Мы представляем в настоящем исследовании нового флуоресцентного анализа на основе с использованием лимфоцитов, полученных из трансгенной мыши. Этот тест предназначен для высокопроизводительного скрининга (HTS) малых молекул, обладающих мощностью либо ингибирования или содействия активации лимфоцитов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Высокопроизводительный скрининг (HTS) в настоящее время является основой для идентификации химических соединений, способных модулировать биохимические реакции или клеточные процессы. С развитием биотехнологий и высокой поступательной потенциала малых молекул, ряд инновационных подходов в разработке лекарств развились, что объясняет возрождающийся интерес к использованию HTS. Поле онкология в настоящее время наиболее активные исследования области для скрининга лекарственных средств, без большой прорыв сделал для выявления новых иммуномодулирующих соединений, ориентированных на трансплантацию осложнений, связанных или аутоиммунных заболеваний. Здесь мы представляем роман в пробирке мышиного флуоресцентного на основе анализа лимфоцитов легко адаптирован для идентификации новых иммуномодулирующих соединений. В этом анализе используют Т- или В клетки, полученные из трансгенной мыши, в которой промотор Nur77 управляет экспрессией GFP при t- или стимуляции рецептора В-клеток. Как отражает интенсивность GFPактивация / транскрипционной активности клетки-мишени, наш анализ определяет новый инструмент для изучения влияния данного соединения (ов) на клеточных / биологических реакций. Например, первичный скрининг проводили с использованием 4,398 соединений в отсутствие "целевой гипотезы", что привело к идентификации 160 потенциальных хитов, отображающих иммуномодулирующей активностью. Таким образом, использование данного анализа является подходящим для программ поиска новых лекарственных препаратов, исследующих больших химических библиотек до дальнейших исследований в пробирке / в естественных условиях проверки.
Введение
Высокая пропускная способность скрининга (HTS) является проверенным стратегия широко применяется для идентификации новых терапевтических молекул или репозиционирования FDA утвержденных препаратов в новых медицинских показаний. 1 До сих пор достигнутый успех HTS может быть измерена множеством ранее обнаруженных наркотиков. Например, ингибитор тирозинкиназы лапатиниба, используемый для лечения рака молочной железы, ситаглиптином; дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4) ингибитор используют в качестве анти-гипергликемии препарата, и пероральный BCR-ABL ингибитор тирозинкиназы дазатиниб используется для лечения хронического миелолейкоза представляют несколь....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все протоколы животных были одобрены Animal Care комитета Монреальского университета путем. Мыши были подвергнуты эвтаназии путем постепенного ингаляции СО 2 , пока не жизненно важных признаков не наблюдалось с последующим смещением шейных позвонков. Процедура была выполнена сертифицированным лицом, чтобы гарантировать, что животные были умерщвлены гуманным образом и в соответствии с рекомендациями Канадского совета по уходу за животными.
1. Получение спленоцитов среды и Flow-цитометрии буфера
- Выполните все шаги в соответствии с 70% этанола очищенную биологической капюшоном.
- Удалить 70 мл подогретого Roswel....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Дизайн анализа HTS
Два важных фактора были приняты во внимание при разработке флуоресцентного анализа в настоящем документе. Во- первых, нам нужно повторить физиологического состояния , в котором активация клеток Т- или В будет представлять собой недугом (например , трансплантат против хозяина заболевания). Во-вторых, оценка клеточной активации должна быть выполнена с использованием чувствительного и количественного мето.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Существует несколько способов чтения из эксплуатировались для развития чувствительных и надежных HTS анализов. К ним относятся колориметрический, люминесцентный или флуоресцентные методы. Хотя колориметрические методы просты в настройке, они требуют несколько добавок химических веществ, которые могут препятствовать или нарушать работу клетки проходят испытания. 23 Кроме того, они не позволяют динамической оценки биологической реакции , как фармакологический эффект оценивается в определенной конеч.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Merck Frosst Start-Up средства, предоставленные Университета Монреаля. Мы хотели бы поблагодарить Докторов Жан Дюшен и Доминик Salois с высокой пропускной способностью платформы в Институте исследований в области иммунологии и рака для их обсуждения, комментарии и отзывы. Moutih Рафеи держит Fonds де-ла-Recherche ан Sante Квебека Младший 1 премии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| мышей Nur77GFP | Лабораторная | мышиная линия Джексона No 016617 | В нашем животноводческом хозяйстве была создана собственная колония |
| 96 лунок-U культуральных планшетов, стерильных | VWR International | 10062-902 | Активация Т-клеток с использованием магнитных шариков |
| 70 & микро; m клеточный фильтр, стерильный | Corning Inc. | 352350 | Производство клеточной суспензии спленоцитов |
| 5 мл полистирол круглодонные пробирки, стерильные | Corning Inc. | 352058 | Генерация клеточной суспензии спленоцитов |
| 50 мл полипропиленовая коническая нижняя пробирка, стерильная | VWR International | 89039-656 | Генерация суспензии клеток спленоцитов |
| Шприц 10 мл без иглы, стерильный | Becton, Dickinson and Company | 305482 | Для разминания селезенки |
| Т-25 культуральная колба | Greiner Bio-One | 690 175 | Для включения В-клеток во время активации |
| 5 мл чашка для клеточной культуры, стерильная | Greiner Bio-One | 627 160 | Для разминания селезенки |
| Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл) | WISENT Inc. | 450-200-ЭЛ | Компонент среды спленоцитов |
| RPMI 1600 с бикарбонатом натрия и L-глутамином | WISENT Inc. | 350-002-CL | Компонент среды спленоцитов |
| MEM заменимые аминокислоты | WISENT Inc. | 321-010-ЭЛ | Компонент среды спленоцитов |
| HEPES свободная кислота 1 м WISENT | Inc. | 330-050-ЭЛ | Компонент среды спленоцитов |
| Раствор пирувата натрия (100 мМ) | WISENT Inc. | 600-110-ЭЛ | Компонент среды спленоцитов |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Компонент среды спленоцитов и буфера проточной цитометрии |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Компонент буфера проточной цитометрии |
| 2-меркаптоэтанол (55 мМ) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Компонент среды спленоцитов |
| Набор для выделения Т-клеток Stemcell | Technologies | 19851 | Для выделения Т-клеток |
| Набор для выделения В-клеток | Stemcell Technologies | 19854 | Для выделения В-клеток |
| мышиный Т-активатор CD3/CD28 суперпарамагнитный бусины | Thermo Fisher Scientific | 11452D | Для активации Т-клеток |
| Магнит для изоляции клеток | Stemcell Technologies | 18000 | Для выделения Т-клеток и удаления магнитных шариков |
| AffiniPure F(ab')2 Фрагмент козьего антимышиного IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | Для стимуляции В-клеток |
| рекомбинантный мышиный IL-7 | Peprotech | 217-17 | Для поддержки выживания Т-клеток во время активации |
| Рекомбинантный CD40L | R& D Systems | 8230-CL/CF | Для стимуляции В-клеток |
| Антимышиное антитело CD3 | BD Pharmingen | 561799 | Для окрашивания Т-клеток для проточной цитометрии |
| Антитело к мышиному CD19 | BD Pharmingen | 553786 | Для окрашивания В-клеток для проточной цитометрии |
| Biomek FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | Для повторной суспензии клеток после 24-часовой инкубации |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | Для анализа сигнала GFP/Hoechst |
Ссылки
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- Lokey, R. S.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
