может быть непосредственно оценена в биологическом фенотипу (пролиферации, клеточного цикла, апоптоза, и / или дифференцировки). Тем не менее, следует отметить, что биохимические анализы могут обеспечить значительные преимущества по сравнению с фенотипическими анализами, поскольку они нарушают на специфические внутриклеточные мишени. Хорошо оптимизированная биохимический анализ, как правило, имеют меньший разброс данных, чем фенотипического скрининга при одновременном упрощении после исследований, связанных с наркотиками молекулярного механизма действия. Тем не менее, основным недостатком целевых показателей на основе или биохимических анализов является возможность усиливать уровень ложных положительных хитов, которые могут повлиять на неспецифические цели при испытании в биологической системе (потеря специфичности, первоначально изученной в биохимическом анализе). 10 Несмотря на то, хорошо налаженные точка отсечки между отрицательными и положительными хитов можно свести к минимуму число ложных срабатываний яп первичного скрининга, использование физиологически соответствующей системы, имитирующей нативную клеточную среду, таких как интактные клетки, цельной ткани или целого животного остается основой дизайна анализа маятника. Поэтому фенотипический скрининг позволяет открытие свинца с желаемыми биологическими / фенотипических эффектов для заболеваний без каких-либо идентифицированных мишеней для лекарственных средств без предварительного знания о деятельности соединения или способа действия. 11

Исследование здесь, относится к разработке и тестированию оптимизированной и воспроизводимым скрининга фенотипической на основе двух важных компонентов: коммерчески доступной модели мыши и кластерном подсемейство химических соединений. Что касается животной модели, анализ основан на использовании лимфоцитов , полученных из штамма мыши (Nur77 GFP) укрывает бактериальную искусственную хромосому , содержащую кассету , в которой экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP) приводится в движение гое Nur77 промотор. 12 Отличительной чертой данной стимуляции основана на том факте , что Nur77 является непосредственным раннего гена повышающей регуляции следующие Т-клеточного рецептора (TCR) или рецептора В-клеток (BCR) стимуляции. 12 Что касается самого метода скрининга, подход был использован , чтобы помочь избежать скрининга тривиальных аналогов при одновременной минимизации времени , необходимого для оценки большой химической библиотеки (> 10 5 соединений). Для этого, база данных химических соединений, выбранных лекарственных химиками с использованием виртуальных инструментов скрининга была использована для выявления топологически подобных соединений, используя известные активные семенные структуры как ссылки. Такой подход позволил нам экран 4398 соединений, представляющих общую библиотеку из более чем 136000 химических объектов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все протоколы животных были одобрены Animal Care комитета Монреальского университета путем. Мыши были подвергнуты эвтаназии путем постепенного ингаляции СО 2 , пока не жизненно важных признаков не наблюдалось с последующим смещением шейных позвонков. Процедура была выполнена сертифицированным лицом, чтобы гарантировать, что животные были умерщвлены гуманным образом и в соответствии с рекомендациями Канадского совета по уходу за животными.

1. Получение спленоцитов среды и Flow-цитометрии буфера

  1. Выполните все шаги в соответствии с 70% этанола очищенную биологической капюшоном.
  2. Удалить 70 мл подогретого Roswell Park Memorial института (RPMI) 1640 1x среда (коммерчески доступный и поставляется в отфильтрованных 500 мл объема стерильные бутылки) и поместить в стерильную пробирку. Снятую среда будет использоваться позже в протоколе.
  3. Дополнение оставшиеся 430 мл среды RPMI 1640 1x 50 мл инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5мл HEPES, 5 мл несущественные аминокислоты, 5 мл пирувата натрия, и 0,05 мл отфильтрованные (1M) 2-меркаптоэтанола.
    Примечание: Предварительно теплая спленоцитов среда с использованием водяной бане при температуре 37 ° С, чтобы избежать тепла шокируя клеток. Это важно, чтобы избежать индукции клеточного апоптоза.
  4. Для подготовки буфера потока цитометрии, добавьте 2 мл ФБС до 98 мл фосфатным буферным раствором (PBS) и хранить в холодильнике до использования (предпочтительно в течение трех дней).

2. Получение спленоцитов суспензии клеток из Nur77 GFP мыши селезенок

  1. Septically изолировать селезенку от 6-8 недельных самок Nur77 GFP мыши.
    1. Для достижения этой цели, работают под капотом стерильной. Замочите жертвенного мыши меха, ножницы и пинцет в 70% этаноле.
    2. Положите мышь на правой стороне, порезать кожу и мышцы в верхнем левом квадранте живота. Осмотрите область разреза, чтобы визуально локализовать селезенку затем вырезать его. Держите селезенкув спленоцитов среде на льду до готовности выполнить следующий шаг.
  2. Поместите селезенку (ы) в 10 см 2 для культивирования клеток , чашку Петри , содержащую 5 мл подогретого спленоцитов среды.
  3. Разомните селезенки с помощью стерильного шприца до тех пор, пока раствор не станет мутным. Коллагеновая матрица селезенка должна оставаться в конце процедуры.
  4. После обширной затирания в спленоцитов среде, собирают клеточную суспензию и передать его через сито 70 ячейки мкм, помещенного на трубке 50 мл отфильтровать любой мусор или сгустки.
  5. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин. После удаления супернатанта, повторно приостанавливать осадок клеток в 2-3 мл произведенный на заводе или коммерческого красного буфера для лизиса клеток крови. После пипеткой (в 2-3 раза) пусть подвесную отдых в течение 20-30 сек.
  6. Добавьте 5 мл PBS или подходящий буфер выбора затем центрифугировать клеточной суспензии в течение 5 мин при 500 х г.
  7. Удалить супернатант (должен быть красным цветом, поскольку она содержит растворенные красные бLOOD клетки) и повторно приостанавливать осадок клеток в 2 мл среды спленоцитов.
  8. С помощью гемоцитометра, подсчитывают количество клеток, окрашенных трипановым синим, чтобы различать между живыми и мертвыми (некротизированных) клеток.

3. Выделение Т-клеток из клеточной суспензии спленоцитов

  1. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 500 х г. Повторное приостановить клеток в свободной от сыворотки среде RPMI среде (50 мл со стадии 1.3) , чтобы получить клеточную концентрацию 10 х 10 6 клеток / мл.
  2. Передача клеток в 5 мл полистирола трубки и выделить 100 мкл аликвоты спленоцитов чистоты оценки / сравнения в конце стадии очистки.
  3. Добавить нормальной крысиной сыворотки к клеточной суспензии при концентрации 50 мкл / мл с последующим Т клеток изоляции антитела коктейль (50 мкл / мл).
  4. Смешайте суспензии клеток и дайте ему отдохнуть в течение 10 мин. Этот шаг позволяет смесь антител связывать все нежелательные клетки.
  5. Добавьте стрептавидином быстрые сферы (магнитIC гранулы), в течение 2,5 мин, а затем довести объем до 2,5 мл с использованием бессывороточной среды.
  6. Поместите пробирку в изолятор магнита в течение 3 мин.
  7. Перенесите клеточную суспензию Т в новую пробирку из полистирола, держа магнит и изливая решение в один ход.
    Примечание: Выделенную суспензия содержит очищенные Т-клетки. Все нежелательные клетки удерживаются на стороне трубки, связанной с магнитными стрептавидином бусин.
  8. Количество выделенных Т - клеток с использованием трипанового синего и гемоцитометра.
    Примечание: На этом этапе чистота выделенных Т - клеток может быть проверено ( по желанию), анализируя процент CD3 + событий до и после выделения Т - клеток с помощью проточной цитометрии. 13
    1. В кратком изложении, центрифуга 1 мл клеточной суспензии спленоцитов при 500 х г. Жидкость над осадком сливают и суспендирования клеток в проточной цитометрии буфере при концентрации 1 × 10 6 клеток / мл.
    2. Добавить флуоресцентно меченого анти-МОДе CD3-антитело в концентрации 1: 100. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 30 мин. Мыть один раз, центрифугу и вновь приостановить в проточной цитометрии буфере (400 мкл) дл анализа методом проточной цитометрии.

4. Выделение В-клеток из клеточной суспензии спленоцитов

  1. Следуйте за один и тот же протокол , как описано для Т - клеток (шаги 3,1-3,8) , но с использованием набора для выделения В-клеток. Для оценки степени чистоты, использовать CD19 антитело вместо антитела CD3. 13
    1. Для оценки степени чистоты (по желанию), используйте антитело CD19 вместо антитела CD3. Центрифуга 1 мл клеточной суспензии спленоцитов при 500 х г. Жидкость над осадком сливают и суспендирования клеток в проточной цитометрии буфере при концентрации 1 × 10 6 клеток / мл.
    2. Добавить флуоресцентной меченый анти-CD19 антитела мыши в концентрации 1: 100 и инкубировали при 4 ° С в течение 30 мин. Вымойте один раз, центрифугу и вновь приостановить поток-цитометрии буфере (400 мкл) FoАнализ г методом проточной цитометрии.

5. Активация Т-клеток и индукции экспрессии GFP

  1. Семенной Т - клетки, в виде суспензии, в круглым дном 96-луночного планшета при концентрации 2,5 х 10 5 клеток / лунку.
  2. Добавить рекомбинантный интерлейкин (IL) -7 на 2 нг / мл и CD3 / CD28 магнитных шариков (25 мкл / 10 6 клеток). Держите часть Т-клеток, не обработанных бусинок, чтобы служить в качестве отрицательного контроля для последующих измерений, представляющих неактивированных Т-клеток.
  3. Через двенадцать часов, урожай Т-клетки из 96-луночного планшета, осторожно пипеткой клеточной суспензии в каждую лунку вверх и вниз, чтобы разорвать любые шарик-клеточный комплекс / агрегатов. Сбор суспензии из всех лунок в полистирола пробирку 5 мл.
  4. Поместите пробирку, содержащую суспензию внутри той же изоляции клеток магнит, используемый ранее для очистки Т или В-клеток и дайте ему отдохнуть в течение 5 мин.
  5. Передача клеточной суспензии T Intоа новый полистирол трубки, держа магнит и изливая решение в один ход.
  6. Центрифуга клетки при 500 мкг в течение 5 мин. Повторное приостановить клеток в свежей среде спленоцитов для получения концентрации 2 х 10 6 клеток / мл.
  7. Оценка интенсивности экспрессии GFP с помощью проточной цитометрии (опция для контроля качества) при 12 до 24 ч после стимуляции по сравнению с неактивированных Т-клеток. 12
    ПРИМЕЧАНИЕ: GFP флюоресценции присущего Nur77 GFP Т - клеток и проявляется при успешной активации TCR. 12
  8. Для оценки жизнеспособности и активации (по желанию) с помощью микроскопа, окрашивают активированные клетки с Hoechst 30 минут до анализа при концентрации 0,2 мкг / мл. Добавьте соответствующий объем клеточной суспензии к сопроводительным слайде или в лунку с плоским дном, черно-сторонний 384-луночный планшет и исследовать под флуоресцентным микроскопом, чтобы определить живые клетки. Мертвые клетки не будет сохранять ядерноеокрашивание. 14

6. Активация В-клеток и индукции экспрессии GFP

  1. С помощью культуральный флакон Т-25, вновь приостановить обособленные В - клеток в количестве 1 × 10 6 клеток / мл.
  2. Добавить антимышиного IgG / IgM (H + L) в количестве 10 мкл / мл и рекомбинантную CD40L при концентрации 200 нг / мл. Ведите часть В-клеток необработанными, чтобы служить в качестве отрицательного контроля для последующих измерений (представляющих неактивированных В-клеток).
  3. Оценка интенсивности экспрессии GFP с помощью проточной цитометрии на 12 или 24 ч после стимуляции по сравнению с неактивированных В-клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: GFP флуоресценции присуща клеткам Nur77 GFP B и проявляется при успешной активации BCR. 12
  4. Для оценки жизнеспособности и активации (по желанию) с помощью микроскопа, окрашивают активированные клетки с Hoechst 30 минут до анализа при концентрации 0,2 мкг / мл. Добавьте достаточный объем клеточной суспензиикрышка слайд или в лунку с плоским дном, черно-сторонний 384-луночный планшет и исследовать под флуоресцентным микроскопом, чтобы определить живые клетки. Мертвые клетки не будет сохранять ядерное окрашивание. 14

7. высокопроизводительный скрининг малых молекул

  1. Приготовьте суспензию клеток в 2 х 10 6 клеток / мл активированных Т - или В - клеток (магнитные шарики или антитела / CD40L) или неактивированные групп.
  2. Пластинчатые 75000 клеток / лунку в 384-луночный планшет (объем 40 мкл). Используйте плоским дном черно-сторонний 384-луночного планшета или титульного слайда микроскопа для жизнеспособности и активации оценки с помощью флуоресцентной микроскопии (необязательная стадия контроля качества до HTS) с использованием Hoechst пятно (см шаги 5.8 и 6.4 для деталей). 14
  3. Вручную или с помощью автоматизированной системы, добавьте препаратами выбора (растворенного в 0,5% ДМСО) в каждую лунку.
  4. Добавить транспортное средство (ДМСО) к положительному (активации) и отрицательной (не-ACTiстар.кон.п) контрольные лунки. Регулировка концентрации ДМСО до максимум 0,5%.
  5. Инкубируйте пластин в течение 24 ч (или инкубирования время выбора) при 37 ° С и 5% CO 2.
  6. В день скрининга, разбавить Hoechst 33342 раствор морилки (1:. 3333; в течение , например 10 мкл к клеткам в 384-луночные планшеты для генерации общего объема до 50 мкл). Пятно 30 мин перед анализом GFP добавлением раствора Hoechst для достижения концентрации 0,2 мкг / мл.
  7. Аккуратно пипетки клетки вверх и вниз, чтобы получить равномерное распределение в каждую лунку.
    Примечание: Этот шаг важен в случае дозирования препаратов (этап 7.3) с помощью автоматизированной системы, так как клетки, как правило, накапливаются на одной стороне скважины, противоположном направлению потока.
  8. Спин пластины при 45 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре.
  9. Оставьте пластин на отдых в течение 15 мин при комнатной температуре.
  10. Выполните пластины (ы) для чтения аутов, используя автоматизированные конфокальной высокое содержание Screрение (HCS) система. 15 Загрузите пластину к машине. Установите цель на 40х или большем увеличении. Используйте камеру # 4 для Hoechst (УФ-лампа) и камеры # 1 для GFP (лазер 488). Настройка машины для чтения 6-10 полей на лунку. Отрегулируйте машину, чтобы сделать два последовательных чтений в поле зрения при 488 нм (для чтения GFP) и УФ-излучения (читать Hoechst). Установите цель на 40х или большем увеличении.
    Примечание: Система представляет собой компьютеризированную микроскоп, который не требует каких-либо корректировок. Фокусное расстояние, интенсивность падающего света и времени экспозиции все установки автоматически машиной.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дизайн анализа HTS

Два важных фактора были приняты во внимание при разработке флуоресцентного анализа в настоящем документе. Во- первых, нам нужно повторить физиологического состояния , в котором активация клеток Т- или В будет представлять собой недугом (например , трансплантат против хозяина заболевания). Во-вторых, оценка клеточной активации должна быть выполнена с использованием чувствительного и количественного мето...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует несколько способов чтения из эксплуатировались для развития чувствительных и надежных HTS анализов. К ним относятся колориметрический, люминесцентный или флуоресцентные методы. Хотя колориметрические методы просты в настройке, они требуют несколько добавок химических веществ, которые могут препятствовать или нарушать работу клетки проходят испытания. 23 Кроме того, они не позволяют динамической оценки биологической реакции , как фармакологический эффект оценивается в определенной конеч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Merck Frosst Start-Up средства, предоставленные Университета Монреаля. Мы хотели бы поблагодарить Докторов Жан Дюшен и Доминик Salois с высокой пропускной способностью платформы в Институте исследований в области иммунологии и рака для их обсуждения, комментарии и отзывы. Moutih Рафеи держит Fonds де-ла-Recherche ан Sante Квебека Младший 1 премии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
мышей Nur77GFPЛабораторнаямышиная линия Джексона No 016617В нашем животноводческом хозяйстве была создана собственная колония 
96 лунок-U культуральных планшетов, стерильныхVWR International10062-902Активация Т-клеток с использованием магнитных шариков
70 & микро; m клеточный фильтр, стерильныйCorning Inc.352350Производство клеточной суспензии спленоцитов
5 мл полистирол круглодонные пробирки, стерильныеCorning Inc.352058Генерация клеточной суспензии спленоцитов
50 мл полипропиленовая коническая нижняя пробирка, стерильнаяVWR International89039-656 Генерация суспензии клеток спленоцитов
Шприц 10 мл без иглы, стерильныйBecton, Dickinson and Company305482Для разминания селезенки
Т-25 культуральная колбаGreiner Bio-One690 175Для включения В-клеток во время активации
5 мл чашка для клеточной культуры, стерильнаяGreiner Bio-One627 160Для разминания селезенки
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)WISENT Inc.450-200-ЭЛ   Компонент среды спленоцитов
RPMI 1600 с бикарбонатом натрия и L-глутаминомWISENT Inc.350-002-CL Компонент среды спленоцитов
MEM заменимые аминокислотыWISENT Inc.321-010-ЭЛ Компонент среды спленоцитов
HEPES свободная кислота 1 м WISENTInc.330-050-ЭЛ Компонент среды спленоцитов
Раствор пирувата натрия (100 мМ)WISENT Inc.600-110-ЭЛ Компонент среды спленоцитов
Фетальная бычья сыворотка (FBS) WISENT Inc.080-910 Компонент среды спленоцитов и буфера проточной цитометрии
Фосфатно-солевой буфер (PBS)WISENT Inc.311-010-CLКомпонент буфера проточной цитометрии
2-меркаптоэтанол (55 мМ)Thermo Fisher Scientific21985-023Компонент среды спленоцитов
Набор для выделения Т-клеток StemcellTechnologies19851Для выделения Т-клеток
Набор для выделения В-клетокStemcell Technologies19854Для выделения В-клеток
мышиный Т-активатор CD3/CD28 суперпарамагнитный бусиныThermo Fisher Scientific11452DДля активации Т-клеток 
Магнит для изоляции клетокStemcell Technologies18000Для выделения Т-клеток и удаления магнитных шариков 
AffiniPure F(ab')2 Фрагмент козьего антимышиного IgG + IgM (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.115-006-068Для стимуляции В-клеток
рекомбинантный мышиный IL-7Peprotech217-17 Для поддержки выживания Т-клеток во время активации
Рекомбинантный CD40LR& D Systems8230-CL/CFДля стимуляции В-клеток
Антимышиное антитело CD3BD Pharmingen561799Для окрашивания Т-клеток для проточной цитометрии
Антитело к мышиному CD19BD Pharmingen553786Для окрашивания В-клеток для проточной цитометрии
Biomek FXpPerkinElmer Inc.A31842Для повторной суспензии клеток после 24-часовой инкубации
Opera Phenix High Content Screening SystemPerkinElmer Inc.HH14000000Для анализа сигнала GFP/Hoechst

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
  3. Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
  4. Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
  5. Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
  6. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
  7. Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
  8. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  9. Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
  10. Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
  11. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
  12. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  13. Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
  14. Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  16. An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
  17. Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
  18. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
  19. Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
  20. Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735(2013).
  21. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
  22. Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
  23. Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
  24. Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
  25. Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
  26. Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
  27. Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

T Cell IsolationB Cell IsolationNur77 GFP MouseMagnetic Bead SeparationGFP Expression AnalysisSmall Molecule ScreeningImmunomodulatory Compound IdentificationCell Culture Incubation

Похожие статьи